王少斌 程水源 王燕 許鋒 姜德志 陳慧娟 李琳玲 程華

摘要：分別采用十六烷基三乙基溴化銨（ＣＴＡＢ）法和十二烷基磺酸鈉（ＳＤＳ）法提取板栗（Ｃａｓｔａｎｅａ ｍｏｌｌｉｓｓｉｍａ ＢＬ．）基因組ＤＮＡ，取適量ＤＮＡ進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并利用紫外可見分光光度計測定所提取的ＤＮＡ在２６０和２８０ ｎｍ的吸光度及其比值，利用Ｅｃｏ ＲⅠ和ＭｓｅⅠ雙酶切后進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增長度多態(tài)性（ＡＦＬＰ）分析。結(jié)果表明，兩種方法均能從板栗中提取出一定質(zhì)量的、比較完整的、純度比較高的ＤＮＡ，ＳＤＳ法提取的板栗ＤＮＡ的純度更高、質(zhì)量更好。

關(guān)鍵詞：板栗（Ｃａｓｔａｎｅａ ｍｏｌｌｉｓｓｉｍａ ＢＬ．）；DNA提取；十六烷基三乙基溴化銨（ＣＴＡＢ）法；十二烷基磺酸鈉（ＳＤＳ）法；隨機(jī)擴(kuò)增長度多態(tài)性（ＡＦＬＰ）

中圖分類號：Ｑ５０３文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）14－3101-03

Comparison of CTAB and SDS Methods for DNA Extracion of Chestnut

ＷＡＮＧ Ｓｈａｏ－ｂｉｎ１，ＣＨＥＮＧ Ｓｈｕｉ－ｙｕａｎ２，３，ＷＡＮＧ Ｙａｎ２，ＸＵ Ｆｅｎｇ１，ＪＩＡＮＧ Ｄｅ－ｚｈｉ１，２，ＣＨＥＮ Ｈｕｉ－ｊｕａｎ１，

ＬＩ Ｌｉｎ-ｌｉｎｇ２，３，ＣＨＥＮＧ Ｈｕａ２，３

（１． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｇａｒｄｅｎｉｎｇ， Ｙａｎｇｔｚｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｊｉｎｇｚｈｏｕ ４３４０２５， Ｈｕｂｅｉ， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｈｕｂｅｉ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ of Ｅｃｏｎｏｍｉｃ Ｆｏｒｅｓｔ Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ａｎｄ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ， Ｈｕａｎｇｇａｎｇ ４３８０００， Ｈｕｂｅｉ， Ｃｈｉｎａ； ３． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｈｕａｎｇｇａｎｇ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｈｕａｎｇｇａｎｇ ４３８０００， Ｈｕｂｅｉ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｏｆ ｃｈｅｓｔｎｕｔ（Ｃａｓｔａｎｅａ ｍｏｌｌｉｓｓｉｍａ ＢＬ．） ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ＳＤＳ ｍｅｔｈｏｄ． Ｔｈｅ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｗａｓ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎｄ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ， ａｎｄ ｔｈｅｎ ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ ＥｃｏＲⅠ ａｎｄ ＭｓｅⅠ ｆｏｒ ＡＦＬＰ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ｂｏｔｈ ｍｅｔｈｏｄｓ ｗａｓ ｗｉｔｈ ｇｏｏｄ ｑｕａｌｉｔｙ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｐｕｒｉｔｙ ｗｈｉｌｅ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ＳＤＳ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ with ｈｉｇｈｅｒ ｑｕａｌｉｔｙ ａｎｄ ｐｕｒｉｔｙ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｃａｓｔａｎｅａ ｍｏｌｌｏｓｓｉｍａ ＢＬ．； DNA extraction； ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ； ＳＤＳ ｍｅｔｈｏｄ； ＡＦＬＰ

