臧立輝 王亞娟 曲有樂(lè)

浙江海洋學(xué)院，浙江 舟山 316000

雷公藤系衛(wèi)矛科雷公藤屬植物，其藥用部位是該植物的根及莖［1，2］，其抗炎、免疫抑制等活性作用的主要成分是雷公藤二萜內(nèi)酯類［3］。近年來(lái)雷公藤類藥物廣泛應(yīng)用于糖尿病及其并發(fā)癥的研究，而DN是糖尿病主要微血管并發(fā)癥之一。研究顯示，TGF－β1在DN的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起到非常重要的作用［4］，其被認(rèn)為是腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化機(jī)制中最關(guān)鍵的細(xì)胞因子。另有證據(jù)表明，TGF－β1參與了DN的產(chǎn)生與發(fā)展［5］，并將血液中TGF－β1作為糖尿病腎病早期診斷敏感指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)有效控制TGF－β1的含量，影響DN大鼠腎組織修復(fù)，探討雷公藤乙素及其類似物對(duì)DN的治療作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

1.1.1 SD大鼠

清潔級(jí)雌雄SD大鼠60只，購(gòu)于浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，體重130g±10g，批號(hào):0016453。

1.1.2 主要試劑

雷公藤甲素和雷公藤乙素 (上海雅吉生物科技有限公司，批號(hào):07111G和YS0105，使用時(shí)用生理鹽水配置成濃度為0.025mg/ml的溶液，4℃保存)。鏈脲佐菌素 (STZ美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，批號(hào):31087，用前溶解在0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液中，pH值為4.5)。TGF－β1酶聯(lián)免疫試劑盒 (北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào):201109)。

1.1.3 主要儀器

酶標(biāo)儀 (美國(guó)伯樂(lè)型酶標(biāo)儀HB.63－BIO－RAD680)，離心機(jī) (LD5－2A臺(tái)式低速離心機(jī))，OLYMPUS光學(xué)顯微鏡 (SZ61體視顯微鏡)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DN大鼠模型的建立

普通飼料喂養(yǎng)四周后，按體重隨即抽取12只大鼠作為空白實(shí)驗(yàn)組。其余48只按60mg/kg一次性腹腔注射3%STZ溶液，一周后尾靜脈采血測(cè)定空腹血糖及尿量，將血糖≥16.7mmo1/L，尿量大于空白實(shí)驗(yàn)組的50%作為DN大鼠成模標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥

造模后的DN大鼠按體重隨即分為四組，每組11只，分別為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、雷公藤乙素+雷公藤甲素聯(lián)合治療組、雷公藤乙素+纈沙坦聯(lián)合治療組、纈沙坦治療組。DN大鼠按雷公藤乙素及其類似物200ug/kg.d、纈沙坦20mg/kg.d每日灌胃給藥，連續(xù)給藥12周。實(shí)驗(yàn)期間自由飲水，進(jìn)食普通飼料。

1.2.3 動(dòng)物處理方法及指標(biāo)檢測(cè)

連續(xù)給藥12周后，一次性處死大鼠，同時(shí)解剖大鼠，收集腎臟標(biāo)本。用常規(guī)病理切片HE染色法光鏡下分析各組大鼠腎臟損傷的修復(fù)程度，用ELISA雙抗夾心法檢測(cè)大鼠腎組織和血清中TGF－β1的實(shí)際含量。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)中DN大鼠的一般情況

造模后，DN大鼠出現(xiàn)尿量明顯增多，飲水量和飲食量明顯增大的情況，體重明顯降低，行為活動(dòng)遲緩、毛色變暗、無(wú)光澤、體態(tài)消瘦等狀況，給藥六周后出現(xiàn)弓背、白內(nèi)障等糖尿病并發(fā)癥。

