陳麗娟,王加志,徐姣,齊永華,黃昕紅

[摘要]目的：研究十精丸抗紫外線致ESF-1細胞光老化作用，并初步探討其作用機制。方法：用40J/cm2的UVA照射人皮膚成纖維細胞建立光老化細胞模型，以不同濃度十精丸提取物處理光老化細胞，MTT法檢測細胞活力，羥胺法檢測細胞超氧化物歧化酶（SOD）活性，比色法檢測谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性，TBA法檢測丙二醛（MDA）含量。結果：UVA照射成纖維細胞后，細胞活力下降，SOD、GSH-Px活性降低，MDA含量升高（P<0.01），十精丸水提液中（100μg/ml）、高（200μg/ml）劑量組能顯著提高成纖維細胞細胞活力、SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量（P<0.05或P<0.01）。結論：十精丸水提液可抑制UVA引起的成纖維細胞活性下降，推測其機制為通過提高SOD活力、加速氧自由基的清除和減少氧自由基的產生，使細胞的脂質過氧化損傷程度降低有關。

[關鍵詞]十精丸；UVA；ESF-1細胞；光老化

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2011）04-0582-03

Protective effect of Shijingwan on photoaging induced by Ultraviolet A in ESF-1 cell

CHEN Li-juan,WANG Jia-zhi,XU Jiao,QI Yong-hua,HUANG Xin-hong

(Department of Cosmetology,Jiamusi College, Heilongjiang University of Traditional ChineseMedicine,Jiamusi 154007,Heilongjiang,China)

Abstract: ObjectiveTo study the protective effect of Shijingwan agains UV irradiation-induceddamage in ESF-1 cells and its mechanism.MethodsThe model of photoaging fibroblasts was established by irradiating of ultraviolet light(40J/cm2). The different concentration water-extract solution from Shijingwan were used for photoaging cell. The proliferation of human fibroblasts was detected by MTT, and superoxide dismutase(SOD) and glutathione peroxidase(GSH-Px) activity, malondialdehyde(MDA) content were assayed by hydroxylamine, colorimetric and TBA methods respectively.ResultsThe proliferation activity of fibroblasts descended with the UVA irradiation, the activities of SOD and GSH-Px decreased, when the content of MDA was ascensive(P<0.01). But under the intervention at middle concentration(100μg/ml) and high concentration(200μg/ml) of water-extract solution from Shijingwan,the above changes induced by UVA irradiation were inhibited(P<0.05 or P<0.01).ConclusionThe water-extract solution from Shijingwan might inhibit the proliferation decreasing which induced by UVA. And its mechanism is due to its abilities of increasing SOD，scavenging oxygen free radicals.

Keywords:Shijingwan; UVA; ESF-1cell; photoaging

皮膚長期暴露于紫外線（UV）下可導致結構及功能的改變，從而加速或導致皮膚老化的發(fā)生，這種因UV照射引起的老化被稱為光老化。皮膚光老化不僅有損于人的美容，而且可能與皮膚癌的發(fā)生也有著病因學的聯(lián)系[1]。隨著當前生態(tài)環(huán)境的惡化，皮膚光老化現(xiàn)象愈來愈嚴重，嚴重影響著人們的身心健康。十精丸為補腎方藥之一，出自明代《普濟方·卷二百二十三·諸虛門·補虛駐顏色附論》，是中醫(yī)美容保健、延年益壽之傳統(tǒng)名方。但目前十精丸抗皮膚光老化的基礎實驗研究薄弱，嚴重限制了十精丸療效的進一步發(fā)揮。筆者以體外培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞ESF-1為研究對象，在體外成功建立ESF-1 UVA光老化模型，探討十精丸水提液對UVA損傷ESF-1細胞的保護作用。

1材料和方法

1.1實驗材料和儀器

1.1.1材料：皮膚成纖維細胞ESF-1（北京協(xié)和細胞中心），DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司，批號：12800-058），胎牛血清（Billab公司，批號：20101030）、胰蛋白酶（Billab公司，批號：20100901）、雙抗（Billab公司，批號：20101230），MTT（Sigma公司），超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）試劑盒測定試劑盒（南京建成生物工程公司，批號為：20110107），中藥菟絲子、肉蓯蓉、柏子仁、白茯苓、山茱萸、熟地、桂心、菊花、蜀椒、枸杞（北京同仁堂制藥集團哈爾濱分店，經鑒定為正品）。

1.1.2 儀器：紫外照射儀（Sigma公司），紫外線輻照計（北京師范大學光電儀器廠），Resecarch UV UF型超純水制備系統(tǒng)（上海和泰儀器有限公司），LDZX-4DSBI型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠），IX-71-21PH型Olympus倒置顯微鏡（日本 Olympus株式會社），HF90型二氧化碳培養(yǎng)箱（上海智城分析儀器有限公司），酶標儀（上海熱電儀器有限公司），MS-500A半自動生化分析儀(美生科技有限公司)，冷凍干燥儀（上海熱電儀器有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 藥物的配置：按十精丸藥物組成及藥量(十味各等份，共100克)，加1000ml蒸餾水加熱煮沸30min，5層紗布過濾，濾渣加1000ml水再提取兩次，合并三次濾液，濃縮成浸膏，經冷凍干燥制成粉末，保存于4℃冰箱中備用。實驗時取十精丸水提液凍干粉用DMEM培養(yǎng)液配成所需濃度，調pH值為7.0，0.22μm微孔濾膜過濾除菌。

