蘇松坤， 晏勵(lì)民， 劉 芳

（浙江大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058）

乳酸菌包括大量革蘭氏陽性球菌和桿菌，在發(fā)酵食品的生產(chǎn)和保存中廣泛應(yīng)用。由于乳酸菌是安全級(jí)食品，所以大量的菌在基因水平上都進(jìn)行了修飾，并且通過克隆技術(shù)介入特定的基因來改善乳酸菌本身的性狀，但是，傳統(tǒng)乳酸菌表達(dá)外源蛋白的效率仍然比較低。同時(shí)，目前報(bào)道的乳酸菌表達(dá)載體系統(tǒng)所使用的選擇標(biāo)記均是抗生素抗性基因，而抗藥性基因?qū)⒉粩嘞颦h(huán)境中漂移擴(kuò)散，這對(duì)生物安全性造成了嚴(yán)重危害[1]。鑒于傳統(tǒng)乳酸菌基因表達(dá)系統(tǒng)的上述弊端，國內(nèi)外學(xué)者一直致力于獲取高效且對(duì)人和動(dòng)物無毒副作用的表達(dá)系統(tǒng)，也就是所謂的食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)。早在1987年，Willem就提出了乳酸菌的選擇標(biāo)記必須采用食品級(jí)這一觀點(diǎn)[2]，之后，乳酸菌食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)作為高效而安全的表達(dá)系統(tǒng)得到了廣泛的應(yīng)用。作者就乳酸菌食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)在食品、醫(yī)學(xué)、保健品上的應(yīng)用的最新進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

1 乳酸菌食品級(jí)基因表達(dá)系統(tǒng)必須具備的基本條件

1.1 表達(dá)載體必須是食品級(jí)

乳酸菌食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)所使用的載體必須是食品級(jí)的，不能含有非食品級(jí)功能性DNA片段。長久以來，人們構(gòu)建了大量具有抗生素抗性標(biāo)記的載體用于乳酸菌基因水平上的修飾。但由于抗生素抗性基因存在安全隱患，許多用于乳酸菌的食品級(jí)選擇標(biāo)記已經(jīng)發(fā)展起來，這些選擇標(biāo)記是基于生物的天然性質(zhì)，如糖發(fā)酵、氨基酸代謝、核苷酸生物合成和細(xì)菌的免疫抗性[3]。同時(shí)，一些基于環(huán)境壓力的新的選擇標(biāo)記也得到開發(fā)，如熱休克蛋白、金屬抗性基因和細(xì)菌素抗性基因。Yin Sheng等采用膽汁鹽水解酶基因構(gòu)建了乳酸菌的食品級(jí)表達(dá)載體[4]。在研究中，將能夠耐受壓力和可進(jìn)行安全選擇的表達(dá)載體系統(tǒng)應(yīng)用于食品工業(yè)，得名為“食品級(jí)”表達(dá)載體[2]。

1.2 宿主乳酸菌必須是食品級(jí)微生物

構(gòu)建的“食品級(jí)”表達(dá)載體必須要轉(zhuǎn)化到宿主菌中才能發(fā)揮功能，所以轉(zhuǎn)化表達(dá)載體的宿主菌也必須具備生物安全性，我們一般都使用安全的、遺傳背景清楚且穩(wěn)定的食品級(jí)微生物，如乳酸乳球菌（Lactococcus.lactis）、乳酸桿菌（Lactobacillus）及其它已經(jīng)在食品工業(yè)中得到長期而廣泛應(yīng)用的菌類?？梢允褂孟冗M(jìn)的分類方法對(duì)宿主菌進(jìn)行鑒定，并通過適當(dāng)?shù)姆肿由飳W(xué)手段闡明表達(dá)宿主的遺傳組成，如核苷酸測序、PCR擴(kuò)增、DNA雜交等技術(shù)。此外，該宿主菌在生理狀況下，要能夠穩(wěn)定在食品中定植或進(jìn)入人和動(dòng)物的消化道，并且能順利通過消化道的各種理化因素和酶屏障[5]。

1.3 表達(dá)所使用的誘導(dǎo)物必須是食品級(jí)