2.2 ELISA雙抗夾心法檢測(cè)結(jié)果

圖1 ELISA雙抗夾心法檢測(cè)DN大鼠腎組織內(nèi)TGF－β1標(biāo)準(zhǔn)曲線

治療12周后處死大鼠并收集血清、腎臟標(biāo)本。嚴(yán)格按照TGF－β1ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)說(shuō)明操作步驟操作，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 (R＞0.92)，見圖1，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算DN大鼠腎臟和血清中的TGF－β1的含量。結(jié)果表明:空白實(shí)驗(yàn)組中大鼠腎組織TGF－β1的含量顯著低于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組 (P＜0.05)，且也明顯低于雷公藤乙素+纈沙坦聯(lián)合治療組和纈沙坦治療組 (P＜0.01)，而與雷公藤乙素+雷公藤甲素聯(lián)合治療組并無(wú)明顯差異 (P＞0.05);實(shí)驗(yàn)對(duì)照組DN大鼠腎組織TGF－β1的含量顯著低于雷公藤乙素+纈沙坦聯(lián)合治療組和纈沙坦治療組 (P＜0.01)，而與雷公藤乙素+雷公藤甲素聯(lián)合治療組并無(wú)明顯差異 (P＞0.05);雷公藤乙素+纈沙坦聯(lián)合治療組與纈沙坦治療組之間DN大鼠腎組織TGF－β1的含量并無(wú)明顯差異 (P＞0.05)，但均明顯高于雷公藤乙素+雷公藤甲素聯(lián)合治療組 (P＜0.01)，見表1。

空白實(shí)驗(yàn)組大鼠血清中TGF－β1的含量明顯高于造模各組 (P＜0.01);實(shí)驗(yàn)對(duì)照組DN大鼠血清中TGF－β1的含量明顯低于各治療組 (P＜0.01);雷公藤乙素+纈沙坦聯(lián)合治療組DN大鼠血清中TGF－β1的含量顯著低于雷公藤乙素+雷公藤甲素聯(lián)合治療組 (P＜0.05)，明顯高于纈沙坦治療組 (P＜0.01);雷公藤乙素+雷公藤甲素聯(lián)合治療組DN大鼠血清中TGF－β1的含量明顯高于纈沙坦治療組 (P＜0.01)，見表1。

表1 ELISA雙抗夾心法大鼠腎臟、血清中TGF－β1的實(shí)際濃度

2.3 HE 染色結(jié)果

2.3.1 造模成功組與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組

腎臟皮質(zhì)變薄，皮髓質(zhì)界限不清，腎小球數(shù)目明顯減少，殘余腎小球不同程度纖維化，腎小管萎縮、纖維化，間質(zhì)充血、出血，隨著病程的進(jìn)展大鼠出現(xiàn)持續(xù)蛋白尿、水腫和腎功能不全、尿毒癥等癥狀，圖2－A。

2.3.2 空白實(shí)驗(yàn)組

腎臟皮髓質(zhì)界限清楚，腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)正常，間質(zhì)輕度淤血 (處死大鼠時(shí)造成腎臟間質(zhì)輕度淤血)，圖2－B。

圖2 各組大鼠腎臟病理HE染色圖

2.3.3 雷公藤乙素+雷公藤甲素聯(lián)合治療組

腎臟皮質(zhì)比治療前明顯增厚，腎小球結(jié)構(gòu)基本正常，腎小管管腔完整，腎小管上皮細(xì)胞輕度水腫，間質(zhì)無(wú)纖維組織增生，圖2－C。

2.3.4 雷公藤乙素+纈沙坦聯(lián)合治療組

腎臟結(jié)構(gòu)明顯恢復(fù)，多數(shù)腎小球結(jié)構(gòu)基本正常，腎小管上皮細(xì)胞輕度體積較大，部分腎小管上皮細(xì)胞呈現(xiàn)空泡變性，間質(zhì)輕度充血，無(wú)明顯纖維組織增生，圖2－D。

