王曉燕 鄭巖 孟寶璽 夏煒 馬顯杰 王志軍

[摘要]目的：探討經(jīng)耳源靜脈移植入體內(nèi)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow-derived mesenchymal stem cells ，BM-MSCs）參與皮膚擴(kuò)張的情況。方法：以小型家豬為研究對(duì)象，分離培養(yǎng)并鑒定豬BM-MSCs。制作豬皮膚擴(kuò)張模型，8頭豬隨機(jī)分為兩組，每組4頭，實(shí)驗(yàn)組（A組）：擴(kuò)張后耳源靜脈注入DiI標(biāo)記的豬BM-MSCs；對(duì)照組（B組）：擴(kuò)張后耳源靜脈注入等量PBS，分別于擴(kuò)張后7、14、28天測(cè)量?jī)山M擴(kuò)張面積，冰凍切片觀察標(biāo)記細(xì)胞在擴(kuò)張皮膚中的比例和分布情況，Real-time PCR檢測(cè)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（SDF-1）表達(dá)情況。結(jié)果：流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞CD29、CD90表達(dá)陽(yáng)性，CD34、CD45表達(dá)陰性，細(xì)胞標(biāo)記率＞99%。擴(kuò)張后第14天、28天實(shí)驗(yàn)組擴(kuò)張面積較對(duì)照組明顯增加（P＜0.05），冰凍切片顯示，14天時(shí)實(shí)驗(yàn)組擴(kuò)張皮膚可見(jiàn)DiI標(biāo)記細(xì)胞聚集。PCR示SDF-1表達(dá)量實(shí)驗(yàn)組是對(duì)照組的5.8倍。結(jié)論：經(jīng)靜脈移植的BM-MSCs可遷移至擴(kuò)張局部，并能有效促進(jìn)皮膚擴(kuò)張。

[關(guān)鍵詞]骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；靜脈移植；皮膚擴(kuò)張

[中圖分類(lèi)號(hào)]R622Q813.1[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2012）04-0596-03

Study on the feasibility of BM-MSCs transplanted through systemic vein to improve the skin expansion

WANG Xiao-yan1,ZHENG Yan1,MENG Bao-xi2,XIA Wei1,MA Xian-jie1,WANG Zhi-jun3

（1Institutes of Plastic Surgery, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an710032, Shaanxi, China；2.Department of Plastic Surgery,The Fifst People's Hospital, Zhengzhou；3.Department of Plastic Surgery, Affiliated Xinhua Hospital of Dalian Medical College）

Abstract:ObjectiveTo investigate the feasibility of transplantation of mesenchymal stem cell from ear vein into the skin and soft tissue expansion model.Methods MSCs were isolated from porket's bone marrow and cultured in vitro. Eight pigs were randomly divided into two groups: The group A was injected with MSCs which dyed with CM-DiI from ear vein; the group B was injected with PBS from ear vein as the control group. The expansion area was measured on day7,14,28 after operation and the proportion and distribution of labeled cells were detected by frozen section . Real-time quantitative PCR was used to quantify the expression of chemotactic growth factor-1(SDF-1).Results The MSCs cultured expressed CD90 and CD29 highly but didn't express CD34 or CD45. The mark rate>99%. On day 14 and 28, the area of experimental group was increased significantly,compared to the control group (P＜0.05). The result of frozen section show that the DiI-labled cells were gathered together in the experimental group on day 14 after expansion. Real-time quantitative PCR show that the target gene expression of SDF-1 was 5.8-fold higher than the control group. Conclusion BM-MSCs transplantated from ear vein can migrate to the local of expansion and promote the skin expansion.

Key words:bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs); vein transplantation; skin expansion

皮膚擴(kuò)張術(shù)由于其良好的修復(fù)效果，成為整形外科最常用的修復(fù)手段之一。但皮膚擴(kuò)張術(shù)存在治療周期長(zhǎng)、術(shù)后皮瓣回縮的缺點(diǎn)，如何在短時(shí)間擴(kuò)張出更多新生的皮膚成為有待解決的問(wèn)題。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞由于其多項(xiàng)分化功能、活性強(qiáng)、易分離培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)成為創(chuàng)傷修復(fù)領(lǐng)域的熱點(diǎn)[1-2]，而皮膚擴(kuò)張術(shù)本質(zhì)上也是創(chuàng)傷修復(fù)的過(guò)程，因此本實(shí)驗(yàn)經(jīng)靜脈移植染色標(biāo)記后的骨髓間充干細(xì)胞于擴(kuò)張器模型，觀察其在擴(kuò)張皮膚內(nèi)的分布和比例，擬為間充質(zhì)干細(xì)胞移植促進(jìn)擴(kuò)張皮膚新生探尋一種無(wú)創(chuàng)性的移植方案。