乳酸菌的表達(dá)系統(tǒng)按照基因組內(nèi)啟動(dòng)子的類型可以分為組成型表達(dá)系統(tǒng)（Constitutive expression system）和誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)（Controlled/inducible expression system）。在乳酸菌中大量的蛋白質(zhì)生產(chǎn)已經(jīng)通過乳酸乳球菌組成型的啟動(dòng)子獲得[2]。但是連續(xù)的高產(chǎn)量表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的積累、聚集甚至蛋白質(zhì)的沉淀，這些都對(duì)細(xì)胞有害。為解決這些問題，研究了誘導(dǎo)型表達(dá)的啟動(dòng)子，通過這些啟動(dòng)子，基因表達(dá)可以被誘導(dǎo)物、抑制物、環(huán)境因素控制，比如pH、溫度和離子濃度[2]。乳酸菌食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)中所使用的誘導(dǎo)物必須是食品級(jí)的，如乳糖、蔗糖、嘌呤、嘧啶、乳鏈菌肽等可被人食用的物質(zhì)[5]都能用來做誘導(dǎo)物。

2 乳酸菌食品級(jí)表達(dá)和標(biāo)記系統(tǒng)

2.1 利用乳糖作為選擇標(biāo)記的表達(dá)系統(tǒng)

乳糖是一類常用的食品級(jí)選擇標(biāo)記。MacCormick等首先將實(shí)驗(yàn)菌株L.1actis MG5276的質(zhì)粒敲除，然后將完整的乳糖操縱子整合到其染色體上，通過雙交換使lacF基因失活，結(jié)果該菌株喪失了利用乳糖的能力（Lac-）。之后再將克隆有l(wèi)acF基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)到上述菌株中，該菌株恢復(fù)了利用乳糖的能力（Lac+）[6]。 Platteeuw 等將大腸桿菌（E.coli）中的β-葡糖醛酸酶基因（gusA）克隆到L.1actis乳糖操縱子lacA啟動(dòng)子的下游，然后轉(zhuǎn)到缺失受體菌中，轉(zhuǎn)化后該菌能夠利用乳糖[7]，證明了乳糖可以作為一種有效的選擇標(biāo)記。此外，Takala等構(gòu)建了以乳糖合成酶為選擇標(biāo)記的乳酸菌表達(dá)載體，并命名為PLEB600[8]。

2.2 Nisin誘導(dǎo)的食品級(jí)基因表達(dá)系統(tǒng)

Nisin是由乳酸乳球菌產(chǎn)生的一種小分子抗菌肽，由34個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量為3 510。Nisin對(duì)人體無毒副作用，進(jìn)入消化道后被其中的蛋白酶作用從而失活，不會(huì)影響腸道的菌群平衡。FAO/WHO于1969年接受Nisin作為一種食品添加劑，現(xiàn)在Nisin已作為一種天然防腐劑在食品工業(yè)廣泛使用。Nisin的以上特性決定了它可以作為一種食品級(jí)誘導(dǎo)物在食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)中誘導(dǎo)異源蛋白的表達(dá)。

在Nisin自動(dòng)調(diào)節(jié)過程中，Nisin通過一個(gè)典型的兩組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)誘導(dǎo)了生物合成基因簇的轉(zhuǎn)錄，包括組氨酸蛋白激酶nisK和反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白nisR[9]。當(dāng)Nisin誘導(dǎo)了NisK，NisK發(fā)生自動(dòng)磷酸化并且進(jìn)一步將磷基團(tuán)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)的反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白nisR，nisR起到激活轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子nisA/F的作用，并且誘導(dǎo)基因表達(dá)[10]。

基于Nisin生物合成的自動(dòng)調(diào)節(jié)機(jī)制，de Ruyter等在1996年構(gòu)建了NICE系統(tǒng)[11]。nisA啟動(dòng)子被分離用于構(gòu)建質(zhì)粒，nisR和nisK基因被結(jié)合到合適的宿主菌的染色體上，當(dāng)一個(gè)基因被克隆到一個(gè)質(zhì)粒的PnisA基因下游并轉(zhuǎn)化到含NisinRK基因的菌中，克隆基因的表達(dá)可以被Nisin的加入而激活，Nisin首先誘導(dǎo)PnisA的轉(zhuǎn)錄，接著啟動(dòng)基因表達(dá)。通過雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)，表達(dá)基因的產(chǎn)物會(huì)在細(xì)胞中累積，也可以被分泌到細(xì)胞外，這依賴于構(gòu)建過程中一個(gè)信號(hào)序列的存在與否[12]。許多報(bào)道證明了NICE系統(tǒng)在LAB中表達(dá)異源蛋白的多功能性和高效性[12-13]，其誘導(dǎo)效率可超過1 000倍以上[14]。

