摘 要：采用SSR標記技術(shù)對新疆野蘋果7個天然居群180份樣品進行了遺傳多樣性分析，旨在為新疆蘋果的雜交育種及優(yōu)良品種/品系的選育提供理論依據(jù)。13對SSR引物共擴增出119條多態(tài)性條帶，各居群內(nèi)的多態(tài)性位點比率為79.84%~92.25%；居群水平上新疆野蘋果的遺傳多樣性變化趨勢基本一致，其中新源居群的有效等位基因數(shù)（Ne）、Nei's基因多樣性（H）和Shannon信息指數(shù)（I）在7個居群中最大；種級水平上的Shannon信息指數(shù)（I）為0.551 6，居群內(nèi)為0.468 9；新疆野蘋果居群的變異主要存在于居群內(nèi)部，居群間和居群內(nèi)遺傳多樣性分別為15％和85％，說明新疆野蘋果居群的變異主要存在于居群內(nèi)部。

關(guān)鍵詞： 新疆野蘋果； 種質(zhì)資源； 遺傳多樣性； SSR

中圖分類號：Ｓ６６1．1 文獻標志碼：Ａ 文章編號：１００９－９９８０（２０12）０2－0161－０5

SSR analysis for genetic diversity of Malus sieversii from Xinjiang， China

QIN Wei1，SHA Hong2，LIU Li-qiang1，LIAO Kang1*，GENG Wen-juan1，WANG Yun1

（1College of Forest Science and Horticulture， Xinjiang Agricultural University，Urumqi，Xinjiang 830052 China； 2Economic Crop Research Institute， Xinjiang Academy of Agricultural Sciences，Urumqi，Xinjiang 830091 China）

Abstract: In order to provide theoretical basis for crossbreeding and high-quality breeding， the genetic diversity of 180 Malus sieversii individuals from 7 populations in Xinjiang was investigated using SSR markers. 119 bands were amplified by thirteen pairs of SSR primers and the polymorphic loci (P) ratio among these populations ranged from 79.84% to 92.25%. At population level， the variation trend of genetic diversity of M. sieversii was consistent. The effective number of alleles Ne， gene diversity Nei’s and Shannon’s information indexes of Xinyuan population were the higherst among the seven populations. At species level， Shannon’s information index was 0.551 6， and 0.468 9 at populations level. The genetic diversity of intro-population and inter-populations were 15% and 85% respectively， which indicated that the aberrance of M. sieversii populations mainly occurred in inter-populations.

Key words: Malus sieversii (Ldb.) Roem.； Germplasm resources； Genetic diversity； SSR

新疆野蘋果[Malus sieversii （Ldb.） Roem.] 別名塞威士蘋果、天山蘋果，維吾爾語和哈薩克語稱牙瓦阿爾馬，是第三紀殘遺植物，已被列為中國優(yōu)先保護物種名錄，并被列為國家瀕危二級保護植物。新疆野蘋果是珍貴的果樹種質(zhì)資源，具有抗寒、耐蟲、耐病和耐旱等優(yōu)良性狀。新疆野蘋果適宜做栽培蘋果的砧木，親和力強，種源豐富，已成為西北地區(qū)及其他產(chǎn)區(qū)蘋果主要砧木之一，為我國果樹生產(chǎn)做出了重要貢獻[1]。

目前，國內(nèi)外一些學(xué)者對新疆野蘋果資源遺傳多樣性做了大量研究，如李天俊等[2]通過過氧化物酶同工酶測定的結(jié)果表明，不同新疆野蘋果種群之間存在明顯的差異，同時也具有同源相似之處，同一種群之間差異不顯著。Lamboy等[3]對采自中亞哈薩克斯坦、吉爾吉斯斯坦和烏茲別克斯坦的實生苗進行同工酶分析，發(fā)現(xiàn)基因型間差異顯著。Volk等[4]采用SSR技術(shù)對來自中亞43個半近親系的591個單株進行遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)，等位基因豐度在采樣地之間差異顯著，且各采樣地均有一系列特有的等位基因。馮濤等[5]對新疆野蘋果30個實生株系香味物質(zhì)組分進行GC-MS分析，結(jié)果表明，各實生株系揮發(fā)性化合物總含量、各類揮發(fā)性化合物種類數(shù)及其含量，以及主要揮發(fā)性化合物分離比率與含量等存在廣泛的遺傳變異，參試的30個實生株系間差異明顯，遺傳多樣性極為豐富。張春雨等[6]利用SSR技術(shù)對新疆野生蘋果居群進行了遺傳結(jié)構(gòu)的研究，結(jié)果表明大部分遺傳分化是由居群內(nèi)部野生單株間差異造成的。

