楊強 劉金龍 鄭小江 陳瑤

摘要：目前市場上生產的蛹蟲草產品沒有統一的質量標準，影響市場對蛹蟲草產品的消費，研究結果表明，蛹蟲草菌種Ｈｚ１孢子復壯的菌株培養(yǎng)的子實體干重高于菌種Ｂ１、Ｂｚ１、Ｈ１孢子復壯的菌株培養(yǎng)的子實體干重，其液體培養(yǎng)基最優(yōu)組合為葡萄糖2０ ｇ／Ｌ、蛋白胨8 ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ １.0 ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４ ５００ ｍｇ／Ｌ。生產富硒蛹蟲草培養(yǎng)基的最優(yōu)主料為富硒大米４５ ｇ、培養(yǎng)液５５ ｍＬ，在培養(yǎng)溫度為２２ ℃、空氣相對濕度70％時蛹蟲草子實體生長最好。綜合而言，子實體培養(yǎng)最優(yōu)條件為日間溫度２2 ℃、夜間溫度１５ ℃、空氣相對濕度７０％、光照度２００ ｌｘ，并結合先用日光燈照射、待子實體長至１～２ ｃｍ時使用藍紫燈照射處理的產量最高。檢測結果顯示，蛹蟲草子實體的有效成分含量分別為硒５２．０３ ｍｇ／ｋｇ、蛋白質２７．７４％、腺苷０．０５％、多糖２．５０％、蟲草素２．６１％、氨基酸２６．９２％，尤其是所含的蟲草素具有工業(yè)提取價值。

關鍵詞：蛹蟲草；質量；產量；技術參數；優(yōu)化；生產技術

中圖分類號：Ｓ５６７．３＋５；Ｑ９３－３；Ｑ９３９．９文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）18－4069-07

Integrated Production Technology for Improving the Quality and Yield of

Cordyceps militaris

ＹＡＮＧ Ｑａｎｇ，ＬＩＵ Ｊｉｎ－ｌｏｎｇ，ＺＨＥＮＧ Ｘｉａｏ－ｊｉａｎｇ，ＣＨＥＮ Ｙａｏ

(School of Biological Science and Technology/Hubei Key Laboratory of Biological Resource Conservation and Utilization, Hubei Institute for Nationalities, Enshi 445000, Hubei, China)

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅｒｅ ｈａｓ ｎｏｔ ｂｅｅｎ ａｎｙ ｕｎｉｆｏｒｍ ｑｕａｌｉｔｙ ｓｔａｎｄａｒｄｓ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ（Ｌ．Ｆｒ） Ｌｉｎｋ ｉｎ ｍａｒｋｅｔ， ｗｈｉｃｈ ａｆｆｅｃｔ ｔｈｅ ｃｏｎｓｕｍｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｏｏｄｓ． Ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｆｒｕｉｔ ｂｏｄｙ ｄｒｙ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ Ｈｚ１ ｓｐｏｒｅ ｒｅｊｕｖｅｎａｔｉｏｎ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ Ｂ１， Ｂｚ１， Ｈ１ ｓｐｏｒｅ ｒｅｊｕｖｅｎａｔｉｏｎ ｓｔｒａｉｎｓ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｌｉｑｕｉｄ ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｇｌｕｃｏｓｅ 2０ ｇ／Ｌ， ｐｅｐｔｏｎｅ 8 ｇ／Ｌ， ＫＨ２ＰＯ４ １.0 ｇ／Ｌ， ＭｇＳＯ４ ５００ ｍｇ／Ｌ． Ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｍａｉｎ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｉｎ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｌｅｎｉｕｍ ｅｎｒｉｃｈｅｄ Ｃ． ｍｉｌｉｔａｒｉｓ ｗａｓ ｓｅｌｅｎｉｕｍ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｃｏｒｎ ４５ ｇ ＋ ｍｅｄｉｕｍ ５５ ｍＬ． Ｔｈｅ ｆａｓｔｅｓｔ ｍｙｃｅｌｉｕｍ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｕｎｄｅｒ ２２ ℃， ａｎｄ 70％ ｈｕｍｉｄｉｔｙ． Ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｆｒｕｉｔｉｎｇ ｂｏｄｙ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｏ ｇｅｔ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｙｉｅｌｄ ｗａｓ ２2 ℃ ａｔ ｄａｙｔｉｍｅ ａｎｄ １５ ℃ ａｔ ｎｉｇｈｔ， ｈｕｍｉｄｉｔｙ ７０％， illuminance ２００ ｌｘ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｌｉｇｈｔ ｆｉｒｓｔｌｙ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｂｌｕｅ－ｖｉｏｌｅｔ ｒａｙｓ ｗｈｅｎ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｆｒｕｉｔｉｎｇ ｂｏｄｙ ｗａｓ １～２ ｃｍ． Ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｓｅｌｅｎｉｕｍ， ｐｒｏｔｅｉｎ， ａｄｅｎｏｓｉｎｅ， ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ， ｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎ ａｎｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｆｒｕｉｔｉｎｇ ｂｏｄｙ ｗａｓ ５２．０３ ｍｇ／ｋｇ， ２７．７４％， ０．０５％， ２．５０％， ２．６１％ ａｎｄ ２６．９２％， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ， ａｍｏｎｇ ｗｈｉｃｈ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎ ｗａｓ ｗｉｔｈ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｖａｌｕｅ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ （Ｌ．Ｆｒ） Ｌｉｎｋ； ｑｕａｌｉｔｙ； ｙｉｅｌｄ； ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ； ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ； ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ

蛹蟲草［Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ （Ｌ．Ｆｒ） Ｌｉｎｋ］又稱為北冬蟲夏草，屬真菌界的子囊菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）肉座菌目（Ｈｙｐｏｃｒｅａｌｅｓ）麥角菌科（Ｃｌａｖｉｃｉｐｉｔａｃｅａｅ）蟲草屬［Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ（Ｆｒ．）Ｌｉｎｋ］ 真菌，與冬蟲夏草［Ｃ． ｓｉｎｅｎｓｉｓ （Ｂｅｒｋ．） Ｓａｃｃ．］為同屬異種真菌［１］，是蟲草屬的模式種；在我國的吉林、四川、河北、湖南、湖北、山西等省均有生長，美國、加拿大、意大利、日本、德國、俄羅斯等國也有分布，但在自然界的分布與產量遠比冬蟲夏草稀少。蛹蟲草藥性作用溫和，長期以來就是既可藥用又可食用的高級滋補品，并且一年四季皆可服用，對老、少、病、弱、虛者皆宜，無任何副作用［2］，市場潛力巨大。但由于野生蛹蟲草數量極少，不能滿足市場的需求，即使價格昂貴也供不應求，所以人們采用科學方法對其進行了人工培植［3－６］，也取得了成功。但人工培養(yǎng)的蛹蟲草尤其是富硒蛹蟲草，其藥用成分的含量高低不一，這對蛹蟲草的藥性發(fā)揮、滋補功效穩(wěn)定性、市場信譽產生了不良影響，反映出生產企業(yè)不僅沒有形成蛹蟲草人工生產質量化標準，而且無統一規(guī)范化的生產工藝流程［７－１０］。針對蛹蟲草生產工藝流程中影響產品質量和產量的主要問題，我們開展了系統研究，初步建立了蛹蟲草高產優(yōu)質工業(yè)化生產技術流程，現將結果報告如下。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１菌種參試的蛹蟲草菌種有４個，分別是Ｂ１（購于中國科學院微生物研究所），Ｈ１（購于華中農業(yè)大學微生物研究所），Ｂｚ１（購于湖北民族學院微生物實驗室），Ｈｚ１（購于恩施職業(yè)技術學院微生物實驗室）。菌種回來后都進行了孢子復壯［11］，成為各自的系列菌種。天然冬蟲夏草子實體購自當地的同仁堂藥店。

１．１．２培養(yǎng)基及培養(yǎng)主料原料基礎培養(yǎng)基為ＰＤＡ培養(yǎng)基（不含瓊脂），試驗原料有葡萄糖、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４、Ｎａ２ＳｅＯ３（以上為化學純）和維生素Ｂ１（ＶＢ１，醫(yī)用）、天然硒濃縮水（生物資源保護與利用湖北省重點實驗室配制）；生長培養(yǎng)的主料原料為從當地市場購買的恩施出產的含硒２．７ ｍｇ／ｋｇ的大米（恩施清水橋米）以及馬鈴薯、燕麥、蕎麥、稻谷，此外還有珍珠巖。

１．１．３儀器參試的儀器為生物資源保護與利用湖北省重點實驗室原已置備的ＬＲＨ－ＺＳＯ恒溫培養(yǎng)箱、ＤＸ－Ⅱ磁力攪拌器、ＢＴ２５Ｓ電子天平、８０－２離心機、ＰＨＳ－２５ ｐＨ計、ＬＣ－１０ ＡＴｕｐｐｌｕｓ液相色譜儀、示差析光檢測器、紫外檢測器、ＹＸＱＳＧ４６２８０手提式壓力蒸汽滅菌器、ＩＯＰ－Ⅲ無菌操作臺、格力ＫＦＲ－ＳＮ５空調、ＷＳ２０２０Ａ２溫濕度儀、烘箱、ＧＸＭＱ系列滅菌器、ＣＯ２探測儀、安捷倫HP1100氨基酸自動分析儀、鼓風機、接種儀器、移液槍、改裝電動穿孔裝置、改裝注水槍、酒精燈等，以及三角瓶、廣口玻璃瓶、聚乙烯封口塑料薄膜、耐高溫橡皮筋等耗材。