2.3 其它常用的食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)

以鹽為誘導(dǎo)物的表達(dá)系統(tǒng)也較為常用。Sanders等分離了一個(gè)氯化鹽誘導(dǎo)型乳酸乳球菌啟動(dòng)子，并采用缺失作圖、核苷酸序列分析和引物延伸鑒定了這個(gè)鹽誘導(dǎo)啟動(dòng)子，并用該啟動(dòng)子成功表達(dá)了乳酸乳球菌Cre重組酶[15]。

利用乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)乳酸，發(fā)展了pH誘導(dǎo)的表達(dá)系統(tǒng)。從乳酸乳球菌中分離到受pH調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子（P170）受低 pH、低溫等因子的正調(diào)節(jié)[5]。Madsen等對(duì)其進(jìn)行了缺失突變，結(jié)果使P170的pH誘導(dǎo)作用提高150倍[16]。

此外，嘌呤、細(xì)菌素、抗金屬離子和噬菌體等作為選擇標(biāo)記在乳酸菌食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)中也有一定程度的應(yīng)用[1]。

3 乳酸菌食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)的最新應(yīng)用

食品級(jí)乳酸菌系統(tǒng)因其高效表達(dá)的特點(diǎn)和應(yīng)用性強(qiáng)的特征，很多蛋白質(zhì)（酶、膜蛋白、細(xì)胞因子等）已經(jīng)在乳酸菌體內(nèi)得到表達(dá)應(yīng)用，而其中利用乳酸菌制成的微生態(tài)制劑是廣泛使用的保健品之一。LIU等將腸道菌素P基因通過食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)在乳酸球菌中進(jìn)行細(xì)胞外異源表達(dá)，得到了與腸球菌LM-2中的天然腸道菌素P相同相對(duì)分子質(zhì)量、具有生物活性的腸道菌素P，標(biāo)志著食品級(jí)系統(tǒng)表達(dá)水平的顯著提高[17]。近些年，食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)活躍于生物、食品、醫(yī)藥等各個(gè)研究領(lǐng)域，從最初的少數(shù)的幾種宿主菌株及與其相適應(yīng)的質(zhì)粒載體，到現(xiàn)在品種豐富且高效的食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)，從之前數(shù)量有限的、常見的表達(dá)產(chǎn)物，到現(xiàn)在各種營養(yǎng)食品、醫(yī)藥用品的層出不窮的表達(dá)產(chǎn)物的出現(xiàn)，乳酸菌食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)正發(fā)揮著越來越重要的作用。Neuter等構(gòu)建了一種新的食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)—基于pSIP表達(dá)載體，以同源丙氨酸消旋酶基因作為選擇標(biāo)記，以胚芽乳桿菌為宿主菌的表達(dá)系統(tǒng)，這個(gè)新系統(tǒng)適用于食品工業(yè)的添加劑和成分生產(chǎn)[18]。食品級(jí)的乳酸菌工程菌在食品、生物制藥等領(lǐng)域的有著廣闊的應(yīng)用前景和商業(yè)價(jià)值。接下來，就乳酸菌食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)在食品、醫(yī)學(xué)和保健品上的最新應(yīng)用做一歸納。

3.1 乳酸菌食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)在食品上的應(yīng)用

GL Douglas等在L.acidopbilus染色體上插入編碼β-半乳糖苷酶的基因[19]，構(gòu)建了產(chǎn)β-半乳糖苷酶的菌株，該重組菌應(yīng)用于奶業(yè)生產(chǎn)中，提高了乳糖的水解率，從而提高了乳糖在人體中的吸收利用率，重組后的含風(fēng)味酶基因的乳酸菌在食品生產(chǎn)與加工中不僅可以改善食品風(fēng)味，還可以將一些合成營養(yǎng)物質(zhì)的基因?qū)肴樗峋w內(nèi)，生產(chǎn)出含高蛋白質(zhì)的營養(yǎng)食品。