我們在前人研究基礎(chǔ)上以新疆野生蘋果7個天然居群180份樣品為試材，利用SSR技術(shù)深入研究了新疆蘋果種質(zhì)資源的遺傳多樣性，旨在從分子生物學(xué)的角度分析新疆蘋果不同天然居群間的親緣關(guān)系，并進一步驗證新疆野蘋果的分子遺傳特性，為新疆蘋果的雜交育種及優(yōu)良品種/品系的選育提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

材料于2009—2010年在新疆維吾爾自治區(qū)7個不同天然居群共采集180份樣品（采樣居群地理位置見圖1）。為保持采集樣本的一致性，根據(jù)天然居群的規(guī)模，按照均勻分布，隨機采樣的原則，在每個采樣點選擇20~38個樣本，單株間相距在50 m以上，具體采樣點居群地理信息見表1。具體采樣方法：對采樣樹體進行GPS定位，取新鮮幼嫩葉片5～10 g，加入 50～100 g變色硅膠，把干燥的樣本材料帶回實驗室，在室溫下保存即可。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 采用CTAB法[7]提取新疆野蘋果基因組DNA，并進行DNA樣品的濃度和純度的測定。

1.2.2 SSR引物篩選 從7個不同天然分布居群180份樣品中隨機選取6個樣本，自來源于蘋果的80對SSR引物中初步篩選出35對有產(chǎn)物、主帶明顯的引物。每個居群再隨機選取2個樣本，共計14個樣本，再從中復(fù)篩選出13對多態(tài)性較好的引物進行SSR分析。試驗的試劑：MgCl2、dNTPS、TaqDNA聚合酶、DNAmarker（100～1 500 bp）均購自北京天根科技有限公司，80對SSR引物由上海生工生物公司合成。

1.2.3 SSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化 SSR初始反應(yīng)體系參照相關(guān)類果樹的SSR-PCR的反應(yīng)體系[6，8-10]。

新疆野蘋果SSR-PCR初始15 μL反應(yīng)體系包含：10 mmo·L-1 Tris-HCl（pH 8.3），50 mmol·L-1 KCl，1.5 mmol·L-1 MgCl2，0.20 mmol·L-1 dNTPS，正反引物各為1 μmol·L-1，0.5 U·μL-1 Taq DNA聚合酶，DNA模板30 ng，ddH2O；10 μL反應(yīng)體系包含：10 mmol·L-1 Tris-HCl（pH 8.3），50 mmol·L-1 KCl，1.5 mmol·L-1 MgCl2，0.25 mmol·L-1 dNTPS，正反引物各為0.8 μmol·L-1，0.5 U·μL-1 TaqDNA聚合酶，DNA模板30 ng，ddH2O。

相應(yīng)的擴增程序為：94 ℃預(yù)變性，4 min，94 ℃變性45 s，50~59 ℃ 復(fù)性45 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與分析 對電泳中穩(wěn)定清晰的擴增片段賦值為1，無帶為0，構(gòu)建二元數(shù)據(jù)矩陣。用POPGENE version 1.32軟件分析居群遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)，利用NTSYS-PC軟件進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性

遺傳多樣性的常用度量指標為居群多態(tài)性位點、有效等位基因數(shù)（Ne）、Nei’s基因多樣性（H）與Shannon信息指數(shù)（I）等?；蚨鄻有圆粌H是衡量居群遺傳多樣性最常用的指標，同時也反映居群中等位基因的豐富度和均勻度。在新疆野蘋果7個居群中，13對引物擴增多態(tài)性位點最高為伊寧居群，檢測到119個位點，多態(tài)性位點百分率為92.25%。最低為霍城居群，檢測到103個位點，多態(tài)性位點百分率為79.84%，說明各居群內(nèi)的多態(tài)性處于較高水平按所檢測的多態(tài)位點豐富程度，5個居群的排序為：伊寧（92.25%）>新源（91.47%）>額敏（91.47%）>鞏留（90.70%）>裕民（89.15%）>托里（80.62%）>霍城（79.84%）（表2）。