2.3.5 纈沙坦治療組

腎臟部分結(jié)構(gòu)恢復(fù)明顯，部分腎小球結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常，少數(shù)腎小球呈現(xiàn)不同程度纖維化，腎小管上皮細(xì)胞輕度水腫，部分管腔內(nèi)見顆粒管型，間質(zhì)輕度充血，有少量纖維組織增生，圖2－E。

對(duì)比各組大鼠腎臟標(biāo)本的病理切片，通過(guò)光鏡觀察顯示實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:雷公藤乙素+雷公藤甲素聯(lián)合治療組腎臟結(jié)構(gòu)恢復(fù)優(yōu)于雷公藤乙素+纈沙坦聯(lián)合治療組和纈沙坦治療組。

3 討論

DN是糖尿病 (DM)嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥之一，也是DM患者重要的死亡原因。DM確切發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明，既往的研究主要集中在血糖和血脂代謝紊亂等方面。本實(shí)驗(yàn)主要研究TGF－β1在DN的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的影響及生物學(xué)作用。

研究表明［6］，中藥對(duì)腎組織糖代謝紊亂、糾正脂代謝紊亂、改善微循環(huán)、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子方面均有一定優(yōu)勢(shì)，經(jīng)雷公藤乙素及其類似物治療后，DN大鼠腎臟修復(fù)明顯。有證據(jù)表明引起DN發(fā)生的原因不僅與糖基化終末產(chǎn)物對(duì)腎小球的毒性作用和血管緊張素Ⅱ等因素有關(guān)，而且與生長(zhǎng)因子TGF－β等的作用有關(guān)［7］。在ELISA雙抗夾心法檢測(cè)到雷公藤乙素及其類似物治療后DN大鼠腎組織中TGF－β1含量明顯減少，是由于TGF－β1是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的多肽，對(duì)腎小球細(xì)胞和細(xì)胞外基合成膠原蛋白，纖維連接蛋白、粘多糖、透明質(zhì)酸等具有增多作用［8］。因此合理控制TGF－β1的含量，可以對(duì)腎組織起到有效的修復(fù)和保護(hù)作用;而雷公藤乙素和雷公藤甲素治療組DN大鼠血清中TGF－β1含量明顯高于其他各治療組，是由于TGF－β1是由血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 (VEGF)促進(jìn)生成的血管內(nèi)皮細(xì)胞和腎小球系膜細(xì)胞產(chǎn)生的，其作用還可誘導(dǎo)其表達(dá)，血清中TGF－β1的高含量更能對(duì)血管的生長(zhǎng)和微血管通透性起到了修復(fù)和保護(hù)的作用。

綜上所述，雷公藤乙素及其類似物能調(diào)節(jié)大鼠腎組織糖代謝紊亂，達(dá)到降低血糖和尿量的作用，并通過(guò)對(duì)TGF－β1的有效控制，對(duì)DN大鼠的腎臟的修復(fù)起到明顯的作用，從而達(dá)到治愈DN的效果。

［1］蘇維廣，孟江.雷公藤的臨床應(yīng)用 ［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2003，30(10):845—846.

［2］許靜亞，楊峻，李樂(lè)真，等.雷公藤抗腫瘤的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，1992，12(3):161－164.

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［5］Ziyadeh FN，Han DC，Cohen JA，et al.Glycated albumin stimulates fibronectin gene expression in glomerular mesangial cells:involvement of the transforming growth factor－β system ［J］.Kidney Int.1998，53(3):631－636.

［6］朱榮寬，李靖.中醫(yī)藥防治糖尿病腎病研究進(jìn)展［J］.中國(guó)社區(qū)醫(yī)師雜志，2011，30(13):199.

［7］李偉民，徐 魁，余亞娟，等.TGF－β1在糖尿病腎病中的含量檢測(cè)［J］.咸寧學(xué)院學(xué)報(bào) (醫(yī)學(xué)版)，2004，18(1):30－32.

［8］Chen S，Hong SW，Iglesias－de la Cruz MC，et al.The key role of the transforming growth factor－beta system in the pathogenesis of diabetic nephropathy［J］.Renal Fail，2001，23:471.