1材料和方法

1.1 材料：Ficoll-1.077細(xì)胞分離液（天津?yàn)笊锛夹g(shù)公司，中國(guó)）、DMEM培養(yǎng)基（Hyclone，USA），胎牛血清（Hyclone，USA），F(xiàn)ITC標(biāo)記的鼠抗豬CD29和CD90（Becton Dickinson公司，美國(guó)）、CD34（Thermo scientific，美國(guó)）、CD45(Santa Cruz公司，美國(guó))， CM-DiI(碳花青熒光染料，Molecular Probes公司，美國(guó))，引物合成（上海捷瑞生物工程有限公司），總RNA提取試劑盒，熒光定量PCR試劑盒（AB公司，美國(guó)）、流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson公司，美國(guó)），80ml矩形單向擴(kuò)張器（上海威寧公司，中國(guó)）48個(gè)，乳豬（5天齡，3kg）1頭，小型家豬（3月齡，15±5kg）8頭由第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 BM-MSCs的分離、培養(yǎng)：無(wú)菌條件下解剖乳豬雙側(cè)股骨，用PBS沖出骨髓，1.077g/ml Ficoll分離液分離（1500rpm，30min），取界面單核細(xì)胞層離心洗滌后接種于含完全培養(yǎng)基（DMEM +10%胎牛血清）的培養(yǎng)瓶中，于37℃，5%CO2飽和濕度的孵箱內(nèi)培養(yǎng)，48h換液，待貼壁細(xì)胞培養(yǎng)達(dá)80%～90%融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。

1.2.2流式鑒定BM-MSCs及細(xì)胞標(biāo)記：取培養(yǎng)至第三代的BM-MSCs，0.25%胰酶消化，400μl的PBS重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/ml，分別加入FITC標(biāo)記的鼠抗豬CD90、CD34、CD45、CD29抗體，4℃避光孵育30min，PBS重懸后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。傳代后的BM-MSCs加入2μg/ml的CM-DiI溶液孵育，PBS洗滌后制成含細(xì)胞數(shù)量約25×106/ml的單細(xì)胞懸液。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組：A組：植入擴(kuò)張器后，耳緣靜脈注射DiI標(biāo)記的MSCs細(xì)胞懸液6ml，含細(xì)胞約1.5×108；B組：植入擴(kuò)張器后，耳源靜脈緩慢注射PBS 6ml。

1.2.4 擴(kuò)張模型：小型豬用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，在脊柱兩側(cè)各設(shè)計(jì)3個(gè)皮瓣，皮瓣中心上文出4cm×4cm大小面積。距脊柱2cm作縱行切口，深達(dá)深筋膜，按擴(kuò)張器基底部大小在深筋膜淺層分離出4cm×6cm的皮下腔隙，置入80ml矩形單向擴(kuò)張器，分層縫合皮膚。各組每隔三天注水一次，每次注水10ml。

1.2.5 擴(kuò)張面積的測(cè)定：擴(kuò)張后第7、14、28天分別測(cè)量?jī)山M標(biāo)記面積，共48個(gè)擴(kuò)張皮瓣，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)擴(kuò)張皮瓣為8個(gè)。應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，比較兩組皮膚的擴(kuò)張面積。

1.2.6 冰凍切片觀察DiI細(xì)胞的比例和分布：分別取兩組擴(kuò)張后第7，14，28天的新鮮皮膚標(biāo)本，連續(xù)冰凍切片，熒光顯微鏡下（200×）避光觀察DiI細(xì)胞在擴(kuò)張皮膚中的比例和定位。

1.2.7 SDF-1在擴(kuò)張局部表達(dá)量的觀察：取各組擴(kuò)張第14天的皮膚組織，提取總RNA后常規(guī)反轉(zhuǎn)錄，半定量PCR檢測(cè)引物的特異性，熒光定量PCR分析目的基因趨化生長(zhǎng)因子SDF-1相對(duì)表達(dá)量。以GAPDH為內(nèi)參。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)方法：數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，用SPSS16.0版統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，而兩兩之間的比較采用獨(dú)立樣本參數(shù)t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 BM-MSCs的培養(yǎng)、鑒定結(jié)果：體外培養(yǎng)的BM-MSCs呈多角形或梭形，12天左右細(xì)胞達(dá)到單層匯合的80%～90%。流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果表明BM-MSCs不表達(dá)CD34和CD45，但表達(dá)CD29和CD90。

2.2 BM-MSCs標(biāo)記結(jié)果：CM-DiI染色標(biāo)記傳代后的細(xì)胞，用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，比較同視野白光及熒光下細(xì)胞數(shù)目，可見(jiàn)細(xì)胞均勻分布，熒光明亮，細(xì)胞標(biāo)記率＞99%。

2.3 面積測(cè)定：隨著擴(kuò)張時(shí)間延長(zhǎng)，兩組擴(kuò)張皮瓣的標(biāo)記面積增加，且實(shí)驗(yàn)組增加較多，擴(kuò)張第28天，A、B兩組擴(kuò)張面積分別為（32.54±0.88）cm2、（30.11±0.58）cm2（P＜0.05）。

