嚴(yán)平 李江

摘要：從實驗室保存的９株白腐真菌中篩選出１株降解玉米秸稈木質(zhì)素性能優(yōu)良的菌株ＹＪ－９－１，在第１４天時，其木質(zhì)素降解率為４１．７４％。經(jīng)ＩＴＳ－５．８S ｒＤＮＡ序列同源性及系統(tǒng)發(fā)育樹分析，初步鑒定該菌為變色栓菌（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）。對ＹＪ－９－１進行紫外微波復(fù)合誘變，獲得1株高效木質(zhì)素降解菌株３－８，并利用其對玉米秸稈中的木質(zhì)素進行降解。結(jié)果表明，在第１４天時，菌株３－８對玉米秸稈木質(zhì)素的降解率為４８．４３％，比出發(fā)菌株提高了１６．０３％。

關(guān)鍵詞：白腐真菌；木質(zhì)素降解；復(fù)合誘變

中圖分類號：Ｑ９３３文獻標(biāo)識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）14－2983-05

Screening of High Efficient Lignin-Degrading Strains by Complex Mutagenesis

ＹＡＮ Ｐｉｎｇ１，ＬＩ Ｊｉａｎｇ２

（１． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｆｏｒ Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ， Ｃｈｅｎｇｄｕ ６１００４１， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｃｈｅｎｇｄｕ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｃｈｅｎｇｄｕ ６１００４１， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｏｎｅ ｗｈｉｔｅ－ｒｏｔ ｆｕｎｇｕｓ ＹＪ－９－１ ｗｉｔｈ ｓｔｒｏｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｌｉｇｉｎ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ９ ｓｔｒａｉｎｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｏｌｉｄ ｓｔａｔｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ （ＳＳＦ）． Ａｆｔｅｒ １４ ｄａｙｓ ｏｆ ＳＳＦ， ｔｈｅ ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｒａｔｅ ｏｆ ｔｈｉｓ ｓｔｒａｉｎ ｏｎ ｌｉｇｎｉｎ ｗａｓ ４１．７４％． Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｉｔｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｎｄ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ， ＹＪ－９－１ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ ａ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ． Ｕｓｉｎｇ ＹＪ－９－１ ａｓ ｓｔａｒｔｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ， ａ ｓｔｒａｉｎ ３－８ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｌｉｇｎｉｎ ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ＵＶ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｗａｖｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ． Ｔｈｅｎ strain ３－８ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｇｒａｄｅ ｌｉｇｎｉｎ ｉｎ ｃｏｒｎ ｓｔｒａｗ ｔｈｒｏｕｇｈ ＳＳＦ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｉｔｓ ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｒａｔｅ ｏｎ ｌｉｇｎｉｎ ｒｅａｃｈｅｄ ４８．４３％ ｏｎ ｔｈｅ １４ｔｈ ｄａｙ， higher than １６．０３％ ｏｆ ＹＪ－９－１．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｗｈｉｔｅ－ｒｏｔ ｆｕｎｇｕｓ； lignin-ｄｅｇｒａｄｉｎｇ； ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ

生物質(zhì)是一種可再生并能轉(zhuǎn)化為乙醇、生物柴油等燃料的能源物質(zhì)，其中木質(zhì)纖維素作為全球儲存量最大的生物質(zhì)，是最具前景的能源物質(zhì)之一［１］。秸稈作為一種農(nóng)業(yè)廢棄物，是木質(zhì)纖維素的重要來源，在世界各地都有著豐富的儲量，僅在中國每年就有大約２億ｔ的秸稈產(chǎn)出，但大部分都被直接焚燒或者丟棄，這不僅浪費資源而且造成環(huán)境污染［２］。

木質(zhì)纖維素主要組分包括纖維素（３０％～５０％），半纖維素（１５％～３５％）和木質(zhì)素（１０％～３０％）［３］。由于這些大分子物質(zhì)的相互纏繞，木質(zhì)纖維素在自然條件下很難被降解，將它轉(zhuǎn)化為生物質(zhì)能源則需要經(jīng)過多步的處理。首先是前處理，主要去除木質(zhì)素和半纖維素，目前的處理方法有物理、化學(xué)、生物以及綜合處理法，其中，生物法由于環(huán)境友好、反應(yīng)溫和、成本低廉等優(yōu)點而備受關(guān)注。

