包新奇，陳昌海，程雷，高升，徐正軍，徐小艷， 劉耀興，李百忠，陳建英.3，張晨飛

（1.江蘇省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，江蘇南京 210036；2.江蘇省如皋市畜牧獸醫(yī)站，江蘇如皋 226572；3.拉薩市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，西藏拉薩 850000）

高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗（TJM～92株）免疫效果與安全性試驗(yàn)報(bào)告

包新奇1，陳昌海1，程雷1，高升1，徐正軍1，徐小艷1， 劉耀興1，李百忠2，陳建英1.3，張晨飛1

（1.江蘇省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，江蘇南京 210036；2.江蘇省如皋市畜牧獸醫(yī)站，江蘇如皋 226572；3.拉薩市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，西藏拉薩 850000）

目前我國(guó)控制高致病性豬藍(lán)耳病主要采取以疫苗免疫為主的綜合性防控措施，并將高致病性豬藍(lán)耳病列為強(qiáng)制免疫的4個(gè)疫病之一。為了解高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗（TJM-92株）免疫效果與安全性，我們開展了該活疫苗的有關(guān)試驗(yàn)，現(xiàn)將試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告如下。

一、材料與方法

（一）試驗(yàn)用疫苗高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗（TJM-92株），生產(chǎn)批號(hào)2010005，生產(chǎn)日期2010-02-06，由新疆天康畜牧生物技術(shù)有限公司提供。

（二）試驗(yàn)用豬試驗(yàn)在江蘇省如皋市某豬場(chǎng)進(jìn)行，隨機(jī)選擇3～4周齡仔豬160頭。

（三） 試劑

1.豬藍(lán)耳病抗體檢測(cè)。豬藍(lán)耳病抗體檢測(cè)ELISA試劑盒，批號(hào)40959-4201，有效期2011.6.30，由美國(guó)IDEXX公司提供。

2.高致病性豬藍(lán)耳病病原檢測(cè)。豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Nsp2 1594～1680變異株）RTPCR檢測(cè)試劑盒，批號(hào)20100806P，由北京世紀(jì)元亨公司提供。

（四）試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.疫苗免疫效果試驗(yàn)。隨機(jī)選擇3～4周齡仔豬40頭，按使用說明書劑量，頸部肌肉注射30頭，1頭份/頭，耳標(biāo)標(biāo)號(hào)，同時(shí)設(shè)對(duì)照組10頭，不接種疫苗，耳標(biāo)標(biāo)號(hào)。免疫前采集試驗(yàn)組豬血清20份，對(duì)照組豬血清6份，用于檢測(cè)高致病性豬藍(lán)耳病病原和抗體。免疫后14天、28天、2個(gè)月、3個(gè)月、4個(gè)月，分別采集試驗(yàn)組20份豬血清和對(duì)照組6份豬血清，檢測(cè)高致病性豬藍(lán)耳病免疫抗體，進(jìn)行免疫效果評(píng)價(jià)試驗(yàn)。

2.疫苗安全性試驗(yàn)。隨機(jī)選擇3～4周齡仔豬10頭，按使用說明書劑量的10倍量（10頭份/頭）頸部肌肉注射，耳標(biāo)標(biāo)號(hào)。免疫后觀察21 d，觀察內(nèi)容包括全身皮膚、精神狀況、食欲、體溫及注射局部反應(yīng)等，進(jìn)行安全性試驗(yàn)。

3.疫苗普免試驗(yàn)。隨機(jī)選擇3～4周齡仔豬100頭，按使用說明書劑量，頸部肌肉注射，1頭份/頭，耳標(biāo)標(biāo)號(hào)。免疫后觀察21 d，觀察內(nèi)容包括全身皮膚、精神狀況、食欲、體溫及注射局部反應(yīng)等，進(jìn)行普免試驗(yàn)。

（五）試驗(yàn)方法

1.豬藍(lán)耳病血清抗體檢測(cè)。采用豬藍(lán)耳病抗體檢測(cè)ELISA試劑盒檢測(cè)PRRS抗體，主要操作步驟與結(jié)果判定如下：

⑴ 取出抗原包被板，在記錄表上記錄樣本的位置。

⑵ 在C1、D1的 PRRS孔和C2、D2的NHC孔內(nèi)分別加入 100μl 沒有稀釋的陰性對(duì)照。在 A1、B1的 PRRS孔和 A2，B2 的 NHC孔內(nèi)分別加入100μl 沒有稀釋的陽(yáng)性對(duì)照。

⑶ 在相鄰的 PRRS 和 NHC 孔內(nèi)分別加入100μl 按1：40稀釋好的樣本。所有樣品均按此原則加 2孔。

⑷ 室溫下孵育30 min。

⑸ 吸取各孔的液體棄入廢液筒。用大約300μl 磷酸緩沖洗滌液洗滌板孔，重復(fù) 3～5 次。每次洗滌后應(yīng)吸去孔內(nèi)的液體。注意應(yīng)避免包被板孔干燥。在最后一次洗滌液吸去后，將每塊板中殘留的洗滌液扣拍到吸水材料上。

圖1 接種疫苗后豬群體血清抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)情況

圖2 免疫后不同時(shí)間豬群抗體陽(yáng)性率的變化情況

⑹ 每孔加入100μl 辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗豬抗體。

⑺ 室溫下孵育30 min。

⑻ 重復(fù)步驟“⑸”。

⑼ 每孔加入100μl TMB 底物液。

⑽ 室溫下孵育15 min。

⑾ 每孔加入100μl 終止液，使反應(yīng)終止。

⑿ 測(cè)量并且記錄樣本和對(duì)照的 A(650），計(jì)算結(jié)果。

⒀ 結(jié)果判定：①如果 S/P 值低于0.4，樣品判定為 PRRS 抗體陰性；②如果 S/P 值大于或等于 0.4，樣品判定為 PRRS 抗體陽(yáng)性。

