閆 浩，魏澤文，李學明，趙德堯，梁子才，李志宏*

(1.北京大學微電子所，微米納米加工技術國家級重點實驗室，北京100871;2.北京大學深圳研究生院，深圳518055;3.北京大學分子醫(yī)學所，北京100871)

細胞電穿孔(Electroporation)是指細胞在外加脈沖電壓的作用下，細胞膜脂雙層上形成瞬時微孔的生物物理過程［1］。從1994年第一個商用細胞電穿孔設備發(fā)布以來［2］，已經(jīng)陸續(xù)報道了近百種細胞電穿孔設備。

然而，目前電穿孔技術和設備都存在一些顯著的缺陷［2－5］。傳統(tǒng)技術加工的電極間距大，而細胞電穿孔所需的電場較高，這導致現(xiàn)有設備需要非常高的電壓才能完成電穿孔。高電壓使實驗具有一定的危險性，而且增加了實驗和設備成本，更為重要的是由于高電壓引起水電解對細胞有極大的損傷［6］。因此，電穿孔效率不高。

為了避免高電壓電穿孔對細胞的損傷，提高電穿孔效率，我們研制了基于MEMS工藝的微型電極的細胞電穿孔芯片［7］。通過降低電極間距，大大的降低電穿孔所需工作電壓。同時獨特的環(huán)形叉指結構，能最大程度優(yōu)化細胞在芯片上的覆蓋?；陔姶┛纂姶┛仔酒?，我們制作了芯片載具和完整的電穿孔電路系統(tǒng)。

1 設計和加工

完整的電穿孔系統(tǒng)包括:電穿孔芯片、芯片載具和電穿孔電路系統(tǒng)。系統(tǒng)的核心是電穿孔芯片，為了更方便的使用電穿孔芯片進行實驗，我們設計了芯片載具并且完成了整套電穿孔電路系統(tǒng)的開發(fā)。

1.1 電穿孔芯片

電穿孔芯片是多重圓環(huán)嵌套而成的環(huán)形叉指結構，相鄰兩個圓環(huán)分別連接不同電極。電穿孔芯片選用金作為電極材料，具有良好的導電性和生物兼容性。

1.2 芯片載具

為了保證每次實驗中的細胞懸浮液均有同樣體積和細胞密度，為芯片提供可靠的電學連接，我們制作了電穿孔芯片載具。

電穿孔芯片載具如圖1所示。它包括用于連接芯片和脈沖發(fā)生裝置的電學連接件和用來精密控制細胞量的盒蓋上方中間凸起的圓柱結構。圓柱結構能對液體表面的進行平整處理，控制細胞量，提高電穿孔效率。小圓柱在盒子關閉的時候和芯片的間距小到幾百微米。芯片載具的材質可以為透明材料(圖1(c))或者不透明材料。使用透明的材料可以方便的觀察到細胞的狀態(tài)。芯片載具包括軸和卡扣，用于盒子的開關和連接。

圖1 (a)電穿孔芯片載具的結構圖，其中電穿孔芯片在載具的正中。(b)(c)為電穿孔芯片載具實物圖，其中圖(c)為透明材料制作

另外，電穿孔芯片載具能夠承載并保護芯片。由于生物實驗對環(huán)境要求較高，做成密封的盒子能夠防止細胞污染。

1.3 電穿孔電路系統(tǒng)

基于電穿孔芯片和芯片載具，我們設計了完整的電穿孔電路系統(tǒng)。該系統(tǒng)如圖2(a)所示，只需將細胞導入到芯片上，將芯片載具插入電穿孔系統(tǒng)的插槽中，通過鍵盤輸入數(shù)據(jù)，即可完成電穿孔。

圖2 用戶只需選擇相應的細胞種類即可，細胞庫里包含常用細胞，也包括原代細胞和干細胞

交互界面使用的是320 240點陣的LCD液晶屏。用戶可以采用多種模式的電穿孔，包括手動電穿孔和智能電穿孔。手動電穿孔可以根據(jù)用戶需要調整電脈沖參數(shù)，優(yōu)化電穿孔效率。

智能電穿孔時，用戶使用系統(tǒng)自帶的細胞庫，選擇相應的細胞，即可對相應細胞進行電穿孔。只需要用戶選擇相應的細胞種類，系統(tǒng)將自動完成電穿孔參數(shù)的設置。大多數(shù)現(xiàn)有電穿孔設備由于受到細胞狀態(tài)，溶液導電率，系統(tǒng)功率等因素的影響，電穿孔的一致性差，難以用相同條件得到相同結果。從而無法使用智能電穿孔模式。我們的電穿孔系統(tǒng)由于精巧的芯片設計，能產(chǎn)生更均一的電場，保證每次都能得到優(yōu)秀的實驗結果。