生物法中白腐真菌是目前已知的降解木質(zhì)素性能最好的微生物［４］。國內(nèi)外學(xué)者已在這方面進行了大量的研究，但篩選出的菌株普遍存在木質(zhì)素降解率低、降解周期長等問題。如張杰等［５］篩選出1株秸稈降解白腐真菌Ｐ５，１５ ｄ后木質(zhì)素降解率為１１．４７％；Zhang等［６］篩選出1株竹基質(zhì)選擇性降解菌Ｐｅｒｅｎｎｉｐｏｒｉａ ｓｐ．，木質(zhì)素降解率只有８．６６％，而且發(fā)酵時間為４周；杜海萍［７］分離出1株糙皮側(cè)耳菌，木質(zhì)素降解率僅有１６．４１％。從實驗室已有的木質(zhì)素降解菌出發(fā)，通過紫外微波復(fù)合誘變篩選得到1株木質(zhì)素降解率較高的白腐真菌“３－８”，在發(fā)酵１４ ｄ時木質(zhì)素降解率提高到４８．４３％，該研究可為生物制漿和飼料等行業(yè)提供參考。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１菌種來源實驗室保存的９株白腐真菌。

１．１．２玉米秸稈取自成都市雙流縣，經(jīng)粉碎過４０目篩，備用。

１．１．３培養(yǎng)基ＰＤＡ固體培養(yǎng)基：去皮土豆２００.0 ｇ，葡萄糖２０.0 ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ３．０ ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２O １．５ ｇ，去離子水１ ０００ ｍＬ，瓊脂１８.0 ｇ。初篩培養(yǎng)基：ＰＤＡ固體培養(yǎng)基＋０．０１％愈創(chuàng)木酚、ＰＤＡ固體培養(yǎng)基＋０．０１％苯胺藍、氯化錳篩選平板（ＭｎＣｌ２·４Ｈ２Ｏ ０．１１５ ｇ， 瓊脂１８.0 ｇ， 去離子水１ ０００ ｍＬ）。復(fù)篩培養(yǎng)基：準(zhǔn)確稱取玉米秸稈粉５．０ ｇ，裝入２５０ ｍＬ的三角瓶，再加入９ ｍＬ去離子水。

１．２研究方法

１．２．１實驗室木質(zhì)素降解菌的篩選不同菌株經(jīng)ＰＤＡ固體培養(yǎng)基活化后，用無菌打孔器制成直徑為１ ｃｍ菌塊，接入固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，每瓶接入兩個菌塊，３０ ℃恒溫培養(yǎng)１４ ｄ后，剝?nèi)セ|(zhì)上菌皮，抽濾烘干后測定失重率和木質(zhì)素含量，計算不同菌株對玉米秸稈木質(zhì)素的降解率。

１．２．２紫外微波復(fù)合誘變

１）誘變程序。出發(fā)菌株→單孢子懸浮液的制備→紫外誘變→初篩→微波誘變→初篩→復(fù)篩→穩(wěn)定性檢驗。

２）誘變。單孢子懸浮液的制備：用無菌水洗下斜面培養(yǎng)的孢子于三角瓶中，用玻璃珠充分振蕩至孢子均勻分散，制成1×１０６個／ｍＬ的單孢子懸浮液。紫外誘變致死率曲線的制作：?。保?ｍＬ濃度為1×１０６個／ｍＬ的單孢子懸浮液于直徑為 ９ ｃｍ的平皿內(nèi)，置于紫外燈下（３０ Ｗ，距離３０ ｃｍ）分別照射２、４、６、８ ｍｉｎ。照射結(jié)束后，取不同照射時間處理的菌液各０．１ ｍＬ， 適當(dāng)稀釋后分別涂布于初篩培養(yǎng)基上，３０ ℃培養(yǎng)７ ｄ，計數(shù)活菌，然后以照射時間為橫坐標(biāo)， 致死率為縱坐標(biāo)繪制致死率曲線。微波誘變致死率曲線的制作：取經(jīng)紫外誘變篩選出的正突變菌株重新培養(yǎng)長出的孢子，制成1×１０６個/ｍＬ單孢子懸浮液，置于２０ ｍＬ厭氧管中，每管５ ｍＬ，用６００ Ｗ微波輻射１、２、３ ｍｉｎ。輻射結(jié)束后，取不同輻射時間處理的菌液各０．１ ｍＬ，適當(dāng)稀釋后分別涂布于初篩培養(yǎng)基上，３０ ℃培養(yǎng)７ ｄ，計數(shù)活菌，然后以輻射時間為橫坐標(biāo)，致死率為縱坐標(biāo)繪制致死率曲線。

１．２．３誘變菌株篩選經(jīng)過誘變后，從初篩培養(yǎng)基上挑取變色圈直徑與菌落直徑的比值大及顯色圈色澤深的菌落，然后于復(fù)篩培養(yǎng)基中進行固態(tài)發(fā)酵，測定木質(zhì)素降解率。