在發(fā)酵牛奶和奶酪的生產(chǎn)中，乳酸乳球菌菌株是一種在經(jīng)濟(jì)上和科技上都非常重要的乳品前體培養(yǎng)物[20]。雷特氏乳酸球菌亞種MG1363是一種穿梭質(zhì)粒型菌株，在遺傳學(xué)和生理學(xué)等領(lǐng)域都有非常廣泛的應(yīng)用。該菌株中的dar基因是編碼二乙酰還原酶的基因，Karakas-Sen和Akyol將dar基因克隆在食品級(jí)表達(dá)載體pMG36e中。編碼二乙酰還原酶的基因在菌株MG1363中超表達(dá)，菌株新陳代謝的終產(chǎn)物在葡萄糖培養(yǎng)基上生長，從而獲得了二乙酰還原酶產(chǎn)物。而且，超表達(dá)dar基因的菌株和野生型菌株被用作奶酪生產(chǎn)中的前體培養(yǎng)物。與野生型菌株相比，在奶酪中發(fā)酵的兩個(gè)星期中可以檢測到不同水平的代謝終產(chǎn)物[21]。

3.2 乳酸菌食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用

乳酸菌能夠寄生于胃腸道，并被傳送至活體的黏膜水平，在人體臨床試驗(yàn)中證實(shí)，乳酸菌可以減輕腸炎等疾病，從而提供了使用這種菌來治療其他疾病的可能性[22]。乳酸菌的這些特性使其能夠成為一種良好的生產(chǎn)藥物蛋白的重組菌[23]。

孫強(qiáng)正等將Mn-SOD基因克隆至食品級(jí)表達(dá)載體Psh91中，將該載體轉(zhuǎn)入乳酸乳桿菌中，在重組菌L.lactis MBP71成功表達(dá)了錳超氧化物歧化酶[24]。SOD具有很強(qiáng)的抗氧化能力，目前已在化妝品、食品及保健品等領(lǐng)域應(yīng)用，并在一些疾?。ㄈ缒[瘤、炎癥、自身免疫性疾病以及輻射損傷等）的治療中顯示了良好的應(yīng)用前景[25]。而食品級(jí)乳酸菌的表達(dá)產(chǎn)物與傳統(tǒng)方法中以大腸桿菌為宿主菌的產(chǎn)物相比，不需要經(jīng)過復(fù)雜的純化過程就可以達(dá)到食品醫(yī)藥標(biāo)準(zhǔn)，為錳超氧化物歧化酶的應(yīng)用提供了更廣闊的空間。

從病原菌、病毒和寄生蟲中分離出來的許多抗原已經(jīng)在重組乳酸菌中生產(chǎn)出來[26-28]。最先構(gòu)建的生產(chǎn)疫苗的重組乳酸菌是乳酸乳球菌MG1363，來生產(chǎn)破傷風(fēng)毒素抗原[29]。從這之后就有了很多用不同種乳酸菌作為細(xì)胞工廠的例子，包括胚芽乳桿菌和干酪乳桿菌。兩項(xiàng)近期研究顯示，當(dāng)抗原通過重組乳酸菌表達(dá)，融合入樹突狀細(xì)胞靶向肽[30-31]，就可以測定增長的免疫力水平。嗜酸乳桿菌NCFM和加氏乳桿菌ATCC33323表達(dá)樹突狀細(xì)胞靶向肽，融合炭疽桿菌保護(hù)性抗原之后讓小鼠口服，提供小鼠100%的抗炭疽能力，清晰的顯示出與簡單的抗原呈遞（30%的抗炭疽能力）有明顯的差異[30-31]。

患有乳糖不耐癥的個(gè)體，在攝入乳糖之后往往會(huì)出現(xiàn)腹瀉癥狀，而β-半乳糖苷酶可以幫助機(jī)體更好地使用乳糖，促進(jìn)腸道菌株中的乳糖耐受性。Jingjie Li以乳糖不耐癥的小鼠為模型，將內(nèi)生的β-半乳糖苷酶基因克隆入乳酸乳桿菌MG1363菌株中，通過讓小鼠口服MG1363菌液來進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果顯示，在服用菌液之后的6 h內(nèi)，總排泄物質(zhì)量減少，腸道的運(yùn)動(dòng)性降低。這是乳酸菌食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)治療乳糖不耐癥的成功應(yīng)用[32]。