1.2.2 成纖維細胞ESF-1的體外培養(yǎng)：皮膚成纖維細胞ESF-1在含有10%胎牛血清的DMEM，37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。取對數生長期的細胞以0.25%胰酶和0.02%EDTA消化，調整其密度為105個/ml，定量接種于96孔板中備用。

1.2.3 細胞光老化模型的建立：根據文獻[2]計算紫外線的照射劑量，照射劑量（J/cm2）=照射強度（W/cm2）×照射時間（s），照射強度通過紫外線輻照計測量來測量。

按照文獻[3-5]方法，將處于對數生長期的細胞接種于96孔板，待細胞單層貼壁后（24h），棄培養(yǎng)液，每孔加入150μl PBS，分別使用40J/cm2的UVA照射，正常組用鋁箔蓋住。

1.2.4 實驗分組：按照預實驗結果，將處于對數生長期的細胞接種于96孔板，隨機分為正常對照組、模型對照組、十精丸水提液低（50μg/ml）、中（100μg/ml）、高（200μg/ml）劑量組。接種24h后各組棄培養(yǎng)液，每孔加入150μl PBS，除正常對照組外，按照2.3的方式造模。照光后棄去PBS，藥物組加入含藥的DMEM培養(yǎng)基，對照組加入不含藥DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。以上各組細胞每組設6個復孔。

1.2.5 MTT檢測細胞活力：五組均進行以下操作：接種于96孔板中的細胞，在第48h向每孔加入20μl MTT（5mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)，4h后棄上清，每孔加150μl DMSO溶解，室溫，振蕩10min，使結晶溶解，酶標儀檢測各孔492nm處的光吸收（OD）值，然后按公式（1）計算細胞活力：

1.2.6 檢測細胞培養(yǎng)液中SOD活性、GSH-Px活性和MDA含量：嚴格按照檢SOD、GSH-Px和MDA試劑盒說明書操作。

1.2.7 統(tǒng)計學方法：用SPSS13.0軟件對結果進行統(tǒng)計分析，各組數據以x±s表示，多樣本間的方差分析采用LSD法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1 十精丸水提液對ESF-1細胞細胞活力的影響：見表1。由表1得，模型對照組與正常對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），說明模型制作成功。十精丸水提液各劑量組OD值均高于模型對照組，且在此劑量范圍內，隨著濃度的增加呈升高的趨勢。十精丸水提液中、高劑量組與模型對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）。

2.2 十精丸水提液對ESF-1細胞SOD活性、GSH-Px活性和MDA含量的影響：見表2。由表2得，與正常對照組相比，模型對照組的SOD、GSH-Px活性降低，MDA含量升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。與模型對照組相比較，十精丸水提液各劑量組均能提高SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量；且十精丸水提液中、高劑量組與模型對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）。

3討論

3.1 日光中的紫外線（UV）是引起皮膚損傷的主要環(huán)境因素，它可增加皮膚組織中的氧自由基，引起氧化損傷，同時可引起局部和系統(tǒng)免疫抑制和細胞凋亡，造成DNA損傷誘發(fā)突變，導致皮膚炎癥、曬傷、光老化及皮膚腫瘤[1]。輻射到地面的UV主要是UVA（320～400nm）和少量UVB(290～320nm)，以往研究多集中于中波紫外線對人皮膚的損傷，而對長波紫外線UVA(320～400nm)的研究較少。陽光紫外線中所含的UVA具有很強的穿透作用(大約1 mm)，可影響位于真皮層的成纖維細胞[6]，影響皮膚膠原合成，進而引起皮膚光老化。目前從天然植物和傳統(tǒng)藥物中開發(fā)防皮膚光老化藥物已成為國內外研究熱點[7]。

3.2 十精丸出自明代《普濟方·卷二百二十三·諸虛門·補虛駐顏色附論》，由枸杞、熟地、桂心(肉桂)、菊花、山茱萸、菟絲子、肉蓯蓉、蜀椒、柏子仁、白茯苓(茯苓)十味中藥組成。是中醫(yī)美容保健、延年益壽之傳統(tǒng)名方。其功效為“溫腎滋腎，益精填髓，養(yǎng)心益智、平肝明目；烏須發(fā)，悅容顏，久服能輕身延年”。從以往的理論和研究看[8]，該方具有抗皮膚光老化，緩解紫外線對皮膚細胞損傷的潛在功效。在此筆者對十精丸水提液對UVA誘導的人皮膚成纖維細胞損傷的保護作用進行了初步研究。

3.3實驗結果表明，40J/cm2的UVA照射導致ESF-1細胞SOD和GSH-Px的活性顯著下降， MDA含量明顯升高，細胞活力下降，證實了UVA可降低人真皮組織細胞清除和防御ROS的能力并導致氧化損傷。十精丸水提液低劑量組（50μg/ml）保護ESF-1細胞免受UVA損傷的作用效果不明顯；中（100μg/ml）、高劑量組（200μg/ml）均能顯著提高SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量，增強細胞活力，有效地對抗UVA對成纖維細胞氧化性損傷。

綜上，十精丸可明顯保護人成纖維細胞ESF-1免于UVA損傷，其具體機制可能與抑制氧化損傷和增強細胞抗氧化能力有關。本研究結果為開發(fā)天然光防護劑提供了理論依據，豐富十精丸抗皮膚光老化的理論研究，為其臨床應用奠定基礎。

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[收稿日期]2011-10-20[修回日期]2012-01-18

編輯/張惠娟