劉長(zhǎng)明，陸月華，郭龍軍，危艷武

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所、獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/豬傳染病研究室，黑龍江哈爾濱 150001）

豬圓環(huán)病毒疫苗的研究進(jìn)展

劉長(zhǎng)明，陸月華，郭龍軍，危艷武

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所、獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/豬傳染病研究室，黑龍江哈爾濱 150001）

豬圓環(huán)病毒2型(PCV2）主要引起以患豬全身性淋巴結(jié)腫大為特征的多系統(tǒng)功能衰竭性疾病，臨床上表現(xiàn)為斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、豬皮炎與腎炎綜合征、豬呼吸道疾病綜合征、母豬繁殖障礙、壞死性淋巴結(jié)炎、肉芽腫性腸炎和滲出性表皮炎等，統(tǒng)稱為豬圓環(huán)病毒病。本病于1991年在加拿大被發(fā)現(xiàn)，相繼北美、歐洲、亞洲等幾乎所有養(yǎng)豬國(guó)家均有本病流行的報(bào)道。由于PCV2與其他多種病原混合感染情況不盡相同，豬群發(fā)病后死亡率不等，較嚴(yán)重的地區(qū)暴病時(shí)死淘率高達(dá)40%，被公認(rèn)為繼豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）之后，新發(fā)豬的重要傳染病。我國(guó)豬群中PCV2感染十分普遍，流行病學(xué)調(diào)查表明，PCV2抗體陽(yáng)性率高達(dá)80%以上，被調(diào)查的豬場(chǎng)陽(yáng)性率達(dá)100%，尚未發(fā)現(xiàn)有抗體陰性豬場(chǎng)存在。PCV2感染途徑主要以糞口為主，病毒先定殖于扁桃體，隨血流進(jìn)入周身淋巴結(jié)。在淋巴細(xì)胞中大量繁殖擴(kuò)增，形成了不同程度的病毒血癥。當(dāng)病毒滴度高時(shí)，往往血清抗體滴度較低，臨床上就會(huì)呈現(xiàn)明顯的發(fā)病癥狀。大部分豬只在病毒感染后幾周內(nèi)會(huì)刺激產(chǎn)生高水平的抗體，抗體能夠?qū)⒉《究乖泻?，臨床上表現(xiàn)為耐過(guò)康復(fù)。

一、PCV2的臨床表現(xiàn)

根據(jù)病毒感染不同階段豬后表現(xiàn)的臨床癥狀有所不同，主要分為以下四種。

1.斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征。發(fā)生于5～12周齡保育豬，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性消瘦、呼吸急促、呼吸困難、黃疸、下痢、皮膚蒼白和中樞神經(jīng)失調(diào)等癥狀。病理變化為全身淋巴結(jié)腫大，淋巴器官的肉芽腫性炎癥和不同程度的淋巴細(xì)胞缺失，解剖還可見(jiàn)肺斑點(diǎn)狀出血。

2.豬皮炎腎病綜合征。發(fā)生于2～4月齡生長(zhǎng)豬，臨床表現(xiàn)為多處局限性微凸出的暗紅色病灶，此后迅速發(fā)熱，直腸溫度可達(dá)41℃以上，出現(xiàn)皮下水腫、厭食、體重減輕和抑郁等。通常病豬在3 d內(nèi)死亡，死亡率約為20%。病理變化主要為出血性壞死性皮炎和動(dòng)脈炎以及滲出性腎小球腎炎和間質(zhì)性腎炎，出現(xiàn)腹水和心包積液。常與斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征同時(shí)爆發(fā)。

3.豬呼吸道疾病綜合征。發(fā)生于16～22周齡生長(zhǎng)豬和育肥豬，臨床表現(xiàn)為生長(zhǎng)遲緩、飼料利用率下降、嗜睡、厭食、發(fā)熱、咳嗽和呼吸困難。組織病理學(xué)變化有支氣管間質(zhì)性肺炎，表現(xiàn)肺部廣泛性的肉芽腫性炎癥。

4.母豬繁殖障礙。臨床表現(xiàn)為妊娠母豬流產(chǎn)、死產(chǎn)、木乃伊胎增多、斷乳前死亡率上升。多數(shù)在妊娠晚期流產(chǎn)和娩出接近成熟的死胎或早產(chǎn)仔豬；在妊娠中期也會(huì)出現(xiàn)流產(chǎn)、木乃伊胎兒和早期胚胎死亡。病毒感染母豬受胎率降低或不孕，斷奶前仔豬死亡率上升達(dá)10%以上，以垂直傳播方式傳播。