１．３測定方法

１．３．１ＤＮＡ提取及測序ＤＮＡ提取方法參考《分子生物學(xué)實驗指南》［８］。DNA提取成功后，以ＩＴＳ－１（５′－ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ－３′）和ＩＴＳ－４（５′－ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ－３′）為引物進行ＰＣＲ擴增（反應(yīng)條件：預(yù)變性９４ ℃、５．０ ｍｉｎ；變性９４ ℃、１．０ ｍｉｎ，復(fù)性５５ ℃、１．０ ｍｉｎ，延伸７２ ℃、１．５ ｍｉｎ，３５個循環(huán)；最終７２ ℃延伸１０．０ ｍｉｎ），回收純化后的ＰＣＲ產(chǎn)物并連接到ＰＭＤ１９－Ｔ載體上，然后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細胞內(nèi)培養(yǎng)，經(jīng)細胞裂解確定目標(biāo)片段已連接在載體上后，交由華大基因研究中心進行測序。

１．３．２系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建將測序結(jié)果提交到美國國立生物技術(shù)信息中心（ＮＣＢＩ）ＧｅｎＢａｎｋ數(shù)據(jù)庫中進行Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｂｌａｓｔ比對，選取同源性較高的１４株菌株ITS-5.8S rDNA序列用Ｂｉｏｅｄｉｔ軟件進行Ｃｌｕｓｔａｌｗ比對，用ＭＥＧＡ軟件采取鄰位相鄰法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

１．３．３秸稈失重率、木質(zhì)素降解率的計算及木質(zhì)素含量的測定

木質(zhì)素降解率=

失重率=

木質(zhì)素含量的測定參考文獻［９］采用Ｖａｎ Ｓｏｅｓｔ方法測定。

２結(jié)果與分析

２．１菌種篩選結(jié)果

經(jīng)過１４ ｄ的固態(tài)發(fā)酵，各菌株對玉米秸稈木質(zhì)素的降解情況見表１。其中ＹＪ－９－１和ＹＪ－６８Ｂ－１的木質(zhì)素降解率超過４０.00％，分別為４１．７４％和４０．３３％，ＹＪ－９－１最高，且其于秸稈上生長時，長勢較好。因此，綜合來看，ＹＪ－９－１是９株菌株中降解木質(zhì)素性能最優(yōu)良的菌株，故選取其為目標(biāo)菌株進行下一步的誘變選育。

２．２ＹＪ－９－１菌株的ＩＴＳ－５．８Ｓ ｒＤＮＡ序列分析

經(jīng)測序，ＹＪ－９－１的ＩＴＳ－５．８Ｓ ｒＤＮＡ序列片段長度為６５２ ｂｐ，序列提交ＧｅｎＢａｎｋ進行核酸序列Ｂｌａｓｔ比對。選?。保粗晖葱暂^高的菌株進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，結(jié)果如圖１所示。由圖１可知，ＹＪ－９－１與Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ T3遺傳距離最近，由此初步判定ＹＪ－９－１為變色栓菌（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）。

２．３紫外誘變時間的確定結(jié)果

按照試驗方法建立的紫外誘變致死率曲線如圖２所示。一般誘變時間長正突變率較高，同時負(fù)突變率也較高。因此，選擇存活率為２０％左右的時間即８ ｍｉｎ作為后續(xù)紫外誘變時間。將８ ｍｉｎ誘變處理的菌液涂布于含愈創(chuàng)木酚的初篩培養(yǎng)基上，表現(xiàn)好的菌株接入含苯胺藍的初篩培養(yǎng)基以及氯化錳篩選平板中再篩選，于３種初篩平板中都表現(xiàn)好的菌株，最終進入下一步的微波誘變。初篩培養(yǎng)基中愈創(chuàng)木酚的變色（變紅棕色）與漆酶的產(chǎn)生有關(guān)，漆酶產(chǎn)生越多顏色越深。苯胺藍的脫色與木質(zhì)素過氧化物酶及錳過氧化物酶的產(chǎn)生有關(guān)，木質(zhì)素過氧化物酶和錳過氧化物酶越多脫色越快，脫色圈也就越大。氯化錳的變色（變紅棕色）與錳過氧化物酶的產(chǎn)生有關(guān)，錳過氧化物酶產(chǎn)生越多顏色越深。漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶及錳過氧化物酶被公認(rèn)為是木質(zhì)素降解的關(guān)鍵酶，白腐真菌就是靠分泌這些酶來降解木質(zhì)纖維素從而獲得生存所需的碳源和能源［１０］。