１．２方法

１．２．１碳源對培養(yǎng)基優(yōu)化的試驗設計基礎培養(yǎng)基（液體）ＰＤＡ配制：?。玻埃?ｇ馬鈴薯去皮切成薄片，加水１ ０００ ｍＬ煮沸３０ ｍｉｎ，用紗布過濾，取上清液，加入葡萄糖２０ ｇ、蛋白胨１０ ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ １ ｇ、ＭｇＳＯ４ ５００ ｍｇ、維生素Ｂ１微量［12］。將基礎培養(yǎng)基（液體）ＰＤＡ中的２０ ｇ葡萄糖成分分別換成２０ ｇ麥芽糖、１５ ｇ蔗糖、２０ ｇ可溶性淀粉，配制成３種新碳源液體培養(yǎng)基，加上基礎培養(yǎng)基（液體）ＰＤＡ，一共是４種碳源液體培養(yǎng)基。取500 ｍＬ三角瓶若干個，每個三角瓶分別裝入２５０ ｍＬ 的４種碳源液體培養(yǎng)基，用封口膜封口滅菌，分別接種蛹蟲草Ｂ１、Ｂｚ１、Ｈ１、Ｈｚ１ ４個菌種，接種量都為２５ ｍＬ，各菌種不同碳源培養(yǎng)基的處理都接５瓶，在２２ ℃、磁力攪拌器轉速１２０～１８０ ｒ／ｍｉｎ、避光培養(yǎng)條件下培養(yǎng)７２ ｈ，觀察各菌種在不同碳源培養(yǎng)基里的生長情況。７２ ｈ后過濾菌絲體，用去離子水洗滌５次，置烘箱中６０ ℃烘到恒重，冷卻后測定各菌種菌絲體干重［3］。

１．２．２氮源對培養(yǎng)基優(yōu)化的試驗設計將基礎培養(yǎng)基（液體）ＰＤＡ中的１０ ｇ蛋白胨成分分別換成５ ｇ酵母粉、５０ ｇ麥麩、３０ ｇ尿素、２０ ｇ黃豆粉，配制成４種新氮源液體培養(yǎng)基，加上基礎培養(yǎng)基（液體）ＰＤＡ，一共是５種氮源液體培養(yǎng)基。同樣用500 ｍＬ三角瓶分別裝入２５０ ｍＬ 的５種氮源液體培養(yǎng)基，封口膜封口滅菌后分別接種蛹蟲草Ｂ１、Ｂｚ１、Ｈ１、Ｈｚ１ ４個菌種，接種量也是２５ ｍＬ，各菌種不同氮源培養(yǎng)基的處理都接５瓶，在２２ ℃、磁力攪拌器轉速１２０～１８０ ｒ／ｍｉｎ、避光培養(yǎng)條件下培養(yǎng)７２ ｈ，觀察各菌種在不同氮源培養(yǎng)基里的生長情況。培養(yǎng)結束后過濾菌絲體，用去離子水洗滌５次，置烘箱中６０ ℃烘到恒重，冷卻后測定各菌種菌絲體干重［３］。

１．２．３液體培養(yǎng)基優(yōu)化Ｌ９（３４）正交試驗設計以基礎培養(yǎng)基中的葡萄糖、蛋白胨、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４作為４個因素，各因素均取３個水平，其他成分不變，設計了一個Ｌ９（３４）正交試驗［13］，蛹蟲草菌種為Ｈｚ１，詳情見表１。試驗接種量為２５ ｍＬ，在磁力攪拌器轉速１２０～１８０ ｒ／ｍｉｎ、２２ ℃條件下培養(yǎng)７２ ｈ，觀察Ｈｚ１菌絲生長情況，測定菌絲體干重，方式同上。

１．２．４最優(yōu)培養(yǎng)主料比較試驗菌種生長培養(yǎng)基分別有大米培養(yǎng)基、燕麥培養(yǎng)基、蕎麥培養(yǎng)基、萌發(fā)稻谷培養(yǎng)基、萌發(fā)蕎麥培養(yǎng)基、珍珠巖+米粉混合物培養(yǎng)基，各生長培養(yǎng)基主料的用量都為４５ ｇ，只是珍珠巖+米粉混合物培養(yǎng)基中的珍珠巖用量分別有３個，具體見表２。所有生長培養(yǎng)基都分別加入１．２．３得到的最佳液體培養(yǎng)液組合４５、５５、６５ ｍＬ；使用的蛹蟲草菌種為Ｈｚ１，接種量２５ ｍＬ，自然光照，溫度２２ ℃，培養(yǎng)５０ ｄ后測定所得子實體的干重［14］。

１．２．５蛹蟲草孢子復壯培養(yǎng)用滅菌手術解剖刀分別在蛹蟲草Ｂ１、Ｂｚ１、Ｈ１、Ｈｚ１ ４個菌種成熟的孢子部位劃一切口，取滅菌短鑷子輕輕地碰擊數次，用裝有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿（平皿）接住，使蛹蟲草孢子接種于培養(yǎng)皿內的培養(yǎng)基中，移至恒溫培養(yǎng)箱中２２ ℃復壯［15］培養(yǎng)２４ ｈ，觀察其菌落特征。隨后將以上一級菌種接種到最優(yōu)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)７２ ｈ，培養(yǎng)條件為２２ ℃、，磁力攪拌器轉速１２０～１８０ ｒ／ｍｉｎ。將二級菌種接種到最優(yōu)人工栽培培養(yǎng)基中，每組平行５０瓶，記錄轉色時間、子實體形態(tài)、子實體干重。