板栗（Ｃａｓｔａｎｅａ ｍｏｌｌｉｓｓｉｍａ ＢＬ．）是殼斗科栗屬落葉喬木，是一種重要的園藝作物，其經(jīng)濟(jì)栽培價值高［1］。迄今為止，人們對板栗的研究很多，但多集中于板栗的種植、病蟲害防治及板栗殼的利用等方面，而對板栗基因組ＤＮＡ的研究相對較少。基因組ＤＮＡ的提取及ＤＮＡ分子標(biāo)記的應(yīng)用是構(gòu)建基因文庫和遺傳圖庫等分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)［２－４］。由于板栗富含酚類、糖類、脂肪、色素以及單寧等次生代謝物，給獲得板栗基因組ＤＮＡ帶來了較大困難，提取高質(zhì)量ＤＮＡ更加不易。此外，傳統(tǒng)方法提取的ＤＮＡ得率低、純度低，難以進(jìn)行酶切及ＰＣＲ擴(kuò)增，進(jìn)而影響隨機(jī)擴(kuò)增長度多態(tài)性（ＡＦＬＰ）等技術(shù)在板栗上的應(yīng)用。采用十六烷基三乙基溴化銨（ＣＴＡＢ）法和十二烷基磺酸鈉（ＳＤＳ）法分離板栗基因組ＤＮＡ，通過比較這兩種方法提取的ＤＮＡ的質(zhì)量，以期優(yōu)化板栗高質(zhì)量ＤＮＡ模板提取的方法，旨在為板栗的分子水平研究打下基礎(chǔ)。

１材料與方法

１．１材料

板栗果實(shí)取自于羅田縣勝利鎮(zhèn)板栗試驗基地，品種為“羅田烏殼栗”。將果實(shí)用液氮速凍后放入

－８０ ℃低溫冰箱里保存過夜，然后撕去外殼及內(nèi)皮層以外部分，分離果肉，將其剪碎，加液氮研磨。

１．２方法

１．２．１ＤＮＡ的提取方法

１）ＣＴＡＢ法。參照Ｌｏｈ等［５］的方法并加以改良來提取板栗的基因組ＤＮＡ，具體步驟如下：①?。?ｇ新鮮的板栗果實(shí)于液氮中研磨至粉末，迅速轉(zhuǎn)移到１０ ｍＬ離心管中；②加入４ ｍＬ于６５ ℃預(yù)熱的ＣＴＡＢ提取液（２０ ｇ／Ｌ ＣＴＡＢ、ｐＨ ７．５的１００ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ ８．０的５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、１．４ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ），于６５ ℃水?。?ｈ；③以１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１２ ｍｉｎ后，取上清液加入等體積的體積比為24∶1的氯仿、異戊醇混合液，充分混勻，于冰上靜置１０ ｍｉｎ；④以１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１２ ｍｉｎ，取上清液，加入等體積的異丙醇于－２０ ℃沉淀２０ ｍｉｎ；⑤以１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，取沉淀，用體積分?jǐn)?shù)為７５％的乙醇清洗沉淀３次，每次３０ ｍｉｎ；⑥用適量的ＴＥ緩沖液溶解ＤＮＡ，并加入５ μＬ ＲＮａｓｅＡ，于３７ ℃水?。常?ｍｉｎ消化ＲＮＡ；⑦加入等體積的體積比為24∶1的氯仿、異戊醇混合液，抽提２次；⑧用２倍體積的體積分?jǐn)?shù)為９５％的乙醇和１／１０體積的３ ｍｏｌ／Ｌ NaAc沉淀ＤＮＡ；⑨用體積分?jǐn)?shù)為７５％的乙醇清洗ＤＮＡ ３次；自然干燥后，加１００ μＬ ＴＥ緩沖液溶解ＤＮＡ。

