祝順武,宋廣濱,徐學武,劉國鋒

[摘要]目的：通過皮下脂肪注射移植，探索移植脂肪對皮膚質(zhì)地的改善作用。方法：取30只裸鼠，隨機分成三組，所有鼠左側皮下移植人脂肪細胞，在另一側10只注射硅凝膠，10僅行皮下穿刺，剩下10只無任何處置，8周取皮膚組織做HE、Masson'染色觀察皮膚真皮層厚度及真皮層內(nèi)膠原蛋白的含量。結果：取材時，所有裸鼠上都能看到所移植的脂肪，但體積較術前有較明顯縮小。肉眼看，脂肪呈正常外觀，有較多新生血管生成。組織學檢測，移植脂肪外周有大量細胞外基質(zhì)形成，實驗側真皮層較對照側明顯增厚，真皮內(nèi)膠原含量增多。結論：移植的脂肪組織不僅僅是一種填充物，在改善輪廓的同時，還有真皮增厚、膠原含量增加等皮膚改善的效應。

[關鍵詞]脂肪注射移植；皮膚質(zhì)地改善

[中圖分類號]R622[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2012）01-0078-04

Study on the Improvement of skin quality after fat tissue grafting: a animal studying

ZHU Shun-wu,SONG Guang-bing,XU Xue-wu,LIU Guo-feng

(Department of Plastic Surgery,2nd Hospital of Harbin Medical University Harbin,150086, Heilongjiang,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the histologic modifications of the skin after fat tissue grafting.MethodsThirty nude mice,divided into three groups randomly,were used in the experiment.All 30 mice received human fat tissue on left side.On the opposite side,10 mice received silicone gel,10 mice received only subcutaneous tunneling,and the remaining 10 mice received nothing (negative control group). Eight weeks later, biopsies of the skin and ubcutaneous tissue were performed and specimens were analyzed by hematoxylin-phloxin-saffron and Masson' staining. Dermis thickness was measured.ResultsFat tissue was found in all animals. Macroscopically,fat tissue presented normal aspects,with abundant peripheral neovascularization.Histologic examination showed abundant extracellular matrix around the injected human fat tissue. Dermal thickness after fat grafting was significantly greater and collagen also increased significantly.ConclusionsThis study shows that fat tissue grafting stimulates a neosynthesis of collagen fibers at the recipient site and makes the dermis thicker. The effect it presented at the grafted area was not just volume-increasing but skin quality improvement.

Key words: fat tissue grafting; skin quality improvement

目前，自體脂肪組織被公認為最好的軟組織填充材料之一，填充效果好，并發(fā)癥出現(xiàn)率低。在臨床應用中，有學者發(fā)現(xiàn)，自體脂肪組織注射移植不僅僅是一個填充物，在改善術區(qū)輪廓的同時，還有真皮增厚，真皮內(nèi)膠原含量增加等皮膚質(zhì)地改善的效應。然而，在人體做脂肪移植前后皮膚活檢是難以接受的，因此我們以祼鼠為模型設計動物實驗，在組織學上觀察和比較脂肪移植前后皮膚質(zhì)地的變化。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1 實驗動物：選用 BALB/c裸鼠30只，雌性，7周齡(北京維通利華生物有限公司)。SPF環(huán)境下飼養(yǎng)，自由取食水。

1.1.2 志愿者選擇：經(jīng)書面許可，脂肪細胞在全麻下取自兩個志愿者。志愿者體重指數(shù)應為25左右，身體健康，年齡≥18周歲，≤40周歲。

1.2.3 試劑：HE染色液、Masson 染色液、硅凝膠（由醫(yī)大二院組織工程實驗室贈送）。

1.2 方法

1.2.1 動物及注射物的準備

1.2.1.1 實驗動物分及標記：將30只祼鼠隨機分成A, B, C三個組。標記時我們采用耳缺法標記。

1.2.1.2 脂肪獲取及處理:獲取方法為Comleman法：用直徑3mm末端光滑的管，接10ml Luer Lock注射器吸出脂肪細胞。獲取后立即送往實驗室處理。3000rpm離心3min，棄上清液和底層血和碎屑，取中層純脂肪組織，分裝至1ml注射器中備用，每個志愿者所獲取的脂肪細胞用于15只祼鼠。

1.2.1.3 硅凝膠處理：同上，將硅凝膠轉(zhuǎn)移至1ml注射器中備用。

所有移植物準備完成后，將所有裝有移植物的注射器無菌包裝，置于有冰塊的保溫盒中，送往動物實驗室的操作室注射移植。

1.2.2 注射移植：所有祼鼠背部一側注射脂肪細胞，兩個志愿者的脂肪細胞各注射15只。A組祼鼠背部另一側注硅凝膠，B組另一側僅行注射針皮膚穿刺但無注射，C組無任何操作即空白組。