１．２．６培養(yǎng)基灌裝程序中滅菌控制設計及接種器具比較提前１ ｄ將生產所需數量的廣口玻璃瓶（８００ ｍＬ）進行二次清洗，分裝排列整齊。由制種室提供液體培養(yǎng)基所需的配料量，由灌裝室進行配料操作，每批生產３ ０２４瓶。滅菌流程為滅菌溫度１００ ℃、滅菌方式有高壓滅菌（３０、４５ ｍｉｎ）和間歇滅菌（３０ ｍｉｎ＋３０ ｍｉｎ）；滅菌完成后進行蛹蟲草接種。接種室在紫外滅菌１ ｈ后再等待５ ｍｉｎ才能進入接種室；接種前工作人員要用７５％的乙醇噴灑工作服，用脫脂棉蘸?。罚担サ囊掖疾潦秒p手，并檢測所有待裝瓶，觀察有無破痕、薄膜有無脫落等狀況［１６，１７］，及時處理分裝并標記、記錄。隨后用移液槍、改裝后的接種器分別進行接種，接種量１０％，接種速率有１０瓶／ｍｉｎ、２０瓶／ｍｉｎ；菌種選用Ｈｚ１，觀察記錄菌絲、子實體生長狀態(tài)，最后統計Ｈｚ１菌種子實體的系統污染率。

１．２．７溫度、空氣相對濕度對蛹蟲草４個菌種子實體培養(yǎng)管理參數研究設計對溫度、空氣相對濕度、蛹蟲草菌種進行單因素試驗［18］，溫度設置１５、１８、２０、２２、２４ ℃ ５個水平；空氣相對濕度設置６０％、６５％、７０％、７５％、８０％ ５個水平；４個蛹蟲草菌種為Ｂ１、Ｂｚ１、Ｈ１、Ｈｚ１。從單因素試驗結果中各篩選出２個最優(yōu)的水平進行３因素的Ｌ４（２３）正交試驗（表３），以篩選最適合蛹蟲草子實體生長的培養(yǎng)條件［19］。

１．２．８溫度、空氣相對濕度、光照度影響蛹蟲草Ｈｚ１菌種的子實體產量正交設計選取白天溫度、夜間溫度、空氣相對濕度、光照度４個因素，設置３水平的Ｌ９（３４）正交試驗，因素與水平組合情況見表４，以篩選最適合蛹蟲草子實體生長的培養(yǎng)條件。

１．２．９不同光源對蛹蟲草Ｈｚ１菌種子實體生長及產量的影響選取3５０瓶接種了蛹蟲草Ｈｚ１菌種的裝瓶，分別進行不同光源的處理： ①日光燈單獨照射；②紅燈單獨照射；③藍紫燈單獨照射；④先用紅燈照射，待子實體長至１～２ ｃｍ時使用藍紫燈照射；⑤先用藍紫燈照射，待子實體長至１～２ ｃｍ時使用紅燈照射；⑥先用日光燈照射，待子實體長至１～２ ｃｍ時使用藍紫燈照射；⑦先用日光燈照射，待子實體長至１～２ ｃｍ時使用紅燈照射。每處理50瓶，處理后分別進行子實體生長描述，并測定子實體干重［20］。

１．２．１０蛹蟲草Ｈｚ１菌種和天然冬蟲夏草子實體成分檢測蛹蟲草Ｈｚ１菌種和天然冬蟲夏草子實體的硒含量及礦質營養(yǎng)元素含量采用原子吸收法檢測［9］；氨基酸種類和含量采用安捷倫ＨＰ１１００氨基酸自動分析儀測定［11］；腺苷含量采用ＡＴＰ法檢測［5］；多糖含量采用硫酸苯酚法檢測［21］。蟲草素含量采用高效液相色譜儀、示差折光檢測器與紫外檢測器串聯的方法測定［5］。

２結果與分析

２．１蛹蟲草各菌種在不同碳源優(yōu)化培養(yǎng)基里的菌絲體生長情況

蛹蟲草各菌種在不同碳源優(yōu)化培養(yǎng)基里的菌絲體生長情況見表５。從表５可見，Ｂ１菌種生長最適的碳源為２０ ｇ／Ｌ葡萄糖，Ｂｚ１菌種生長最適的碳源為１５ ｇ／Ｌ蔗糖，Ｈ１菌種生長最適的碳源為２０ ｇ／Ｌ葡萄糖，Ｈｚ１菌種生長最適的碳源為２０ ｇ／Ｌ葡萄糖。４個菌種中，Ｈｚ１菌種的最高菌絲生長量最大，依次比Ｂｚ１、Ｂ１、Ｈ１最高菌絲生長量高出了4．5％、２０．９％、３２.0％。

