符運(yùn)良，張鐵民，王林茂

(海南師范大學(xué) 物理與電子工程學(xué)院，海南 ?？?71158)

0 引 言

食品安全問(wèn)題關(guān)系到人們的生命健康安全，得到了人們?cè)絹?lái)越多的重視。其中，食品中獸藥殘留問(wèn)題是一個(gè)較突出的問(wèn)題，食用過(guò)量的獸藥殘留的動(dòng)物源性食品對(duì)人類(lèi)的健康造成危害。世界上許多國(guó)家和組織對(duì)動(dòng)物性食品中獸藥殘留都規(guī)定了最大的殘留量，如美國(guó)和歐盟規(guī)定動(dòng)物的可食用組織中的磺胺獸藥殘留總量不得超過(guò)100 μg/kg［1］。目前，對(duì)于動(dòng)物性食品中獸藥殘留的檢測(cè)有很多種方法，如傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)法［2］、高效液相色譜(HPLC)法［3］、酶聯(lián)免疫法(ELISA)［4］，這些方法要么耗時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，或檢測(cè)精度低，儀器設(shè)備昂貴，同時(shí)，這些方法通常是一種檢測(cè)方法對(duì)應(yīng)一種藥物殘留，不容易實(shí)現(xiàn)多種殘留的分析檢測(cè)?；诒砻娴入x子共振(surface plasmon resonance，SPR)效應(yīng)的生物傳感器免疫法是近年來(lái)發(fā)展的一種新的檢測(cè)方法，其具有實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)分子間的相互作用、無(wú)需標(biāo)記、定量準(zhǔn)確等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于藥物研究［5］、食品分析［6］、環(huán)境監(jiān)測(cè)［7］等領(lǐng)域。20 世紀(jì) 90 年代，瑞典的 Biacore公司將SPR 生物傳感器技術(shù)引入獸藥殘留分析中，目前，已生產(chǎn)出多種檢測(cè)試劑盒。國(guó)內(nèi)已有利用SPR 技術(shù)進(jìn)行獸藥殘留的研究［8～9］，該技術(shù)方法具有樣品前處理相對(duì)簡(jiǎn)單、高特異性、分析快捷、定量準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì)［10］。本研究利用SPR 技術(shù)，建立磺胺二甲嘧啶的檢測(cè)方法，該方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高，重復(fù)性好，適用于大量的無(wú)標(biāo)記的雞蛋或牛奶中獸藥殘留的檢測(cè)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 磺胺二甲嘧啶芯片的制備

將裸金膜傳感器芯片放入儀器中，在空氣環(huán)境條件下進(jìn)行格式化，然后，選擇第2 個(gè)通道，注入蒸餾水，流過(guò)芯片表面，點(diǎn)擊標(biāo)定，出現(xiàn)SPR 曲線，待曲線穩(wěn)定后，向金膜表面流動(dòng)注入1 mol/L 11-巰基十一烷酸，時(shí)間約3 h，而后，用PBS 緩沖液沖洗，信號(hào)穩(wěn)定后，在金膜表面固定一層羥基。將 0.4 mol/L EDC 和0.1 mol/L NHS(1∶1，體積比)混合后注入，活化金膜表面的羥基，形成活性酯，時(shí)間約1 h，用PBS緩沖液沖洗，注入溶液的流速均為10 μL/min，磺胺二甲嘧啶-牛血清白蛋白用醋酸緩沖液(pH =4.4)1∶50 稀釋?zhuān)?0 μL/min流速注入儀器中，信號(hào)穩(wěn)定后，用PBS 緩沖液沖洗，這樣抗原便固定在金膜上;最后，將1 mol/L 乙醇胺(pH=8.5)以10 μL/min 的流速注入，封閉金膜上未被蛋白結(jié)合的活性位點(diǎn)，PBS 緩沖液沖洗，完成分子識(shí)別膜的制備，原理結(jié)構(gòu)如圖1 所示。

圖1 SPR 傳感器結(jié)構(gòu)圖Fig 1 Structure diagram of SPR sensor

1.2 抗體工作濃度的選擇

磺胺二甲嘧啶單克隆抗體，用PBS 緩沖液分別稀釋為1∶100，1∶200，1∶500，1∶1000，1∶5000 倍，與濃度分別為 1，40 mg/L磺胺二甲嘧啶的PBS 緩沖液混合后，注入芯片表面，反應(yīng)10 min，比較曲線，根據(jù)檢測(cè)限的要求與檢測(cè)范圍，選擇抗體工作適當(dāng)?shù)臐舛取?/p>

由于抗體濃度高時(shí)，抑制樣品的濃度也隨著增加，導(dǎo)致檢測(cè)的靈敏度下降，檢測(cè)限提高;抗體濃度過(guò)低，競(jìng)爭(zhēng)的抑制樣品濃度范圍變小，但抗體濃度越低時(shí)，檢測(cè)限就越低，越有利于檢測(cè)，選擇較低濃度的工作抗體濃度1∶5000 稀釋。

1.3 建立抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線

以工作抗體濃度與含有不同濃度(0，1.2，2.4，8，11.5 mg/L)磺胺二甲嘧啶的PBS 緩沖液，在室溫(20 ℃)下混合4 min，注入傳感器中，以信號(hào)強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線。

1.4 構(gòu)建牛奶樣品濃度抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線

將無(wú)抗牛奶(市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi))稀釋10 倍后，離心機(jī)10000 r/min離心5 min，取中間層，加入磺胺二甲嘧啶，濃度分別為 0，0.4，0.8，5，10，50，100 mg/L，加入工作抗體，注入儀器中，以信號(hào)強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，以濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制牛奶中的磺胺二甲嘧啶濃度添加競(jìng)爭(zhēng)抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 芯片表面固定磺胺二甲嘧啶抗原過(guò)程