Gao等使用食品級(jí)表達(dá)載體在乳酸乳球菌NZ9000中功能性地表達(dá)小鼠胰島素類似物Ι類生長因子（IGF-I）。小鼠胰島素類似物Ι類生長因子編碼序列被插入食品級(jí)表達(dá)載體pLEB688，轉(zhuǎn)化進(jìn)入Lc.lactis NZ9000，通過SDS-PAGE和west blotting進(jìn)行分析和驗(yàn)證，證明該重組蛋白具有生物活性，促進(jìn)了NIH3T3的細(xì)胞增殖。小鼠胰島素類似物Ι類生長因子在乳酸菌中表達(dá)之后被植入培養(yǎng)基中，在終產(chǎn)物質(zhì)量濃度為100 ng/mL時(shí)，促進(jìn)NIH3T3細(xì)胞增殖的能力達(dá)到最佳水平[33]。

3.3 乳酸菌食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)在保健品上的應(yīng)用

乳酸菌在保健品方面的應(yīng)用主要是作為微生態(tài)制劑，微生物制劑中廣泛使用的益生菌就是乳酸菌。市場上用于微生態(tài)制劑的菌種（包括乳酸菌）大多數(shù)都是野生菌株，而野生菌株所含有的抗藥因子的轉(zhuǎn)移，將對(duì)經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和生態(tài)造成潛在的危害[34]。食品級(jí)乳酸菌不含有抗藥性因子，排除了野生菌株造成的潛在危害。張麗芳等采用標(biāo)準(zhǔn)藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法 （K-B法），以金黃色葡萄球菌ATCC25923作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，研究了15株乳酸球菌、14株乳酸桿菌、5株雙歧桿菌對(duì)8大類19種常用抗生素的敏感性，為研制益生菌食品級(jí)微生態(tài)制劑提供了科學(xué)依據(jù)[35]。乳酸菌微生態(tài)制劑能改善食物酸堿度、增加食欲、促進(jìn)消化代謝、增強(qiáng)免疫力、保護(hù)生態(tài)環(huán)境，具有良好的應(yīng)用前景。

4 展望

目前，多種食品級(jí)基因表達(dá)系統(tǒng)正在乳酸菌中建立起來，我們可以把一些與營養(yǎng)保健或疾病治療等相關(guān)的基因?qū)脒@種系統(tǒng)中制成制劑或疫苗，直接口服，從而簡化或免除了一般基因工程所需的復(fù)雜繁瑣的分離純化過程，為基因工程生產(chǎn)安全廉價(jià)的生物制品提供了一種新思路。

在蜂學(xué)研究領(lǐng)域，食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用還比較少，幾乎還是空白。但是其潛在的應(yīng)用價(jià)值還是值得我們研究和利用。蜂王漿中的主要王漿蛋白（Major Royal Jelly Proteins，MRJPs）占總蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的46%～89%，是蜂王漿的主要成分。研究表明，MRJPs是由同源性很高的一系列蛋白質(zhì)組成的蛋白質(zhì)家族，這一家族共有9個(gè)成員。大量實(shí)驗(yàn)證明，蜂王漿具有重要的醫(yī)療保健作用和生物學(xué)功能，這可能與王漿中的MRJPs密切相關(guān)[36]。因此，我們可以試圖將編碼王漿蛋白的基因?qū)肴樗峋称芳?jí)系統(tǒng)中，讓其在乳酸菌中獲得高效表達(dá)，這樣制成的乳酸菌食品不僅美味可口，而且極富營養(yǎng)價(jià)值。這樣也豐富了乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)在食品工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用。

鑒于乳酸菌誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的諸多優(yōu)勢，乳酸菌“食品級(jí)”高效表達(dá)載體系統(tǒng)無疑將在發(fā)酵工程和口服功能性生物制劑方面得到巨大的發(fā)展，乳酸工程菌及其表達(dá)產(chǎn)物可以應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、保健品和工業(yè)領(lǐng)域，有巨大的應(yīng)用前景和潛在的商業(yè)價(jià)值。

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