２．２蛹蟲草各菌種在不同氮源優(yōu)化培養(yǎng)基里的菌絲體生長情況

蛹蟲草各菌種在不同氮源優(yōu)化培養(yǎng)基里的菌絲體生長情況見表６。從表６可見，Ｂ１、Ｂｚ１、Ｈ１、Ｈｚ１菌種生長最適的氮源均為１０ ｇ／Ｌ蛋白胨。４個菌種中Ｈｚ１菌種的菌絲生長量最大，依次比Ｂｚ１、Ｂ１、Ｈ１菌種的最高菌絲生長量高出了６．１％、２２．５％、３０．８％。

２．３蛹蟲草菌種Ｈｚ１液體培養(yǎng)基優(yōu)化Ｌ９（３４）正交設計試驗結果

蛹蟲草菌種Ｈｚ１液體培養(yǎng)基優(yōu)化Ｌ９（３４）正交試驗結果見表７。從表７可見，在４個試驗因素中，影響菌絲量高低的順序為：Ａ＞Ｂ＞Ｄ＞Ｃ；最優(yōu)組合為Ａ2Ｂ1Ｃ２Ｄ２。即葡萄糖2０ ｇ／Ｌ，蛋白胨8 ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４ 1.0 ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４ ５００ ｍｇ／Ｌ。

２．４蛹蟲草菌種Ｈｚ１子實體培養(yǎng)基最優(yōu)主料與培養(yǎng)液比較

６個生長培養(yǎng)基主料對蛹蟲草菌種Ｈｚ１子實體產量的影響結果見圖１。從圖１可見，生長培養(yǎng)基主料為大米４５ ｇ、培養(yǎng)液為５５ ｍＬ時，蛹蟲草子實體產量最高，達到了５．３２ ｇ／瓶，并表現出培養(yǎng)液偏少時其減產不明顯、但培養(yǎng)液偏多時減產顯著的現象，穩(wěn)產性算是最好的；生長培養(yǎng)基主料為燕麥４５ ｇ、培養(yǎng)液為５５ ｍＬ時，蛹蟲草子實體產量為５．２６ ｇ／瓶，但培養(yǎng)液減少、增多都嚴重減產，穩(wěn)產性差；生長培養(yǎng)基主料為蕎麥４５ ｇ、培養(yǎng)液為６５ ｍＬ時，蛹蟲草子實體產量并列最高，達到５．３２ ｇ／瓶，但隨著培養(yǎng)液減少出現大幅度減產；生長培養(yǎng)基主料為萌發(fā)蕎麥４５ ｇ、培養(yǎng)液為4５ ｍＬ時，蛹蟲草子實體產量為２．５０ ｇ／瓶，產量太低，無應用價值；生長培養(yǎng)基主料為萌發(fā)稻谷４５ ｇ、培養(yǎng)液為５５ ｍＬ時，蛹蟲草子實體產量為４．００ ｇ／瓶，也無應用價值；生長培養(yǎng)基主料為珍珠巖+米粉混合物４５ｇ、培養(yǎng)液為４５ｍＬ時，蛹蟲草子實體產量僅為１．０２ ｇ／瓶，在６個生長培養(yǎng)基主料中產量最低。

２．５４個蛹蟲草菌種孢子復壯培養(yǎng)結果

蛹蟲草４個菌種Ｂ１、Ｂｚ１、Ｈ１、Ｈｚ１成熟的孢子復壯培養(yǎng)結果見表８。從表８可見，用Ｈｚ１菌種孢子復壯培養(yǎng)得到的子實體不僅外形好看，而且每瓶產量比Ｂｚ１、Ｂ１、Ｈ１菌種孢子復壯培養(yǎng)得到的子實體產量依次高３．２％、２３．８％、９４．０％。反映出Ｈｚ１是４個蛹蟲草菌種子實體產量表現最好的菌種。

２．６Ｈｚ１菌種培養(yǎng)基灌裝程序中滅菌效果

蛹蟲草Ｈｚ１菌種培養(yǎng)基灌裝程序中滅菌控制比較結果見表９。從表９可見，１００ ℃滅菌３０ ｍｉｎ后冷卻、然后再用１００ ℃滅菌３０ ｍｉｎ的間歇滅菌方式效果最好，系統污染率僅為０．０８％；其次是１００ ℃滅菌４５ ｍｉｎ的高壓滅菌方式，系統污染率為０．１０％；而１００ ℃滅菌３０ ｍｉｎ的高壓滅菌方式系統污染率最高，達到了０．２０％。

２．７不同接種器具對Ｈｚ１蛹蟲草菌絲和子實體生長的影響

移液槍、改裝后的接種器對Ｈｚ１菌種子實體生長的影響結果見表１０。從表１０可見，改裝的接種器接種后，Ｈｚ１菌種的菌絲生長分布均勻，子實體形態(tài)美觀，整體品質較好；而移液槍接種后Ｈｚ１菌種的菌絲生長分布不均勻，子實體形態(tài)不一致，整體品質較差。改裝的接種器接種速度可達２０瓶／ｍｉｎ，比常規(guī)接種速度提高１倍，而且不增加系統污染率。