二、流行毒株變異

大量的流行病學(xué)研究表明，我國(guó)豬群中PCV2感染十分普遍。劉長(zhǎng)明等（2007）采用免疫過(guò)氧化物酶單層細(xì)胞染色試驗(yàn)（IPMA）方法，對(duì)來(lái)自黑龍江、吉林、河北、上海、內(nèi)蒙、云南、江西等地豬場(chǎng)健康成年豬血清480份和發(fā)病豬血清424份進(jìn)行了檢測(cè)，抗體陽(yáng)性率分別為91.7%和79.2%，送檢樣品的12個(gè)豬場(chǎng)均為陽(yáng)性，表明PCV2在我國(guó)豬群中感染率非常嚴(yán)重。盡管PCV2抗體陽(yáng)性檢測(cè)率較高，但各豬場(chǎng)的發(fā)病率與死亡率差異較大，主要?dú)w因于豬場(chǎng)飼養(yǎng)技術(shù)水平不同，豬群中PCV2與混合感染的病原種類有很大關(guān)系。對(duì)發(fā)病豬場(chǎng)送檢的病料檢測(cè)，PCV2陽(yáng)性樣品中多數(shù)與高致病PRRSV變異株混合感染，在保育階段仔豬死亡率達(dá)50%以上。范培虎等用發(fā)生高熱癥豬場(chǎng)分離的PCV2和PRRSV變異毒株進(jìn)行本動(dòng)物感染試驗(yàn)，試驗(yàn)分為單獨(dú)感染PCV2、PRRSV，兩種病毒同時(shí)或先后順序感染組。PCV2、PRRSV單獨(dú)感染組與混感感染組對(duì)比，后者出現(xiàn)更為嚴(yán)重的臨床癥狀，先感染PRRSV一周后再感染PCV2試驗(yàn)組，出現(xiàn)了高達(dá)60%的死亡率，基本能夠再現(xiàn)發(fā)病豬場(chǎng)的狀況。這些研究表明，目前在我國(guó)豬群中，PCV2與PRRSV混合感染是造成養(yǎng)豬業(yè)嚴(yán)重?fù)p失的主要原因。郭龍軍等（2009）對(duì)我國(guó)10個(gè)省份不同地區(qū)送檢的90份病料中分離到19株P(guān)CV2流行毒株。通過(guò)病毒基因組克隆和測(cè)序，將19株病毒分為2個(gè)大基因群和3個(gè)亞群：PCV2a、PCV2b、PCV2d；其基因組構(gòu)成依次為1766nt、1767nt和1768nt，各占15.8%、73.7%和10.5%。若以1767nt毒株為基準(zhǔn)，其第39或1039位有1個(gè)堿基缺失后突變成1766nt毒株；第1040位有1個(gè)堿基插入后突變成1768nt毒株。對(duì)19株病毒ORF2編碼的Cap蛋白分析發(fā)現(xiàn)，有4株病毒編碼基因發(fā)生了突變，出現(xiàn)了705nt和708nt兩種突變型，使ORF2編碼的Cap蛋白C末端分別有1和2個(gè)氨基酸延伸。研究表明，我國(guó)豬群中流行的PCV2以PCV2b亞型流行毒株為主。Harding等分別用PCV2a和PCV2b亞型毒株接種試驗(yàn)豬，證明兩種類型毒株在毒力上無(wú)明顯差異。

三、國(guó)外PCV2疫苗

國(guó)外對(duì)PCV2做了大量研究，Blanchard等對(duì)PCV2基因疫苗與滅活疫苗的免疫效力進(jìn)行了比較，證明基因疫苗可誘導(dǎo)機(jī)體免疫保護(hù)，單獨(dú)用PCV2基因疫苗2次免疫的效果低于滅活疫苗，滅活疫苗能完全抑制PCV2的增殖。Fenaux等用滅活苗免疫豬可刺激產(chǎn)生特異性抗體，減少病毒血癥的發(fā)生，有效地阻止肺部病變。國(guó)外商品化疫苗中，勃林格殷格翰公司研制的PCV2亞單位疫苗，將PCV2 ORF2基因插入到昆蟲(chóng)桿狀病毒，用昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)獲得的重組PCV2 Cap蛋白制備亞單位疫苗；該疫苗免疫組豬平均死亡率為2.4%，對(duì)照組死亡率為9.5%。先靈葆雅公司研制的PCV2滅活疫苗，在加拿大22個(gè)豬場(chǎng)進(jìn)行的多中心隨機(jī)試驗(yàn)，在保育和肥育期未接種疫苗對(duì)照組平均死亡率為9.3%，疫苗免疫組為2.1%。法國(guó)梅里亞公司研制的PCV2全病毒滅活苗用于母豬免疫，在多個(gè)國(guó)家試驗(yàn)表明，疫苗免疫母豬群獲得了群體性免疫力，仔豬可從初乳中獲得母源抗體，在5周內(nèi)能夠有效預(yù)防PCV2感染。美國(guó)富道公司開(kāi)發(fā)的Suvaxvn PCV1/PCV2重組滅活疫苗，在6個(gè)豬場(chǎng)臨床試驗(yàn)，在生長(zhǎng)/肥育期未接種疫苗對(duì)照組平均死亡率為7.7%，疫苗免疫組死亡率為1.8%?？傊瑖?guó)外研制的PCV2疫苗均取得良好免疫效果，疫苗售價(jià)也十分昂貴，每頭份達(dá)5～10美元。