2.4 擴(kuò)張皮膚冰凍切片結(jié)果：分別取兩組擴(kuò)張第7、14、28天皮膚，連續(xù)冰凍切片觀察，結(jié)果顯示A組擴(kuò)張皮膚第7天僅見(jiàn)少量CM-DiI標(biāo)記細(xì)胞分布，14天時(shí)可見(jiàn)CM-DiI標(biāo)記細(xì)胞聚集，隨著擴(kuò)張時(shí)間延長(zhǎng)，標(biāo)記細(xì)胞增多，主要分布在真皮層。B組皮膚內(nèi)未見(jiàn)標(biāo)記細(xì)胞（圖1）。

2.5SDF-1在擴(kuò)張局部的表達(dá)量結(jié)果：半定量PCR檢測(cè)結(jié)果：目的基因條帶亮度A組高于B組（圖2）。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果：A組SDF-1的表達(dá)量為B組的5.8倍（P＜0.05）。以GAPDH為內(nèi)參（圖3）。

3討論

3.1 近年來(lái)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞由于其多項(xiàng)分化能力、低免疫源性、易獲得培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)成為再生醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)[1-2]。在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)方面，大量研究證實(shí)移植的BM-MSCs參與皮膚的損傷修復(fù)過(guò)程[3-6]，BM-MSCs有很好的可塑性，能夠動(dòng)員到受損組織局部，成為結(jié)構(gòu)組成細(xì)胞[7-8]，國(guó)內(nèi)外大量研究證實(shí)移植到創(chuàng)面上的異體BM-MSCs能夠通過(guò)分化為皮膚細(xì)胞和分泌生長(zhǎng)因子促進(jìn)創(chuàng)面愈合[9]。Yaojiong wu和liwen chen等的研究也證實(shí)了靜脈給予的異體BM-MSCs通過(guò)分化和旁分泌作用促進(jìn)了傷口愈合和皮膚新生[10]。有研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞會(huì)向缺氧環(huán)境遷移[11]，擴(kuò)張皮膚在擴(kuò)張期處于缺氧狀態(tài)，因而極有可能趨化BM-MSCs到擴(kuò)張區(qū)域。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)將CM-DiI熒光標(biāo)記的BM-MSCs靜脈移植入皮膚擴(kuò)張模型，旨在探討異體移植的BM-MSCs能否遷移至擴(kuò)張區(qū)域并促進(jìn)擴(kuò)張局部皮膚的新生。

3.2 CM-DiI是一種親脂性熒光染料，易嵌入生物質(zhì)膜內(nèi)而標(biāo)記整個(gè)細(xì)胞膜[12]。CM-DiI標(biāo)記對(duì)細(xì)胞的活性、發(fā)育或其它基本的生理特性無(wú)明顯影響[13]，不容易在標(biāo)記與非標(biāo)記細(xì)胞之間傳遞，且熒光保持時(shí)間長(zhǎng)，可作為體外培養(yǎng)細(xì)胞所特有的標(biāo)記物以區(qū)分在體細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)采用CM-DiI標(biāo)記豬 BM-MSCs后，結(jié)果顯示標(biāo)記效率達(dá)99%，細(xì)胞在熒光顯微鏡下發(fā)出明亮的紅色熒光，于標(biāo)記后 28天仍然保持較清楚的熒光，也證實(shí)了移植的BM-MSCs向擴(kuò)張區(qū)域的遷移。

3.3 眾多體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明細(xì)胞因子可以影響干細(xì)胞移植的微環(huán)境[14]，進(jìn)而影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的動(dòng)員、遷移及分化?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子-1屬于趨化因子之一，具有廣泛的生物學(xué)活性。研究證實(shí)SDF-1能夠充當(dāng)骨髓干細(xì)胞定向遷移的化學(xué)引誘物[15]，同時(shí)它也可以增強(qiáng)骨髓干細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力[16]，Lee等[17]體外實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向其趨向遷移。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示移植細(xì)胞組SDF-1分泌量較對(duì)照組增高，從而誘導(dǎo)移植的BM-MSCs向擴(kuò)張區(qū)域遷移，在局部起到促進(jìn)擴(kuò)張皮膚新生的作用。

3.4 靜脈移植由于可以反復(fù)、多次、大量進(jìn)行無(wú)創(chuàng)的治療，是最具有應(yīng)用前景的治療方法。但也有研究表明，移植BM-MSCs后早期大量細(xì)胞集聚于肺臟[18]，待損傷局部炎癥減退后，BM-MSCs可逐漸遷移至局部。Gao[19]的實(shí)驗(yàn)也表明移植之前首先給予靜脈注射硝普鈉等血管擴(kuò)張藥物會(huì)明顯減少細(xì)胞在肺組織內(nèi)的存留。因此如何減少移植細(xì)胞在肺組織內(nèi)的存留，以及靜脈移植細(xì)胞后擴(kuò)張局部聯(lián)合應(yīng)用SDF-1是否能更好的促進(jìn)擴(kuò)張皮膚新生有待進(jìn)一步的研究。

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[收稿日期]2011-09-13 [修回日期]2011-01-28

編輯/張惠娟