２．８溫度、空氣相對濕度對４個菌種子實體生長的影響

溫度對４個菌種子實體干重均值的影響結果見圖２。從圖２可見，培養(yǎng)溫度在２２ ℃時，４個菌種子實體干重的均值最大?？諝庀鄬穸葘Γ磦€菌種子實體干重均值的影響結果見圖３。從圖３可見，空氣相對濕度在７０％時，４個菌種子實體干重的均值最大。在４個菌種子實體干重方面，Ｈｚ１菌種子實體的干重最重，為４．８８ ｇ／瓶；Ｂｚ１菌種子實體的干重次之，為４．５０ ｇ／瓶；Ｂ１菌種子實體的干重為３．４２ ｇ／瓶；Ｈ１菌種子實體的干重為３．３２ ｇ／瓶。適合蛹蟲草子實體生長的Ｌ４（２３）正交試驗培養(yǎng)結果見表１１。從表１１可見，影響蛹蟲草子實體產量高低的因素排序為Ｃ＞Ａ＞Ｂ，最佳組合為Ａ２Ｂ2Ｃ２，即溫度為２２ ℃、空氣相對濕度為70％、菌種選?。龋睍r，子實體平均干重最重。

２．９溫度、空氣相對濕度、光照度影響Ｈｚ１菌種的子實體產量Ｌ９（３４）正交設計試驗結果

蛹蟲草菌種Ｈｚ１的子實體培養(yǎng)條件Ｌ９（３４）正交試驗結果見表１２。從表１２可見，影響蛹蟲草子實體產量高低的因素排序為為Ａ＞Ｄ＞Ｃ＞Ｂ，最佳組合為Ａ３Ｂ１Ｃ３Ｄ２，即蛹蟲草Ｈｚ１菌種子實體最優(yōu)培養(yǎng)條件為白天溫度２２ ℃、夜間溫度１５ ℃、空氣相對濕度７０％、光照度２００ ｌｘ。

２．１０不同光源處理對蛹蟲草Ｈｚ１菌種子實體生長的影響

不同光源對Ｈｚ１菌種子實體產量的影響結果表明，處理⑥（先用日光燈照射，待子實體長至１～２ ｃｍ時使用藍紫燈照射）的蛹蟲草子實體產量為５．３０ ｇ／瓶；處理⑦（先用日光燈照射，待子實體長至１～２ ｃｍ時使用紅燈照射）的蛹蟲草子實體產量為５．２８ ｇ／瓶；處理⑤（先用藍紫燈照射，待子實體長至１～２ ｃｍ時使用紅燈照射）的蛹蟲草子實體產量為５．２２ ｇ／瓶；處理④（先用紅燈照射，待子實體長至１～２ ｃｍ時使用藍紫燈照射）的蛹蟲草子實體產量為５．０４ ｇ／瓶；而處理③（藍紫燈單獨照射）的蛹蟲草子實體產量為４．７６ ｇ／瓶；處理②（紅燈單獨照射）的蛹蟲草子實體產量為４．４８ ｇ／瓶；處理①（日光燈單獨照射）的蛹蟲草子實體產量僅為３．２６ ｇ／瓶。說明先用日光燈照射，待子實體長至１～２ ｃｍ時使用藍紫燈照射處理的子實體產量最高，效果最好。

２．１１蛹蟲草Ｈｚ１菌種和冬蟲夏草子實體的氨基酸含量比較結果

蛹蟲草Ｈｚ１菌種和天然冬蟲夏草子實體在氨基酸含量方面的測定結果見表１３。從表１３可見，在人體必需氨基酸（賴氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸）含量［22，23］方面，蛹蟲草Ｈｚ１菌種除賴氨酸、色氨酸含量分別比天然冬蟲夏草的低１８．２%、３．３%之外，苯丙氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、亮氨酸的含量依次比天然冬蟲夏草的提高１２９．５％、１２０．９％、７３．３％、４３．８％、３８．４％、１１．１％。在人體半必需氨基酸（精氨酸、組氨酸）含量方面，蛹蟲草Ｈｚ１子實體的精氨酸、組氨酸含量分別比天然冬蟲夏草的低２８．７%、２０．０%。不過在總氨基酸含量［22］方面，蛹蟲草的總氨基酸含量比天然冬蟲夏草的總氨基酸含量高２４．８％，說明蛹蟲草的營養(yǎng)成分不亞于天然冬蟲夏草的。