將 0.4 mol/L EDC 和0.1 mol/L NHS(1∶1，體積比)混合后注入，活化金膜表面的羥基，形成活性酯，時(shí)間約7 min，SPR信號(hào)上升。用PBS 緩沖液沖洗，注入溶液的流速均為10 μL/min，將磺胺二甲嘧啶-牛血清白蛋白用醋酸液(pH=4.4)1:50 倍，以 10 μL /min 注入儀器中，結(jié)合信號(hào)上升，信號(hào)穩(wěn)定后，用PBS 緩沖液沖洗，這樣抗原便固定在金膜上;最后將 1 mol/L 乙醇胺(pH =8.5)以 10 μL/min 的流速注入，滅活封閉金膜上未被蛋白結(jié)合的活性位點(diǎn)，PBS 緩沖液沖洗，完成分子識(shí)別膜的制備，整個(gè)過(guò)程的SPR 傳感信號(hào)如圖2 所示。

圖2 芯片表面固定抗原過(guò)程Fig 2 Process of immobilization of antigen on chip surface

2.2 磺胺二甲嘧啶濃度抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

圖3 為利用SPR 傳感器免疫法檢測(cè)PBS 中的磺胺二甲嘧啶所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，從上到下，濃度依次為0，1.2，2.4，8.0，11.5 mg/L。特異性抗原與抗體結(jié)合，在結(jié)合階段信號(hào)強(qiáng)度表現(xiàn)為上升的結(jié)合曲線，特異性結(jié)合較為穩(wěn)定，抗體與固定于芯片表面的抗原結(jié)合后，通入PBS 緩沖液達(dá)到一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，當(dāng)通入洗脫液0.1 mol/L HCl 或0.1 mol/L NaOH 溶液，在洗脫液的作用下，才能迅速解離，基線恢復(fù)回到反應(yīng)前的高度。

2.3 牛奶樣品中磺胺二甲濃度抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

圖4 為牛奶樣品中，磺胺二甲嘧啶濃度分別為0，0.4，0.8，5，10，50，100 mg/L，加入抗體(工作濃度)，注入儀器中，以信號(hào)強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，濃度以10 為底對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制得的牛奶的藥物殘留濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。將一定濃度的抗體與樣品混合后，如果樣品中的含有磺胺二甲嘧啶，部分抗體將被與磺胺二甲嘧啶結(jié)合，不能再與芯片表面的抗原結(jié)合，這樣導(dǎo)致結(jié)合到芯片表面的抗體減少，結(jié)合值SPR 信號(hào)下降。因此，通過(guò)以不同質(zhì)量濃度的磺胺二甲嘧啶與一定濃度的抗體混合，就可獲得競(jìng)爭(zhēng)抑制的標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線。此外，測(cè)量樣品時(shí)，由測(cè)得的數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)樣品曲線進(jìn)行比較，可計(jì)算出牛奶樣品中磺胺二甲嘧啶的殘留濃度值。由上述實(shí)驗(yàn)測(cè)得的數(shù)據(jù)，Sigmoidal 即S 型非線性關(guān)系擬合得擬合方程

y=A2+(A1－A2)/(1 +(x/x0)p).

其中，A1=3 657.724 56，A2=3010.444，x0=9.503 5，P=1.506 43。質(zhì)量濃度測(cè)定線性范圍為3 ～48 mg/L，可以實(shí)現(xiàn)牛奶樣品的磺胺二甲嘧啶濃度范圍的檢測(cè)，最低檢測(cè)濃度低于國(guó)家允許的標(biāo)準(zhǔn)限100 mg/L。

圖3 抗體與抗原特異性結(jié)合的響應(yīng)曲線與再生過(guò)程Fig 3 Response curves and regeneration process of specific binding between antibody and antigen

圖4 牛奶中磺胺二甲嘧啶競(jìng)爭(zhēng)抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 4 Standard competitive inhibition curve of sulfamethazine in milk

2.4 樣品濃度回收率的測(cè)定

對(duì)5 個(gè)添加磺胺二甲嘧啶的樣品(40 mg/L)，分析其回收率，測(cè)定結(jié)果如表1 所示，回收率定義為各次樣品檢測(cè)值與檢測(cè)平均值之比值，由表可知，回收率計(jì)算為99%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏(RDS)計(jì)算值為3.2%，小于10%，表明測(cè)量的精度較高。

表1 樣品濃度回收率Tab 1 Recovery rate of sample concentration

3 結(jié) 論

研究通過(guò)使用磺胺二甲嘧啶的單克隆抗體與SPR 生物傳感器檢測(cè)PBS 緩沖液中的磺胺二甲嘧啶，對(duì)照牛奶中添加不同質(zhì)量濃度的磺胺二甲嘧啶，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，最低檢測(cè)限為2.4 mg/L。樣品只需簡(jiǎn)單的稀釋、離心處理即可直接測(cè)量，可以實(shí)現(xiàn)牛奶樣品中的磺胺二甲質(zhì)量濃度范圍為3 ～48 mg/L，單個(gè)樣品前處理5 min，測(cè)量約7 min，整個(gè)過(guò)程在16 min 之內(nèi)完成，能夠滿足實(shí)際檢測(cè)過(guò)程的需要，這種方法簡(jiǎn)單快速，抗體無(wú)需標(biāo)記，樣品基質(zhì)的影響小，與抗原具有中等親和力的抗體和洗脫，配合適當(dāng)?shù)臉悠非疤幚矸椒?，可以用以檢測(cè)抗體對(duì)應(yīng)的小分子物質(zhì)，具有廣泛的應(yīng)用前景。

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