從表2可知，各居群內(nèi)的有效等位基因數(shù)介于1.482 1～1.617 9，其中新源居群最高，霍城居群最低。具體排序為新源（1.617 9）>鞏留（1.599 2）>額敏（1.579 4）>裕民（1.538 8）>托里（1.532 4）>伊寧（1.505 0）>霍城（1.482 1）。Nei’s基因多樣性指數(shù)（H）分析顯示，各居群內(nèi)Nei’s基因多樣性指數(shù)變動為0.276 8～0.349 7，其中新源居群最高，霍城居群最低。7個居群的Nei’s基因多樣性指數(shù)依次排列為新源（0.349 7）>鞏留（0.343 2）>額敏（0.331 3）>裕民（0.311 6）>托里（0.303 6）>伊寧（0.298 6）>霍城（0.276 8）。Shannon信息指數(shù)（I）研究結(jié)果顯示，不同居群內(nèi)Shannon信息指數(shù)值的變化在0.411 9～0.512 9，其中新源居群最高，霍城居群最低。7個居群Shannon信息指數(shù)值的排序為新源（0.512 9）>鞏留（0.505 7）>額敏(0.490 2）>裕民（0.490 2）>伊寧（0.451 0）>托里（0.447 2）>霍城（0.411 9）。

總體來看，新源居群無論是有效等位基因數(shù)（Ne）、Nei’s基因多樣性（H）還是Shannon信息指數(shù)（I）在7個居群中都是最大值，由此可知在7個居群中新源居群的遺傳多樣性最豐富，因此在原位的種質(zhì)資源保護計劃中應(yīng)優(yōu)先考慮新源居群。此外，新疆野蘋果種級水平的Shannon信息指數(shù)（I）為0.551 6，居群內(nèi)為0.468 9，居群內(nèi)遺傳多樣性等于居群內(nèi)平均I值比種級水平I值。因此可得出：居群間和居群內(nèi)遺傳多樣性分別占總遺傳多樣性的15％和85％，居群內(nèi)遺傳多樣性大于居群間遺傳多樣性，即新疆野蘋果居群的變異主要存在于居群內(nèi)部（表2）。

2.2 遺傳分化

新疆野蘋果7個居群總基因多樣性指數(shù)（Ht）為0.374 6，各居群內(nèi)基因多樣性（Hs）為0.316 4，遺傳分化系數(shù)為0.155 3，基因流為2.719 2 （表3）?？梢娦陆疤O果居群內(nèi)和居群間均存在一定的的遺傳分化，新疆野蘋果遺傳多樣性84.47%存在于居群內(nèi)，15.53%存在于居群間，表明新疆野蘋果的遺傳變異主要來自于居群內(nèi)部，少部分來自于居群間。

2.3 居群間的遺傳相似度和遺傳距離

遺傳相似度和遺傳距離是衡量居群間物種種源變異水平的重要指標，反映居群間的遺傳分化程度和親緣關(guān)系的遠近。根據(jù)Nei（1978）遺傳相似度（I）和遺傳距離（D）無偏估計值（表4），居群的遺傳相似度在0.835 7～0.973 9，其平均值為0.910 2；居群的遺傳距離在0.026 4～0.179 5，其平均值為0.095 1。2者均表明居群間親緣關(guān)系很接近，但也存在一定的遺傳變異性，其中，裕民居群和額敏居群之間的遺傳相似度最高，它們的居群遺傳距離最?。换舫蔷尤汉屯欣锞尤褐g遺傳相似度最低，它們的居群遺傳距離最大。由此可以看出，裕民居群和額敏居群親緣關(guān)系最近，遺傳分化程度小；霍城居群和托里居群親緣關(guān)系最遠，遺傳分化程度大。

2.4 居群間遺傳關(guān)系的聚類分析

為進一步探討新疆野蘋果種內(nèi)和種間的遺傳關(guān)系，對新疆野蘋果的Nei's（1978）遺傳距離進行UPGMA聚類分析，以分層聚類平均距離0.14為閾值（圖2中虛線所示）可進一步分析居群間遺傳關(guān)系。從居群間的聚類圖顯示（圖2）：7個分布居群劃分為3個類群，其中霍城居群、新源居群和鞏留居群可聚為第1類，伊寧居群、額敏居群和裕民居群可聚為第2類，托里居群可以單獨聚為第3類?？傮w來看，所分類別中各新疆野蘋果居群間的親緣關(guān)系較近。同時，從圖中還可看出，額敏居群和裕民居群的遺傳距離最小，親緣關(guān)系近，霍城居群和托里居群遺傳距離最大，親緣關(guān)系較遠。