２．１２蛹蟲草Ｈｚ１菌種和冬蟲夏草子實體的礦質營養(yǎng)元素比較結果

蛹蟲草Ｈｚ１菌種和天然冬蟲夏草子實體在礦質營養(yǎng)元素含量方面的測定結果見表１４。從表１４可見，蛹蟲草微量元素含量與天然冬蟲夏草相比，Ｓｅ含量提高了８６８．９％，Ｍｎ含量提高了５３．３％；但Ｎｉ含量降低了７０．４%，Ｃｕ含量降低了５９．１%，Ｚｎ含量降低了６５．８%，Ｆｅ含量降低了６１．２%。蛹蟲草大量元素含量與天然冬蟲夏草相比，Ｋ含量提高了４１４．７％，但Ｃａ含量降低了６０．３%。檢測結果顯示，本研究培養(yǎng)的蛹蟲草屬于富硒類型，這對于功能性食品的開發(fā)具有重要價值［24，25］；并且Ｃｕ是重金屬，Ｃｕ含量降低有利于人體健康［26］；而Ｎｉ是對健康有益的微量元素［27］，Ｎｉ偏低，說明將其進一步提高到天然冬蟲夏草含量的水平還需要做許多工作。

２．１３蛹蟲草Ｈｚ１菌種其他成分含量

蛹蟲草Ｈｚ１菌種子實體其他成分含量測定結果為蛋白質２７．７４％、多糖２．５０％、腺苷０．０５％、蟲草素２．６１％，。而天然冬蟲夏草的蟲草素含量為０．０１％，遠遠低于本研究培養(yǎng)的蛹蟲草Ｈｚ１菌種子實體的蟲草素含量。

３小結與討論

試驗對蛹蟲草生產工藝流程中影響產品質量和產量的主要問題進行了探討，初步建立了蛹蟲草高產優(yōu)質工業(yè)化生產技術流程。結果顯示，蛹蟲草菌種Ｈｚ１孢子復壯的菌株培養(yǎng)的子實體干重高于菌種Ｂ１、Ｂｚ１、Ｈ１孢子復壯的菌株培養(yǎng)的子實體干重，液體培養(yǎng)基最優(yōu)組合為葡萄糖2０ ｇ／Ｌ、蛋白胨8 ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ １.0 ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４ ５００ ｍｇ／Ｌ。生產富硒蛹蟲草培養(yǎng)基的最優(yōu)主料為富硒大米４５ ｇ、培養(yǎng)液５５ ｍＬ；在菌種培養(yǎng)環(huán)境為最適溫度２２ ℃、空氣相對濕度70％時，蛹蟲草菌種Ｈｚ１的子實體平均干重最大。綜合而言，子實體培養(yǎng)最優(yōu)條件為日間溫度２2 ℃、夜間溫度１５ ℃、空氣相對濕度７０％、光照度２００ ｌｘ，并結合先用日光燈照射、待子實體長至１～２ ｃｍ時使用藍紫燈照射處理的產量最高。檢測結果顯示，用本研究技術生產出來的蛹蟲草子實體的有效營養(yǎng)成分含量分別為硒５２．０３ ｍｇ／ｋｇ、蛋白質２７．７４％、氨基酸２６．９２％、腺苷０．０５％、多糖２．５０％、蟲草素２．６１％。這些參數對優(yōu)化蛹蟲草生產工藝和建立產品質量檢測體系具有重要參考價值。而且主要有效成分和營養(yǎng)成分要高于天然冬蟲夏草，尤其是所含的蟲草素具有工業(yè)提取價值［28］，證明應用本研究技術生產出來的蛹蟲草產量高、質量好，具有推廣應用價值。但在蛹蟲草的腺苷、賴氨酸、色氨酸、精氨酸、組氨酸以及Ｎｉ含量上有待進一步研究提高。

參考文獻：

［１］ 韋會平，肖波，胡開治．蛹蟲草藥用價值考［Ｊ］．中藥材，２００４，２７（３）：２１５－２１７．

［2］ 柴建萍，白興榮，謝道燕．蛹蟲草主要有效成分及其藥理功效［Ｊ］．云南農業(yè)科學，２００３（４）：２２－２３．

［3］ 謝雪欽．蛹蟲草液體產孢條件優(yōu)化及其侵染過程的初步研究［Ｄ］．福州：福建農林大學，２００７．

［4］ 李顏，史薇娜，唐慶九，等．比色法測定冬蟲夏草和蛹蟲草中多糖和甘露醇的含量［Ｊ］．食用菌學報，２００７，１４（３）：５３－５７．

［５］ 黃蘭芳，郭方遒，梁逸曾，等．ＨＰＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ測定冬蟲夏草和蠶蛹蟲草中腺苷和蟲草素含量［Ｊ］．中國中藥雜志，２００４，２９（８）：７６２－７６４．

