郭 羽，劉必旺，徐榮芳，薛慧清，李艷彥，閆潤紅，周 然

（山西中醫(yī)學(xué)院，山西太原030024）

黃芪為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的根，為我國常用藥材的大宗品種。黃芪多糖具有提高機體免疫、抗菌、抗病毒、抗衰老、抗腫瘤等生理功能［1］，然而，采用傳統(tǒng)水煎提取黃芪多糖產(chǎn)率并不高［2］。微生物發(fā)酵中藥是近年來新興的中藥炮制技術(shù)，本文以酵母菌為發(fā)酵菌株，對黃芪藥材進行發(fā)酵處理，以提高黃芪多糖產(chǎn)率，增強黃芪的治療作用。

1 實驗材料

1.1 藥品與試劑

黃芪（產(chǎn)地山西應(yīng)縣），經(jīng)鑒定為豆科植物蒙古黃芪，作為發(fā)酵藥材時粉碎成65目粉末。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品購自中國食品藥品檢定研究院，批號：110833-200904；苯酚、無水乙醇、濃硫酸均為分析純；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），由山西大學(xué)生物技術(shù)研究所提供；豆芽汁培養(yǎng)基。

1.2 實驗儀器

自動電熱高壓蒸汽滅菌器；DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱；pH測定計；圖華SHA-C恒溫振蕩器；THZ-D臺式恒溫振蕩器（空氣?。晃⑿蚐igmal-14離心機；KDC-1044低速離心機；單目顯微鏡；正置熒光顯微鏡；BS 224S-L電子天平；紫外分光光度計cary50（美國）；萬能粉碎機；無菌操作臺。

2 實驗方法

2.1 菌種活化與液體發(fā)酵種子培養(yǎng)

將低溫保藏的菌種取出，無菌操作接種于斜面培養(yǎng)基上，于28℃下培養(yǎng)24 h，重復(fù)3次，作為活化后菌種備用。將活化菌種無菌操作接種至豆芽汁液體培養(yǎng)基內(nèi)，接種量為10%，于28℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)，通過鏡檢及觀察生長狀態(tài)確定種子最佳培養(yǎng)時間。

2.2 實驗分組

無菌條件下將已滅菌的5.00 g黃芪藥材粉末加入100 mL豆芽汁培養(yǎng)基中，每瓶按10%的接種量接入液體種子，作為發(fā)酵組；對照組不接種液體種子，加入等量蒸餾水；取5.00 g原藥材按傳統(tǒng)水煎方法處理，過濾取濾液100 mL作空白對照組。發(fā)酵組與對照組置于28℃、150 r/min條件下培養(yǎng)。

2.3 pH值測定

待接種培養(yǎng)后24 h，取發(fā)酵組與對照組各3個樣品，于4200 r/min下離心10 min，取上清液，測定體積及pH值后將樣品密閉置于冰箱，之后每隔48 h同樣操作取樣1次，直至8次全部取完。

2.4 多糖含量測定

2.4.1 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備［3］精密稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品100 mg置100 mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度，再精密吸取10 mL于另一100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，搖勻即得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2 mL，0.4 mL，0.6 mL，0.8 mL，1.0 mL分別于50 mL錐形瓶中，加蒸餾水至1.0 mL，精密加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，加入5 mL濃硫酸，迅速混勻，放置5 min后，于沸水浴中加熱15 min，取出冷卻。另取蒸餾水1 mL，同樣操作作為空白組。在490 nm波長下測定吸光度，以吸光度對濃度進行回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。

2.4.2 樣品的處理與測定 將冷凍保存的樣品置于室溫下融化，依據(jù)方法［4-5］取適量已融化的樣品各1.05 mL，分別加入無水乙醇使乙醇終濃度為85%，置于4℃冰箱靜置過夜，待多糖沉出再抽濾，濾餅用70%的乙醇洗滌3次，60℃水浴揮發(fā)盡乙醇，用熱蒸餾水將濾餅溶解，定容至10 mL，2000 r/min離心10 min，取上清液作為待測液。

2.4.3 待測液中多糖含量測定 精密吸取各待測液0.3 mL分別于50 mL錐形瓶中，加蒸餾水至1.0 mL，依照多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法進行測定，記錄各個待測液的吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算多糖的含量。

2.4.4 樣品中多糖含量測定 各樣品中多糖含量計算如下：

X為樣品中多糖的含量（mg/g）；C為待測液中多糖的含量（μg/mL）；V0為待測液的總體積（mL）；V1為吸取的待測液的體積（mL）；m為所取樣品液相當(dāng)于原始藥材量（g）；

3 結(jié)果

3.1 液體發(fā)酵種子最佳培養(yǎng)時間確定

液體發(fā)酵種子培養(yǎng)72 h后，菌種生長狀態(tài)良好，菌體密度較高，鏡下顯示形態(tài)正常，選定液體種子培養(yǎng)時間為72 h。結(jié)果見圖1。

圖1 酵母菌的顯微鏡照片（10×20）

3.2 發(fā)酵液pH值變化

結(jié)果見圖2。

從圖2可以看出，對照組的pH值維持在5.3～5.6之間，變化幅度較小。發(fā)酵組的pH在5～5.5之間，波動相對對照組較大。酵母菌最適生長pH值為4.5～5.0，在發(fā)酵第7天時pH值最接近其適宜生長值，說明第7天時發(fā)酵最旺盛。