2.高致病性豬藍(lán)耳病病原檢測(cè)。采用豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Nep2 1594～1680變異株）RTPCR檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，主要操作步驟與結(jié)果判定如下。

⑴ 樣品處理：每份樣品分別處理。

組織樣品：稱取組織樣品0.05 g研磨后加1.5 ml生理鹽水繼續(xù)研磨，轉(zhuǎn)至1.5 ml滅菌離心管中，8 000 rpm離心2 min，取上清100 ul于1.5 m滅菌離心管中。

全血樣品：待血凝后離心取血清100 ul，置1.5 ml滅菌離心管中。

陽(yáng)性對(duì)照：取陽(yáng)性對(duì)照100 ul，置1.5 ml 滅菌離心管中。

陰性對(duì)照：取陰性對(duì)照100 ul，置1.5 ml 滅菌離心管中。

⑵ 病毒RNA提?。喝∫烟幚淼臉悠芳瓣?、陽(yáng)性對(duì)照，分別加入裂解液600 ul，充分顛倒混勻，室溫靜置3～5 min。

將液體吸入吸附柱中，13 000 rpm離心30 s，棄去收集管中液體，套上收集管。向吸附柱中加入600 ul洗液，13 000 rpm離心30 s，棄去收集管中液體，套上收集管。

再次向吸附柱中加入600 ul洗液，13 000 rpm離心30 s，棄去收集管中液體，套上收集管。再空柱離心2 min。

將吸附柱移入新的1.5 ml離心管中，在膜中央加入洗脫液25 ul，室溫靜置1 min，13 000 rpm離心30s，棄去吸附柱，獲得總RNA備用。

⑶ RT～PCR操作程序

每 份 總 體 積20 uL， 含16.8 uL RT～PCR反 應(yīng) 液，1.2 uL 酶混合液，2 uL 模板RNA。

在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行以下程序：42℃ 45 min，94℃ 3 min；擴(kuò)增條件為 94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。

⑷ 電泳：在電泳槽內(nèi)放好梳子，倒入瓊脂糠凝膠，待凝固后將PCR產(chǎn)物10 ul點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠孔中，以110～120 V電壓于50倍稀釋的TAE電泳緩沖液中電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。

⑸ 結(jié)果判定：陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)278 bp擴(kuò)增帶、陰性對(duì)照無帶出現(xiàn)時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立。被檢樣品出現(xiàn)278 bp擴(kuò)增或200 bp擴(kuò)增為豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Nsp21594～1680變異株）陽(yáng)性，否則為陰性。

二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.高致性豬藍(lán)耳病病原檢測(cè)結(jié)果。疫苗免疫前，試驗(yàn)豬和對(duì)照豬經(jīng)高致病性豬藍(lán)耳病病原RT～PCR檢測(cè)，均為陰性。

2.疫苗安全性試驗(yàn)結(jié)果。按疫苗使用說明書劑量的10倍量接種后，觀察21 d，所有豬只精神、食欲、體溫均正常，注射局部無不良反應(yīng)，表明該疫苗安全性好。

3.疫苗免疫試效果試驗(yàn)。

⑴免疫后不同時(shí)間檢測(cè)豬群血清轉(zhuǎn)陽(yáng)情況，見圖1。由圖1可知，活疫苗免疫后14天群體即有血清抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)豬只出現(xiàn)，隨后豬群血清抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)逐漸增多，S/P值也隨之增大；至90天時(shí)S/P值平均值達(dá)最大，120天時(shí)仍維持在2.15。

⑵免疫后不同時(shí)間豬群抗體陽(yáng)性率的變化情況，見圖2。由圖2可知，豬群免疫后14天，群體抗體陽(yáng)性率為50%，以后陽(yáng)性率逐漸增高，到90天時(shí)達(dá)100%，120天時(shí)仍維持在100%的抗體陽(yáng)性率，說明疫苗免疫效果好，抗體陽(yáng)性率維持時(shí)間長(zhǎng)。

三、討論

1.本試驗(yàn)使用IDEXX公司生產(chǎn)的PRRS抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)疫苗免疫后血清抗體水平，其S/P值的高低可以反映血清抗體的水平，進(jìn)而反映疫苗免疫效果。由血清抗體檢測(cè)結(jié)果可知，該活疫苗免疫后14 d即可檢測(cè)出血清抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)，說明該疫苗免疫抗體產(chǎn)生快，而且隨后S/P值不斷增加，說明血清抗體濃度不斷增加，到90 d時(shí)，S/P值達(dá)2.31，這時(shí)抗體效價(jià)最高，至120天時(shí)，S/P值仍為2.15。說明高濃度血清抗體維持時(shí)間長(zhǎng)，疫苗免疫效果好。

2.血清抗體陽(yáng)性率是反應(yīng)疫苗免疫后群體抗體狀態(tài)的一個(gè)重要數(shù)據(jù)，群體血清抗體陽(yáng)性率高，維持時(shí)間越長(zhǎng)，說明疫苗免疫效果越好，本次試驗(yàn)結(jié)果同樣說明該疫苗免疫效果好。

3.疫苗的安全性試驗(yàn)說明該疫苗對(duì)3～4周齡仔豬安全。

4.根據(jù)本次試驗(yàn)結(jié)果，仔豬到育肥豬推薦的免疫程序如下：仔豬3～4周齡接種，1頭份/頭，至肥豬5個(gè)月出欄。

（略）