２）ＳＤＳ法。步驟同上述ＣＴＡＢ法，僅將提取液改為ＳＤＳ提取緩沖液［ｐＨ ５．２的０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＡｃ、０．５ ｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、０．５ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、２０ ｇ／Ｌ聚乙烯基吡咯烷酮（ＰＶＰ）、１４ ｇ／Ｌ ＳＤＳ、體積分?jǐn)?shù)為０．５％的β－巰基乙醇］，提取時加入２／３體積的ｐＨ ４．８的２．５ ｍｏｌ／Ｌ ＫＡｃ，冰浴３０ ｍｉｎ。

１．２．２ＤＮＡ質(zhì)量的檢測方法①?。保?μＬ ＤＮＡ溶液用ＴＥ緩沖液稀釋至５００ μＬ，檢測ＤＮＡ樣品在２６０、２８０ ｎｍ的吸光度Ａ２６０ ｎｍ、Ａ２８０ ｎｍ。利用Ａ２６０ ｎｍ／Ａ２８０ ｎｍ評價ＤＮＡ樣品的純度。②?。?μＬ ＤＮＡ樣品，加２ μＬ溴酚藍(lán)上樣緩沖液，于０．８％瓊脂糖凝膠中電泳，用ＥＢ染色，拍照。用０．８％的瓊脂糖凝膠電泳檢測ＤＮＡ的完整性以及是否降解。③?。担埃?ｎｇ ＳＤＳ法提取的總ＤＮＡ用Ｅｃｏ ＲⅠ和Ｍｓｅ Ⅰ進(jìn)行雙酶切，采用１２．５ μＬ反應(yīng)體系：Ｅｃｏ ＲⅠ／ＭｓｅⅠ １．２５ Ｕ，５×Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ，５００ ｎｇ ＤＮＡ和ｄｄＨ２Ｏ。試驗中做了不同的酶切處理：分別在精密恒溫儀和ＰＣＲ儀上于３７ ℃酶切１、２、４、６ ｈ，然后于８０ ℃處理２０ ｍｉｎ。最后按照李勇慧等［６］的方法進(jìn)行ＡＦＬＰ標(biāo)記分析。

２結(jié)果與分析

２．１ＤＮＡ樣品的質(zhì)量分析結(jié)果

由表１和表２可知，采用ＳＤＳ法提取的ＤＮＡ的產(chǎn)率顯著高于采用ＣＴＡＢ法提取的ＤＮＡ的產(chǎn)率，通過ＣＴＡＢ法提取的ＤＮＡ的Ａ２６０ ｎｍ／Ａ２８０ ｎｍ平均值為１．６７，說明采用ＣＴＡＢ法提取的板栗ＤＮＡ含有大量雜質(zhì)，純度較低。通過ＳＤＳ法提取的ＤＮＡ的Ａ２６０ ｎｍ／Ａ２８０ ｎｍ平均值為１．８６，基本排除了酚類、多糖、蛋白質(zhì)等次生物質(zhì)的干擾，ＲＮＡ去除得干凈，獲得的ＤＮＡ溶液質(zhì)量高。采用ＳＤＳ法提取的板栗ＤＮＡ的產(chǎn)率為采用ＣＴＡＢ法提取的１．３７倍，純度也較高，獲得的模板ＤＮＡ的質(zhì)量和純度完全能夠滿足ＰＣＲ擴(kuò)增的要求。

２．２ＤＮＡ的瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果

圖１、圖２分別是采用ＳＤＳ法和ＣＴＡＢ法提取的ＤＮＡ在瓊脂糖凝膠上的電泳圖譜。由圖１可知，各個樣品均有一條單一信號強(qiáng)度的主帶，主帶清晰、完整性好、降解少，幾乎沒有彌散條帶，樣品孔不發(fā)亮。說明ＲＮＡ和蛋白質(zhì)已去除干凈，所得ＤＮＡ的質(zhì)量較高。由圖２可知，采用ＣＴＡＢ法提取的ＤＮＡ降解較多、完整性差、條帶均彌散，但仍能提取板栗果實(shí)的ＤＮＡ。