3 討 論

3.1 居群遺傳多樣性

居群的遺傳結(jié)構(gòu)揭示居群內(nèi)部遺傳變異的分布格局，有利于準確了解該居群的形成過程和機制[11]。通過衡量新疆野蘋果不同居群的居群多態(tài)性位點、有效等位基因數(shù)（Ne）、Nei’s基因多樣性（H）、Shannon信息指數(shù)（I）、遺傳分化系數(shù)（Gst）和基因流（Nm*）等，都可以看出新疆野蘋果無論在居群水平還是物種水平都存在豐富的遺傳多樣性。與前人研究既有相同之處又存在一定差異，如在居群水平研究顯示，新疆野蘋果居群的變異主要存在于居群內(nèi)部，此結(jié)論與前人研究結(jié)果基本一致；而新疆野蘋果的遺傳多樣性以新源居群最高，霍城居群最小，此結(jié)果與張春雨等[6]認為的鞏留居群遺傳多樣性水平最高，而新源次之的結(jié)論不同，其主要原因素可能與取樣居群的具體地點和采樣量有關(guān)。而分析新疆野蘋果在物種水平物種水平和居群水平具有較高的遺傳多樣性原因認為，新疆野蘋果作為一個自然的植物群落，長期以來主要依靠種子實生繁殖等一套固有的繁育體系來維持種群的繁衍和遺傳平衡，它是造成新疆野蘋果遺傳多樣性豐富的主要因素；其次是新疆野蘋果根蘗繁殖對遺傳多樣性水平具有一定的維系作用。然而，近年來人類活動對新疆野蘋果原生境干擾嚴重，造成新疆野蘋果資源量急劇下降，部分優(yōu)良遺傳性狀已流失，因此新疆野蘋果資源保護和利用迫在眉睫。

3.2 居群的遺傳變異與分化

由本研究中新疆野蘋果遺傳分化系數(shù)Gst為0.155 3分析可知，新疆野蘋果的84.5%的遺傳變異存在于居群內(nèi)部，15.5%的遺傳變異存在于居群之間，此研究結(jié)果與Lamboy、Volk、張春雨等[3-4，6]試驗結(jié)論相符。根據(jù)Wright[12]對遺傳分化系數(shù)的大小與分化程度的關(guān)系的規(guī)定，遺傳分化系數(shù)介于0～0.05之間說明居群遺傳分化很弱，介于0.05～0.15之間說明居群遺傳分化中等，介于0.15～0.25之間居群遺傳分化較大，大于0.25表明居群遺傳分化極大。本研究中新疆野蘋果居群的遺傳分化系數(shù)均大于0.15，說明新疆野蘋果居群的遺傳分化較大。

基因流強弱對居群遺傳分化具有重要影響。Loveless等[13]認為居群間基因流大于1，能發(fā)揮其均質(zhì)化作用；小于1就不足以抵制居群內(nèi)因遺傳漂變而引起居群間遺傳分化。新疆野蘋果居群的Nm為2.719 2，遠遠大于1，則說明新疆野蘋果的基因流傳授無阻礙，新疆野蘋果居群間存在適當(dāng)?shù)幕蚪涣鳌＞尤洪g的基因流主要是由花粉或種子攜帶外來基因產(chǎn)生的[12]，而新疆野蘋果是種子還是花粉影響基因交流，有待進一步研究探討。

4 結(jié) 論

利用SSR標記技術(shù)對新疆野蘋果居群進行了遺傳多樣性分析，可以得出以下幾個結(jié)論： 1）從80對SSR引物中篩選出13對多態(tài)性明顯引物用于PCR擴增，共檢測出119個多肽位點，占92.25%。2）新疆新源居群有效等位基因數(shù)（Ne = 1.617 9）、Nei’s基因多樣性（H = 0.349 7）還是Shannon信息指數(shù)（I = 0.512 9）在7個居群中最大。3）新疆野蘋果居群的變異主要存在于居群內(nèi)部，居群內(nèi)的遺傳多樣性（85％）大于居群間的遺傳多樣性（15％）。4）裕民居群和額敏居群親緣關(guān)系最近，霍城居群和托里居群親緣關(guān)系最遠。

參考文獻 References:

[1] CHENG Ke-wu，ZHOU Xiao-fang，ZANG Run-guo，ZHANG Wei-yin. Study on the measures of conserving Malus sieversii resources in Xinjiang[J]. Arid Zone Research，2008，25（6）: 760-765.

成克武，周曉芳，臧潤國，張煒銀. 新疆野蘋果資源保護對策探討[J]. 干旱區(qū)研究，2008，25（6）: 760-765.

[2] LI Tian-jun，HU Zhong-hui，WANG Li. Primary studies on genetic diversity of the pox isoenzyme banding patterns of Xinjiang wild apple[Malus sieversii （Lebed.）Roem.][J]. Agricultural Sciences in Tianjin， 2003，9 （3）: 27-29.