電穿孔系統(tǒng)的電路部分是基于單片機STC89C58RD+，結合模擬和功率放大電路制作而成。系統(tǒng)結構如圖3所示。用戶通過鍵盤和顯示模塊輸入電學參數(shù)。利用單片機程序的控制，系統(tǒng)可以讀取用戶所需電壓的幅度和脈沖寬度等數(shù)據(jù)，并且產(chǎn)生一個信號。該信號經(jīng)過一級放大，二級放大和功率放大，得到最終的脈沖輸出。存儲模塊用來存儲用戶添加的數(shù)據(jù)。蜂鳴器發(fā)聲配合按鍵，同時還可以作為過流警報。當系統(tǒng)輸出過大電流時，過流保護模塊能自動斷電，以保護系統(tǒng)安全。

圖3 系統(tǒng)電路結構框圖

2 實驗結果

為了驗證電穿孔系統(tǒng)的性能，我們采用HEK-293A細胞進行GFP(綠色熒光蛋白)轉染實驗。實驗時，將分離出來的細胞，加入緩沖液和GFP質粒，滴到電穿孔芯片上，將芯片載具放入所述系統(tǒng)中進行操作。實驗條件為:脈沖電壓60 V，脈沖寬度0.1 ms，脈沖間隔2 s，脈沖次數(shù)為3。成功電穿孔并表達GFP的細胞會發(fā)出綠色熒光。實驗結果如圖4(a)、(b)所示，圖4(a)亮場圖包含所有的細胞，圖4(b)熒光圖是表達綠色熒光的細胞，即被電穿孔的細胞。由圖可知，HEK-293A的電穿孔效率高于90%，存活率亦高于80%。

圖4 HEK-293A細胞的GFP轉染實驗

除了向易于被轉染的細胞中輸運質粒DNA以外，細胞轉染技術面臨的更大挑戰(zhàn)是向難以被轉染細胞中輸運siRNA等大分子。而現(xiàn)有的電穿孔系統(tǒng)都很難完成該種實驗。

為了驗證所述電穿孔系統(tǒng)的適用范圍，我們選擇另一種公認的難以轉染的細胞3T3-L1(小鼠胚胎成纖維細胞)進行電穿孔實驗［8］。3T3-L1在誘導成脂肪細胞的時候會產(chǎn)生一種MALAT1的非編碼RNA，我們通過電穿孔導入MALAT1的siRNA對它進行抑制。實驗結果如圖5所示，在電穿孔后第一天，實驗組中MALAT1的表達被抑制了80%。這個結果表明3T3-L1的電穿孔效率高達80%。

圖5 3T3-L1的電穿孔實驗

3 結論

基于電穿孔的微加工芯片，我們研制了完整的電穿孔系統(tǒng)，它能夠提供多種細胞的高效電穿孔。通過良好的人機交互界面，用戶可以很方便的進行智能電穿孔和手動電穿孔。由于結合了MEMS微電極芯片，使電穿孔所需的電壓大大降低，因而減小了對細胞的損傷。電穿孔的細胞存活率和電穿孔率都高于所見報道的結果。在實驗中，HEK-293A的電轉效率達到90%，3T3-L1的電穿孔效率高達80%。該電穿孔系統(tǒng)已經(jīng)在北京大學的幾個實驗室里試用，并且做過大量的電穿孔實驗。系統(tǒng)穩(wěn)定性好，使用方便。

［1］ Neumann E，Schaefer-Ridder M，Y Wang，et al.Gene Transfer into Mouse Lyoma Cells by Electroporation in High Electric Fields［J］.The EMBO Journal，1982，1(7):841.

［2］ Murakami Yuji，Motohashi Ken，Kazuyoshi Yano，et al.Micromachined Electroporation System for Transgenic Fish［J］.Journal of Biotechnology，1994，34(1):35－42.

［3］ siPORTerTM－96 Electroporation Chamber(Cat#13500)Instruction Manual.

［4］ http://www.lonzabio.com/cell－biology/transfection/

［5］ http://zh.invitrogen.com

［6］ Kim J A，Cho K，Shin M S，et al.A Novel Electroporation Method Using a Capillary and Wire-Type Electrode［J］.Biosensors and Bioelectronics，2008，2(12):1353－1360.

［7］ Huang Huang，Zewen Wei，Yuanyu Huang，et al.An Efficient and High-Throughput Electroporation Microchip Applicable for siRNA Delivery［J］.Lab on a Chip，2011，11:163－172.

［8］ Wei Liao，Audrey Nguyen M T，Takeshi Imamura，et al.Lentiviral shRNA-Mediated Knockdown of GLUT4 in 3T3－L1 Adipocytes［J］.Endocrinology，F(xiàn)ebruary 23，2006，10.1210/en.2005－1638.