3.3 發(fā)酵過程中多糖的變化

3.3.1 多糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線 結(jié)果見圖3。

由圖3得回歸方程為y=1522.6x+2.0684，R2=0.9991，可得出相關(guān)系數(shù)r=0.9995，r＞0.999，線性關(guān)系良好。

3.3.2 發(fā)酵過程中多糖含量的變化 結(jié)果見圖4。

圖4結(jié)果顯示，通過苯酚-濃硫酸法測定樣品多糖含量，對照組基本維持在45 mg/g左右；發(fā)酵組多糖含量從接種后就開始下降，到第7天時又稍有上升，第11天后又有升高，對照組整體高于發(fā)酵組。這是由于豆芽汁培養(yǎng)基中含有葡萄糖，而酵母菌以葡萄糖作碳源，發(fā)酵組酵母菌在生長和增殖過程中需要消耗大量葡萄糖，由于酵母菌自身代謝利用能量物質(zhì)的特點，使得發(fā)酵組中多糖含量低于同時期的對照組中多糖含量。因此，要比較等量藥材中多糖的收率，將發(fā)酵法與傳統(tǒng)水煎法比較更有意義。

3.3.3 傳統(tǒng)水煎液與發(fā)酵組多糖含量對比 結(jié)果見表1。由表1可以看出，傳統(tǒng)水煎法中黃芪多糖的產(chǎn)量約為16.1 mg/g，產(chǎn)率為1.61%；發(fā)酵最佳時黃芪多糖的產(chǎn)量約為18.4 mg/g，產(chǎn)率為1.84%，兩種處理方法對黃芪多糖的產(chǎn)率影響相差0.23%。同時，采用間接碘量法測定發(fā)酵液中只含有微量的葡萄糖，這與之前測定的發(fā)酵組發(fā)酵過程中發(fā)酵液pH值變化和多糖含量變化趨勢一致。在酵母菌生長繁殖過程中要消耗大量葡萄糖用于自身生長和代謝，由于整個實驗過程不再額外補料，因此營養(yǎng)物質(zhì)消耗的同時環(huán)境中代謝產(chǎn)物也在積累，使發(fā)酵液pH值隨菌體生長而降低，到第7天時達(dá)到菌體最適宜生長pH值，此后菌體生長呈下降趨勢。

表1 傳統(tǒng)水煎液與發(fā)酵組第7天多糖含量對比

4 討論

微生物發(fā)酵中藥是在中藥發(fā)酵炮制的基礎(chǔ)上吸取微生態(tài)的研究成果，結(jié)合現(xiàn)代生物工程而形成的中藥制藥新技術(shù)［6］。自然界微生物資源豐富，經(jīng)發(fā)酵后能提高中藥有效成分含量，顯著提高藥效，并產(chǎn)生新的化合物?；趥鹘y(tǒng)水煎提取黃芪多糖產(chǎn)率低的現(xiàn)狀以及酵母菌易于培養(yǎng)、酶系豐富等優(yōu)點，本文以酵母菌為發(fā)酵菌株，對黃芪藥材進行發(fā)酵處理。實驗結(jié)果表明，酵母發(fā)酵技術(shù)對黃芪中多糖的產(chǎn)率有一定的影響，發(fā)酵旺盛時多糖產(chǎn)率比傳統(tǒng)水煎液要高，證明酵母菌發(fā)酵能夠提高黃芪多糖產(chǎn)量。我們推測，黃芪多糖作為黃芪纖維質(zhì)的組成部分，其提取產(chǎn)率的提高可能是酵母菌內(nèi)在酶系促進了纖維之間的酯鍵斷裂而發(fā)是剝皮反應(yīng)，使更多的多糖得以游離而釋放出來［7］。提示我們下一步工作可以采用理化或生物學(xué)方法對發(fā)酵菌株進行定向誘變，或優(yōu)化酵母菌培養(yǎng)條件，提高發(fā)酵液黃芪多糖的產(chǎn)量。同時，通過高效液相色譜等方法測定發(fā)酵液中多糖的成分，進一步計算多糖含量會更精確。而發(fā)酵過程中是否產(chǎn)生了其他新的活性物質(zhì)也有待進一步研究。本文對黃芪的酵母菌發(fā)酵液中的多糖含量變化進行了研究，為今后黃芪發(fā)酵的綜合研究提供了一些資料及依據(jù)。

［1］李寶霞，董雙濤，霍乃蕊.黃芪多糖抗氧化活性研究［J］.山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2011，12（5）：17-18.

［2］閆巧娟，韓魯佳，江正強.纖維素酶法提取黃芪多糖［J］.中草藥，2005，36（12）：1804-1807.

［3］王士中.黃芪的糙皮側(cè)耳發(fā)酵及其發(fā)酵液的藥效研究［D］.蘭州：蘭州大學(xué)，2008.

［4］楊莉，王志華，陶健生.黃芪中黃芪多糖含量測定方法的比較［J］.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2005，36（9）：562-563.

［5］鐘方曉，任海華，李巖.多糖含量測定方法比較［J］.時珍國醫(yī)國藥，2007，18（8）：1916-1917.

［6］姜良，趙長琦.中醫(yī)藥與微生態(tài)學(xué)［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2008：26-30.

［7］李紅民，黃仁泉，王亞洲.提高黃芪多糖提取收率的工藝研究［J］.西北大學(xué)學(xué)報，2000，30（6）：509-510.