1.2.2.1 麻醉：2.5%戊巴比妥鈉 45mg/kg 體重腹腔注射麻醉，麻醉滿意后，先用亞甲藍在祼鼠背部擬注射的部位作標記，將祼鼠四肢展開，俯臥位平放在操作臺無菌單上。用碘伏常規(guī)消毒其背部及部分腹部，鋪四層無菌孔巾，僅暴露背部需注射部位。

1.2.2.2 注射移植：注射時用脂肪移植的專用注射針頭注射。在注射區(qū)域邊緣用剪刀剪一個約2mm小口，將脂肪移植用針頭接裝有移植物的1ml注射器，注射頭從剪開的小口進入注射區(qū)，呈扇形注射，每通道注射約0.1ml，完全進針后，邊注射邊退針。注射完后，剪開的小口用5-0無創(chuàng)傷線縫合一針。縫合后，輕輕按摩注射區(qū)，盡量使注射區(qū)域平整。

每注射完一次，將注射針頭用生理鹽水沖洗兩次，然后接下一個注射器注射移植。

1.3 移植后觀察：移植完成后，每日在同一時間點測體重。

1.4 取材：在注射后第4和第8周，將各組祼鼠各處死一半，處死時用頸椎脫臼法。用亞甲藍在所需取材的部位作標記。沿標記線，切取大小約1cm×1cm包含注射物的皮膚組織，皮膚面向下，平置于包埋盒上，再將包埋盒置于4%甲醇中固定。后將組織轉(zhuǎn)送到實驗室。

1.5 觀察指標：HE染色以測真皮厚度：取材組織塊，經(jīng)固定后，常規(guī)石蠟包埋，4μm切片，HE染色。

Masson'染色以測真皮內(nèi)膠原含量：組織固定包埋切片后，Regaud蘇木精染液、Masson 麗春紅酸性復紅液、苯胺藍分別染色。

1.6 統(tǒng)計分析：所有數(shù)據(jù)應用spss 16.0 統(tǒng)計軟件統(tǒng)計分析，應用t檢驗。

2結果

所有祼鼠，注射移植后成活良好，無一只死亡。肉眼看，注射移植脂肪成活，表面有大量毛細胞血管生成，而且，脂肪移植側血管數(shù)較對側增多，見圖1。

2.1 體重變化：穿刺組與空白組，其左側注射脂肪，右側無注射物，注射后1周左右因注射脂肪存在吸收，體重有一定的下降，兩周后裸鼠體重增長大于脂肪吸收，其體重表現(xiàn)為逐漸增加。注射凝膠組在注射3天后未見體重下降，反而增加，在注射后1周表現(xiàn)小副下降，后逐漸增加。具體數(shù)據(jù)見表1。

2.2 HE染色：細胞核藍色，胞質(zhì)，肌纖維，膠原纖維和紅細胞呈深淺不一紅色。HE染色后，組織結構層次清晰，切片示脂肪移植側不僅真皮層增厚，還可見血管數(shù)明顯增多。用IPP 6.0圖像分析軟件下測真皮的厚度（表皮至真皮下結締組織之間的距離），見圖1。經(jīng)測量，實驗組平均真皮厚度在注射后4周為（326.00±26.27）μm對照組分別為（188.03±18.53）μm、（255.75±23.2）μm、（240.26±22.57）μm。8周時真皮厚度無明顯變化。實驗組較對照組明顯增厚，統(tǒng)計得P<0.05，有統(tǒng)計學意義。其中凝膠組真皮最薄。具體見表2。

2.3 Masson'染色：膠原纖維呈藍色，胞漿、肌肉、纖維素呈紅色，胞核黑。脂肪移植側真皮內(nèi)膠原含量較對照組明顯增多，見圖3。

3討論

3.1 Coleman早于1990年就提出脂肪移植后皮膚質(zhì)地有改善。在多年脂肪移植臨床工作中，他發(fā)現(xiàn)脂肪移植后，受區(qū)不僅豐滿了，在脂肪移植第一年里，皺紋減輕，毛孔縮小，及色素沉著減少[1-2]。與Coleman一樣，在臨床脂肪移植應用中Ali Mojallal 等人發(fā)現(xiàn)，脂肪移植后，皮膚紋理、毛孔大小、皮膚柔軟度、皮膚顏色及瘢痕質(zhì)地都得到了改善，并通過動物實驗從組織學上證實[3]。而本實驗也從這方面通過動物實驗證實脂肪移植對皮膚質(zhì)地的改善。

3.2 在本實驗中，在脂肪移植后1周左右，所有鼠體重都有所下降，這可能是有兩方面的原因，一是注射的脂肪純度不能是100%的，雖然在移植前經(jīng)過離心，但還是有一定的組織液及沖洗用的生理鹽水，這部分液體在注射后短期內(nèi)定會被機體吸收；二是脂肪的吸收，這是目前脂肪移植的一個難題。但在注射大約1周后，裸鼠的體重增長量大于脂肪吸收的量，同時，脂肪的吸收量漸趨向穩(wěn)定，此時，主要表現(xiàn)為裸鼠體重逐漸增加。其中注射凝膠組，注射移植一周內(nèi)體重下降不明顯，這可能是凝膠注射后，有親水性，與體內(nèi)的組織液結合，反而增加了注射物的量。但3天后還是能表現(xiàn)出左側脂肪的吸收，體重有小副下降。