２．３雙酶切和ＡＦＬＰ分析結(jié)果

以八月紅板栗、羊毛栗、烏殼栗、中果早栗、六月苞板栗、玫瑰紅板栗、中遲栗、油栗為試驗材料，采用ＳＤＳ法提?。模危粒㈦p酶切后的ＤＮＡ樣品連接接頭后進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，然后取適量擴(kuò)增產(chǎn)物在１．５％的瓊脂糖凝膠中電泳，每個樣品均呈現(xiàn)出彌散的帶型，說明采用ＳＤＳ法提取的ＤＮＡ能被Ｅｃｏ ＲⅠ和Ｍｓｅ Ⅰ兩種限制性內(nèi)切酶完全切割，并且ＡＦＬＰ分析的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜條帶清晰、帶數(shù)多。如圖３所示，擴(kuò)增條帶信號強(qiáng)度一致性很好，條帶分布均勻，能夠得到穩(wěn)定、清晰、分辨率較高的指紋條帶，可進(jìn)行板栗的遺傳變異分析。

３討論

１）在分子水平的研究中，保證ＤＮＡ的純度很重要，也是最基本的，它直接關(guān)系到后續(xù)試驗?zāi)芊耥樌M(jìn)行。板栗果實(shí)研磨較難、耗時太長將影響ＤＮＡ的品質(zhì)，在提取之前須先碎成小塊再加液氮。板栗果實(shí)中的蛋白質(zhì)、色素、蔗糖等成分含量較高，試驗多次用氯仿提取能夠有效除去樣品中的蛋白質(zhì)，加速有機(jī)相與液相的分離，去除板栗果實(shí)中的色素、蔗糖等。試驗結(jié)果顯示ＳＤＳ比ＣＴＡＢ法更有效。采用２０ ｇ／Ｌ ＳＤＳ和體積分?jǐn)?shù)為２％的β－巰基乙醇提取后，再采用氯仿提取，所得ＤＮＡ樣品的純度高，所含蛋白質(zhì)等小分子雜質(zhì)少，符合隨機(jī)擴(kuò)增長度多態(tài)性（ＡＦＬＰ）分析的要求。沉淀時間和溫度對ＤＮＡ的產(chǎn)量和純度都有影響，試驗在－２０ ℃沉淀２０ ｍｉｎ，既使ＤＮＡ充分沉淀又保證了純度，由于ＤＮＡ是多聚陰陽離子的水溶性化合物，在沉淀時加入適量的ＮａＡｃ有助于ＤＮＡ析出并且不會變性［７］。

２）在提取過程中，需要盡量保證板栗ＤＮＡ的完整性，主要從幾個方面防止板栗ＤＮＡ的降解：①板栗果實(shí)質(zhì)地較為堅硬，研磨較難，加液氮研磨時要迅速，動作要輕柔、溫和，盡可能將它研碎；②溫育４０ ｍｉｎ時裂解還不夠充分，ＤＮＡ得率較低，溫育１ ｈ才看到ＤＮＡ絮狀沉淀，因此，對板栗而言，在樣品研得很細(xì)的前提下，至少需要１ ｈ才有足夠的ＤＮＡ產(chǎn)生；③由于板栗含有大量的色素和酚類物質(zhì)，提取的物質(zhì)容易褐化，試驗在緩沖液中加入體積分?jǐn)?shù)為２％的β－巰基乙醇和２０ ｇ／Ｌ聚乙烯基吡咯烷酮（ＰＶＰ），提取的ＤＮＡ完全為白色絮狀沉淀，沒有出現(xiàn)褐化的跡象，提取物符合后續(xù)試驗要求。而且試驗還發(fā)現(xiàn)，最終將ＤＮＡ溶于ＴＥ緩沖液中比溶于去離子水中保存的時間更長，更不易降解。

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