誘變菌在初篩培養(yǎng)基上的表現(xiàn)好壞是通過測定變色圈直徑與菌落直徑的比值大小及觀察變色圈的深淺來判定的。２批紫外誘變后，在初篩菌株中發(fā)現(xiàn)３株菌株的變色圈直徑與菌落直徑的比值和變色圈色澤均優(yōu)于出發(fā)菌株。因此，這３株菌進入接下來的微波誘變。

２．４微波誘變時間的確定結(jié)果

按照試驗方法建立的微波誘變致死率曲線見圖２。選擇致死率為８０％左右的時間即１ ｍｉｎ作為后續(xù)微波誘變時間。紫外誘變選出的３株菌株經(jīng)過３批微波誘變后初篩，發(fā)現(xiàn)其中６株菌株的變色圈直徑與菌落直徑的比值和變色圈色澤均優(yōu)于出發(fā)菌株（表２）；并且，變色圈初篩結(jié)果還表明，該６株菌株的變色圈直徑／菌落直徑的比值明顯大于經(jīng)單一誘變的菌株，且變色圈顏色也比其他突變株更深，因此選擇它們進入固態(tài)發(fā)酵的復(fù)篩試驗。復(fù)合誘變常常具有明顯的協(xié)同誘變效果，雖然伴隨著致死率的增加（與單一誘變相比），但從中獲得某一方面遺傳特性大幅度提高的誘變菌株的可能性也大大增加。從表２中還可看出，３種初篩培養(yǎng)基中幾乎所有菌株在氯化錳篩選平板上的生長狀況都很差，菌株不僅長得慢，而且產(chǎn)生的變色圈也很小，但是，不同的菌株在氯化錳篩選平板上的表現(xiàn)還是有較為明顯的不同，如菌株３－１可以長滿整個氯化錳篩選平板，而其他菌株的菌絲圈直徑大多不超過５．０ ｃｍ。但是菌株３－１在氯化錳篩選平板上的變色圈卻小于菌株３－８。同類研究中，一般較少使用氯化錳篩選平板，但從此次的試驗結(jié)果可看出氯化錳篩選平板可以作為木質(zhì)素降解菌誘變的初篩培養(yǎng)基。

２．５玉米秸稈固態(tài)發(fā)酵進行復(fù)篩的結(jié)果

將分離出的６株白腐真菌菌株以玉米秸稈為基質(zhì)進行復(fù)篩。在３０ ℃下培養(yǎng)１４ ｄ，復(fù)篩結(jié)果見表３。由表３可知，６株菌株中，菌株３－８的木質(zhì)素降解率最高，１４ ｄ達到４８．４３％，比出發(fā)菌株提高了１6．03％。并且在接下來的穩(wěn)定性試驗中（３次重復(fù)的固態(tài)發(fā)酵），其木質(zhì)素降解率都保持在４８．００％左右。固態(tài)發(fā)酵全過程中，菌株３－８的菌絲生長均較出發(fā)菌株快，這為其高的木質(zhì)素降解率提供了前提條件，同時也表明，快的菌絲生長速度與高的木質(zhì)素降解率密切相關(guān)。其他５株菌株雖然在初篩培養(yǎng)基中表現(xiàn)較好，但在復(fù)篩時，木質(zhì)素降解率卻沒有提高，這從某種程度上說明初篩只是很粗略的篩選，不能正確體現(xiàn)誘變菌的潛力，只有當(dāng)初篩與復(fù)篩結(jié)合，才能既避免初篩的不確定性，又免去直接進入復(fù)篩的費時費力。

３結(jié)論

從實驗室保存的白腐真菌中篩選出１株木質(zhì)素降解率較高的菌株ＹＪ－９－１，在培養(yǎng)１４ ｄ時，其木質(zhì)素降解率為４１．７４％。經(jīng)ＩＴＳ－５．８Ｓ ｒＤＮＡ序列分析，初步鑒定為變色栓菌（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）。

對ＹＪ－９－１進行紫外-微波復(fù)合誘變，根據(jù)致死率曲線，紫外誘變選取致死率８０％左右的時間８ ｍｉｎ，微波誘變選取致死率８０％左右的時間１ ｍｉｎ，２批紫外誘變后初篩得到３株突變菌株，再將其進行微波誘變，初篩后得到６株突變菌株，然后對它們進行玉米秸稈固態(tài)發(fā)酵的復(fù)篩，得到1株木質(zhì)素降解率提高１6．03％的菌株３－８，１４ ｄ的固態(tài)發(fā)酵后，其木質(zhì)素降解率達到４８．４３％；在３次重復(fù)的固態(tài)發(fā)酵試驗中，穩(wěn)定性較好，木質(zhì)素降解率保持在４８．００％左右。試驗結(jié)果表明，復(fù)合誘變能將單獨誘變的效果協(xié)同起來，達到更優(yōu)的誘變效果。

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