四、國(guó)產(chǎn)PCV2疫苗的研制

我國(guó)對(duì)PCV2疫苗研究起步較晚，一直沒(méi)有商品化疫苗問(wèn)世。針對(duì)該病的流行態(tài)勢(shì)及危害的嚴(yán)重性，盡快研制出適合國(guó)情的疫苗非常必要，市場(chǎng)需求十分迫切。鑒于PCV2基因組構(gòu)成簡(jiǎn)單，病毒變異幅度較小，通過(guò)細(xì)胞傳代很難達(dá)到完全致弱，且弱毒疫苗容易造成因毒力反強(qiáng)引起疫病再流行。滅活苗是經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)大量增殖病毒，加入滅活劑將病毒殺死，具有安全性好、便于貯存運(yùn)輸和抗母源抗體干擾等優(yōu)點(diǎn)。此外，當(dāng)今人們更加關(guān)注能夠設(shè)計(jì)出一種具有帶有分子標(biāo)識(shí)的疫苗，隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，采用感染性分子克隆技術(shù)構(gòu)建標(biāo)記毒株成為可能。PCV2感染細(xì)胞不易產(chǎn)生致細(xì)胞病變，常規(guī)病毒學(xué)操作很難達(dá)到病毒克隆純化，構(gòu)建PCV2感染性分子克隆獲得具有分子標(biāo)識(shí)的毒株，為疫苗毒株與野生毒株間的鑒別診斷奠定了基礎(chǔ)。我們采用國(guó)內(nèi)自行分離的毒株，采用感染性分子克隆技術(shù)獲得了具有分子標(biāo)記毒株作為毒種，經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)傳代，培育成功一株體外培養(yǎng)適應(yīng)毒株，對(duì)病毒繁殖規(guī)律、毒價(jià)測(cè)定、血清學(xué)檢測(cè)、形態(tài)學(xué)鑒定、核酸序列分析、動(dòng)物感染模型、疫苗生產(chǎn)工藝、佐劑篩選、動(dòng)物免疫安全性及免疫效力等進(jìn)行了系統(tǒng)試驗(yàn)，研制成功我國(guó)首例PCV2滅活疫苗，種毒獲得國(guó)家發(fā)明專利，疫苗獲得國(guó)家二類新獸藥證書，并轉(zhuǎn)讓給兩家企業(yè)投入生產(chǎn)。為配合疫苗免疫效果評(píng)價(jià)，研制成功配套血清抗體檢測(cè)試劑盒。該成果為我國(guó)有效防控本病的流行提供了技術(shù)手段。本成果擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)，屬于原始創(chuàng)新。

五、國(guó)產(chǎn)疫苗特點(diǎn)

國(guó)產(chǎn)疫苗采用無(wú)PCV1豬腎傳代細(xì)胞系培養(yǎng)增殖病毒，病毒液經(jīng)甲醛溶液滅活后，與進(jìn)口佐劑混合乳化而成，用于預(yù)防PCV2感染豬只引起的相關(guān)疾病。研制的疫苗具有如下特點(diǎn)。(1）構(gòu)建的感染性分子克隆毒株，在基因組內(nèi)插入了一個(gè)分子標(biāo)簽，可用PCR-RFLP與野生型毒株相鑒別。(2）疫苗毒株經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)傳60代，繁殖性能穩(wěn)定，毒價(jià)達(dá)106.6 TCID50/ml，制備的疫苗抗原含量高。(3）病毒滅活后排除了再感染靶動(dòng)物的能力，安全性好。(4）采用進(jìn)口的水包油劑型佐劑，接種后刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體快、效價(jià)高。(5）疫苗對(duì)任何品種、年齡的健康豬群接種后無(wú)任何毒副作用。（6）疫苗免疫豬攻毒保護(hù)率達(dá)96%以上，免疫期為6個(gè)月。（7）疫苗抗母源抗體干擾強(qiáng)，不受母源抗體的影響，能夠完全抵抗病毒感染。（8）臨床應(yīng)用效果顯著，在全國(guó)175個(gè)規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)推廣應(yīng)用統(tǒng)計(jì)，沒(méi)有1個(gè)豬場(chǎng)出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，平均死亡率降低8%，平均出欄率提早5～7 d，藥物使用量減少30%，每頭豬節(jié)約成本50元。（9）與進(jìn)口疫苗對(duì)比，主要性能指標(biāo)相當(dāng)，售價(jià)僅為進(jìn)口產(chǎn)品1/3，為養(yǎng)豬業(yè)節(jié)約大量疫苗費(fèi)用。（10）配套的血清抗體檢測(cè)診斷試劑盒，為疫苗免疫效果評(píng)價(jià)提供了手段。

略）