在注射移植后4周與8周取材觀察，穿刺組與空白組無明顯區(qū)別，但注射凝膠組較空白組有明顯薄，這可能是，凝膠為非生物性物質(zhì)，不可吸收，注射移植后在皮下實質(zhì)性占位，對皮膚有一個持續(xù)擴張作用，因此皮膚變薄。而真皮內(nèi)膠原含量，各對照組間無明顯區(qū)別。

3.3 但與三個對照組比較，實驗組的真皮厚度及真皮內(nèi)膠原的含量都有明顯的區(qū)別，其改善的機制，人們認為脂肪組織不僅僅是一個簡單的儲存能量的地方，而且是一個重要的內(nèi)分泌器官，除調(diào)節(jié)代謝外，在免疫、血管生成等方面都具有重要作用[4-8]。在脂肪組織中，除脂肪細胞外，包含其它細胞，如脂肪源性間充質(zhì)干細胞（ASCs）、前脂肪細胞、巨噬細胞、內(nèi)皮細胞等[6-7,9-10]，這些細胞中尤其ASCs有分泌VEGF，HGF， TGF-b，PDGF，F(xiàn)GF，SDF-1等生長因子或細胞因子作用[5-7，11-14]。而這些因子，可能在改善皮膚質(zhì)地中起重大作用：

3.3.1 增加膠原復合物：上述的多種生長因子，一方面，促進纖維母細胞增殖，從而增加了膠原復合物的分泌；另一方面，促進纖維母細胞分泌膠原復合物。這一雙重作用，真皮內(nèi)膠原復合物增多，真皮增厚[15-16]。

3.3.2 促血管增生：促進血管內(nèi)皮細胞增殖，從而使血管增生，給皮膚帶來更多的營養(yǎng)，從而改善皮膚質(zhì)地。在所有脂肪移植，或ASCs移植中，無論是肉眼觀察或是微觀組織檢查，都無一例外地觀察到了移植物周圍及內(nèi)部新生血管增多[3，12，15-19]。

3.4 其它如ASCs的多方向分化潛能作用[20-22]，一方面向脂肪細胞轉(zhuǎn)化，增加脂肪移植效果；另一方面向血管內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)化，起血管生成重用[23-26]。脂肪組織中其它如細胞前脂肪細胞、脂肪細胞、細胞外基質(zhì)、膠原蛋白生物活性片段（Matricryptins）的作用等。例如前脂肪細胞、脂肪細胞也可分泌一定的細胞因子；前脂肪細胞向脂肪細胞的轉(zhuǎn)化；細胞外基質(zhì)、Matricryptins在皮膚質(zhì)地改善中的調(diào)節(jié)作用等[6-12]。尚有待進一步研究。目前，在脂肪移植后皮膚質(zhì)地改善的機制研究中，主要是針對ASCs研究，并取得了一些進展。這可能不是某單一因素的結果，脂肪作為一個外植入物的整體，引起了機體的神經(jīng)體液反應，從而引起的一系列調(diào)節(jié)的整體效果。

3.5 這些假設，都與本實驗有相符，實驗組脂肪注射移植側有皮膚質(zhì)地改善作用，但對側，其結果都是陰性。注射凝膠，與注射脂肪一樣，有一個填充作用，但與注射脂肪不同，對皮膚質(zhì)地并無改善作用。穿刺組，與脂肪注射移植一樣，對皮膚有相同的創(chuàng)傷刺激，其陰性結果也正好說明，脂肪移植時對皮膚的穿刺刺激并不是皮膚質(zhì)地改善的主因。而空白組，隨時間的推移，其皮膚厚度并沒有增厚，說明脂肪移植側是脂肪移植起到了作用，并不是裸鼠本身的生理性增厚。

3.6 皮膚年輕化治療人類的永恒追求，從手術到各種注射美容，一直在迅速發(fā)展。本方向的研究，是臨床發(fā)現(xiàn)在實驗中的證實，雖然對于不存在凹陷性缺陷的患者用以年輕化治療的直接臨床應用上有一定的局限，但如果能進一步研究，探索出皮膚質(zhì)地改善的機制，從中得出新的皮膚年輕化治療的方法，那必將有極大的意義。

4結論

實驗顯示，自體脂肪組織在注射移植后不僅僅是一個填充物，在改善術區(qū)輪廓的同時，還有使皮內(nèi)膠原含量增加、真皮增厚等皮膚質(zhì)地改善的效應。如果能進一步研究，探索出皮膚質(zhì)地改善的機制，從中得出新的皮膚年輕化治療的方法，那必將有極大的意義。

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[收稿日期]2011-08-25 [修回日期]2011-10-23

編輯/張惠娟