［６］ 姚國洪，劉喜屏，劉廣紅，等．蛹蟲草菌絲生長研究［Ｊ］．微生物學雜志，２００３，２３（１）：６１－６２．

［７］ 張顯科，王玉柱，劉文霞．蛹蟲草與冬蟲夏草化學成分比較［Ｊ］．遼寧大學學報（自然科學版），１９９６，２３（４）：７９－８２．

［８］ 宋金俤，劉超．蛹蟲草產業(yè)化栽培瓶頸及其對策［Ｊ］．中國食用菌，２００９，２８（１）：６２－６４．

［９］ 張弛．富硒蟲草中硒的賦存形態(tài)及分布特點［Ｊ］．食品科學，２００９， ３０（２３）：１９３－１９５．

［１０］ 賁松彬，黃子琪，王瑩，等．蛹蟲草富硒條件優(yōu)化及硒對其中主要活性成分的影響［Ｊ］．食品科學，２００９，３０（１７）：２６６－２６９．

［１１］ 鄭婷婷，李多偉，王英娟，等．蛹蟲草液體培養(yǎng)條件優(yōu)化及有效成分含量分析［Ｊ］．菌物研究，２００４，２（４）：２２．

［１２］ 朱宏圖．人工培育蛹蟲草的研究［Ｊ］．中藥通報，１９８７，１２（１２）： ２１．

［１３］ 柴建萍，白興榮，謝道燕．蛹蟲草菌深層發(fā)酵培養(yǎng)基正交實驗［Ｊ］．云南農業(yè)科技，２００４（３）：２６．

［１４］ 朱雅紅，桂仲爭．蛹蟲草液體菌種通氣發(fā)酵培養(yǎng)及其營養(yǎng)成分分析［Ｊ］．食品與生物技術學報，２００９，２８（５）：６９９－７０４．

［１５］ 張顯科，劉文霞．不同培養(yǎng)料栽培蛹蟲草試驗研究［Ｊ］．中國食用菌，１９９７，１６（２）：２１．

［１６］ 冉翠香，王莉，許智宏．人工培育蛹蟲草子實體原基的誘發(fā)形成［Ｊ］．中國食用菌，２００１，２0（４）：９－１０．

［１７］ 汪宇，于榮敏，佟志清，等．蛹蟲草液體培養(yǎng)條件的優(yōu)化及生長動力學考察［Ｊ］．中國野生植物資源，２００３，２２（４）：５６．

［１８］ 王志高，溫魯，袁小轉，等．加硒對蛹蟲草主要活性成分含量的影響［Ｊ］． 安徽農業(yè)科學，２００７，３５（２９）：９２９３－９２９４．

［１９］ 李信，許雷，裴鑫德．蛹蟲草（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ）菌絲體液體培養(yǎng)基的優(yōu)化和發(fā)酵條件的研究［Ｊ］． 核農學報，１９９８，１２（１）：３５－４０．

［２０］ 潘新法． 蛹蟲草子實體的人工培育及超氧化物歧化酶的活性測定［Ｊ］． 食用菌學報，１９９５，２（３）：２５－２８．

［２１］ 車振明，王燕，周黎黎．人工蛹蟲草子實體多糖分離最佳工藝研究［Ｊ］．食品研究與開發(fā)，２００４，２５（５）：７８－７９．

［２２］ 劉建華，孫月，卜寧．人工培育蛹蟲草與野生蛹蟲草氨基酸成分測試分析［Ｊ］．中國食用菌，１９９９，１８（３）：１８－１９

［２３］ 孫悅迎，張旭東．冬蟲夏草與蛹蟲草特性分析［Ｊ］．中醫(yī)藥學報，２００２，３０（２）：４３－４４．

［２４］ 于田田，錢和．生物富硒對蛹蟲草菌絲體化學成分的影響［Ｊ］． 食品科技，２００６（１）：１３３－１３５．

［２５］ 鐵梅，楊淑琴，婁虹，等．硒對蛹蟲草生長發(fā)育的影響［Ｊ］． 遼寧大學學報（自然科學版），２００５，３２（１）：２５－２７．

［２６］ 周枝鳳，梁逸曾，胡蕓，等．均勻設計在蠶蛹蟲草和冬蟲夏草活性成分分析中的應用［Ｊ］．分析測試學報，２００４，２３（２）：３５－３７．

［２７］ 何淑麗，趙鳳閣．十年來蛹草的成分及藥理研究概述［Ｊ］．長春中醫(yī)學院學報，１９９７，１３（６）：６４－６５．

［２８］ 王英娟，李多偉，王義潮，等．蛹蟲草中蟲草素、蟲草多糖綜合提取工藝研究［Ｊ］． 西北植物學報，２００５，２５（９）：１８６３－１８６７．

收稿日期：２０１１－０８－２８

基金項目：湖北民族學院高校產學研合作項目（ｃｘｙ２００９Ｂ０３７）；湖北民族學院生物科學與技術學院２０１１大學生創(chuàng)新項目（ＳＫＹ２０１１４９）

作者簡介：楊強（１９８９－），男，湖北宜昌人，２００７級本科生，（電話）１５０７１８４６６４２（電子信箱）４１１０９３４５０＠ｑｑ．ｃｏｍ；通訊作者，劉金龍，高級實驗師，

主要從事野生動植物保護與利用研究工作，（電話）１３４０２７３３８１８（電子信箱）ｌｉｕｊｌ１６１８＠１６３．ｃｏｍ。