李天俊，胡忠惠，王麗. 利用過氧化物酶同工酶測定新疆野蘋果多態(tài)性試驗簡報[J]. 天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003，9（3）: 27-29.

[3] LAMBOY W F， YU J， FORSLINE P L， WEEDEN N F.Partitioning of allozyme diversity in wild populations of Malus sieversii L. and implications for germplasm collection[J]. Journal of the AmericanSociety for Horticultural Science，1996，121: 982-987.

[4] VOLK M G， RICHARDS M C，REILLEY A A，HENK D A. Ex situ conservation of vegetatively propagated species: Development of a seed-based core collection for Malus sieversii[J]. Journal of the American Society for Horticultural Science，2005，130: 203-210.

[5] FENG Tao，CHEN Xue-sen，ZHANG Yan-min，HE Tian-ming，ZHANG Chun-yu，WANG Li-ping，LIU Yang-min. Comparison study of volatileconstituents in Malus sieversii （Ldb. ） Roem. and in Malus domestica Borkh[J]. Acta Horticulturae Sinica，2006， 33 （6）:1295-1298.

馮濤，陳學(xué)森，張艷敏，何天明，張春雨，王利平，劉楊岷. 新疆野蘋果與栽培蘋果香氣成分的比較[J]. 園藝學(xué)報，2006， 33 （6）:1295-1298.

[6] ZHANG Chun-yu，CHEN Xue-sen，HE Tian-ming，LIU Xiao-li，F(xiàn)ENG Tao，YUAN Zhao-he. Genetic structure of Malus sieversii population from Xinjing， China， revealed by SSR markers[J]. Journal of Genetics and Genomics， 2007，34（10）: 947- 955.

張春雨， 陳學(xué)森，何天明，劉曉麗，馮濤，苑兆和. 中國新疆野蘋果[Malus sieversii （Lebed.） Roem.]群體遺傳結(jié)構(gòu)的SSR分析[J].遺傳學(xué)報，2007，34（10）: 947-955.

[7] ZENG Bin，LUO Shu-ping，LI Jiang． Preparation of DNA from silica-Gel -Dried leaves of Amygdalus ledebouriana Schlecht. and constructionof reaction system for SSR[J]． Nonwood Forest Research，2009，27（1）: 1-6.

曾斌，羅淑萍，李疆． 硅膠干燥野扁桃葉片制備DNA樣品及其SSR反應(yīng)體系的建立[J]． 經(jīng)濟林研究，2009，27（1）: 1-6.

[8] XU Xing-xing，LIANG Hai-yong，ZHEN Zhi-xian，YANG Min-sheng. Establishment of SSR analysis system in apple[J]. Journal of Fruit Science，2006，23（2）: 161-164.

徐興興，梁海永，甄志先，楊敏生. 蘋果SSR反應(yīng)體系的建立[J].果樹學(xué)報，2006，23（2）: 161-164.

[9] GAO Yuan，LIU Feng-zhi，CAO Yu-fen，WANG Kun. Analysis of genetic relationship for Malus germplasm resources by SSR markers[J]. Journal of Fruit Science， 2007，23（2）: 129-134.

高源，劉風(fēng)之，曹玉芬， 王昆. 蘋果屬種質(zhì)資源親緣關(guān)系的SSR分析[J]. 果樹學(xué)報，2007，23（2）: 129-134.

[10] ZHANG Jing-guo. Genetic diversity of some Malus Hupehensis （Pamp.） Rehd. Accessions based on simple sequence repeats analysis[D]. College of Horticulture and Forestryq in Huazhong Agricultural University， 2007: 33-44.

張靖國. 湖北海棠遺傳多樣性的SSR分析[D]. 武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院，2007: 33-44.

[11] HOU Bo，XU Zheng. Relationship of the occurences and evolutions of wild-Fruit forestswith climatic factors in the Tianshan mountain[J]. Acta Botanica Boreali-occidentalia Sinica， 2005，25（11）: 2266-2271.

侯博，許正. 天山野果林的發(fā)生、演變與氣候因素的關(guān)系[J]. 西北植物學(xué)報，2005，25（11）: 2266-2271.

[12] WRIGHT S. The interpretation of population structure by F-statistics with specialregard to systems of mating[J]. Evolution，1965，19: 395-420.

[13] LOVELESS M D，HAMRICK J L. Ecological determinants of genetic structure in plant populations[J]. Annual Reviews of Ecology and Systematics，1984，15: 65-95.