中國中醫(yī)科學(xué)院針灸研究所（0000）蔣瑾 張金鈴 張璐 宋曉晶 羅明富

煤炭醫(yī)院 （100028）晉志高2Δ

河南中醫(yī)學(xué) 院（450008） 李繼偉5

近年來，斑馬魚作為一種模式生物，已經(jīng)越來越受到國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界的重視。觀賞魚具有體積小、生殖周期短、體外受精且胚胎發(fā)育透明并且其基因與人類基因的相似度達(dá)到87%等特點(diǎn)。斑馬魚、錦鯉魚等觀賞魚不僅外觀漂亮，而且神經(jīng)解剖研究者通過DiA 等熒光標(biāo)記[1][2][3]觀察到發(fā)亮的熒光標(biāo)記物在神經(jīng)系統(tǒng)的分布規(guī)律，為針灸經(jīng)絡(luò)機(jī)理的研究提供了形態(tài)學(xué)依據(jù)。本文就斑馬魚、錦鯉魚、新月魚作為一種在針灸經(jīng)絡(luò)研究中的應(yīng)用做一探討。

1 斑馬魚、錦鯉魚、新月魚簡介

1.1 斑馬魚 生長于印度、巴基斯坦、孟加拉國等淡水河流中的一種硬骨魚（鯉魚）。成年魚全長4～6cm。因全身橫向分布著褐色斑馬線而得名。對(duì)斑馬魚的研究始于20 多年前，最早從事研究的是美國Oregon大學(xué)的Streisinger[4]等。據(jù)估計(jì)，斑馬魚基因組中約有3萬個(gè)基因，不僅數(shù)目與人類接近，而且它的許多基因與人類存在一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，因斑馬魚的胚胎透明，使其受到針灸經(jīng)絡(luò)和穴位研究者的重視。

1.2 錦鯉魚 錦鯉[2]學(xué)名 Cry prinus carpiod，生物學(xué)上屬于鯉科（Cy prinidae），世界各地均有野生魚種，但以亞洲的中國和日本為多，是由食用魚改良而來的觀賞魚品種。從比較胚胎學(xué)和進(jìn)化論的觀點(diǎn)看，人的胚胎發(fā)育早期的確有過類似魚的過程，不僅外形像魚一樣有鰓裂和尾，而且心臟也像魚一樣只有兩腔，因此，我們認(rèn)為，用錦鯉作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行穴位和經(jīng)絡(luò)研究，有充分的生物學(xué)依據(jù)。

1.3 新月魚 成年紅色新月魚體表延縱軸方向分布著若干條褐色條紋，全長4～6cm。

DiA [4-（4-Diethylaminostyryl）-NMethylpyridinium Iodide]是一種熒光親脂染料，它是體表感受器中毛細(xì)胞的特異性標(biāo)記物，同時(shí)也可以標(biāo)記神經(jīng)纖維。應(yīng)用DiA可以直接對(duì)處于正常生活狀態(tài)下的魚進(jìn)行活體染色和標(biāo)記，對(duì)動(dòng)物的傷害非常小，可以最大限度地保證動(dòng)物各器官組織的新鮮，具有其他熒光標(biāo)記物無法比擬的優(yōu)點(diǎn)，并且可以及時(shí)將完整的一條魚在熒光顯微鏡下直接進(jìn)行觀察，此方法不僅簡捷易操作，而且為我們能夠?qū)?dòng)物完整地進(jìn)行經(jīng)絡(luò)觀察，提供了形態(tài)學(xué)依據(jù)。

2 斑馬魚在疾病研究中的應(yīng)用

由于斑馬魚作為模式生物的眾多優(yōu)點(diǎn)和與脊椎動(dòng)物的相似性，斑馬魚已廣泛應(yīng)用于疾病的研究，包括腫瘤[5]、造血系統(tǒng)疾病、心血管疾病、眼科疾病、骨骼相關(guān)疾病、癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病、藥物成癮等[6][7][8]。斑馬魚腫瘤在基因組學(xué)和組織病理等方面與人類腫瘤高度相似[9][10]。斑馬魚的應(yīng)用進(jìn)一步揭示了人類腎臟疾病相關(guān)基因的功能以及分子間的相互作用，這將有利于我們進(jìn)一步闡明腎臟疾病發(fā)生的分 子機(jī)制[11]。隨著科學(xué)技術(shù)的日新月異，整條觀賞魚可使用尼康等光學(xué)顯微鏡直接進(jìn)行觀察，從而可進(jìn)一步利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，使綠色熒光蛋白在特異性組織或器官上表達(dá)，有利于檢測與觀察[12]。

3 斑馬魚、錦鯉魚、新月魚在針灸經(jīng)絡(luò)研究中的應(yīng)用

自中國中醫(yī)科學(xué)院針灸研究所在2006年成立以來[1][2][3]，先后用DiA熒光素對(duì)斑馬魚、新月魚、錦鯉魚進(jìn)行經(jīng)絡(luò)和穴位的專門研究，主要對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行了細(xì)致地觀察；毛細(xì)胞是魚類體表感受器的主要細(xì)胞成分，因此，本文中的熒光標(biāo)記物即體表感受器及與之相連的神經(jīng)纖維。

3.1 方法 首先將成年魚活體放入30uM DiA水溶液中3小時(shí)，之后經(jīng)10%乙醚麻醉，最后在熒光顯微鏡下觀察。

3.2 結(jié)果

3.2.1 斑馬魚體表感覺器官分布有一定的規(guī)律性：若干感覺器官聚集在一起形成簇，若干簇又有規(guī)律地沿軀體長軸排成線，類似于傳統(tǒng)經(jīng)絡(luò)與穴位。

3.2.2 在顯微鏡下，熒光標(biāo)記物（錦鯉魚體表感受器）呈亮圓點(diǎn)狀，若干標(biāo)記物聚集成簇，有規(guī)律地分布于體表各個(gè)部位。標(biāo)記物在眼周圍呈放射狀，并且沿鰓蓋前后緣有線性分布；在軀體部，標(biāo)記物沿身體長軸呈線性排列，錦鯉魚共約有14 條。長時(shí)間DiA浸染的錦鯉，在熒光鏡下還可辨清與感受器相連的神經(jīng)纖維走向。

3.2.3 新月魚體表感受器呈亮圓點(diǎn)狀，大多標(biāo)記物單個(gè)分布，部分成簇分布（2～5個(gè)/簇），并且有規(guī)律地分布于體表各個(gè)部位；若干簇又有規(guī)律地沿軀體長軸排成線，類似于傳統(tǒng)經(jīng)絡(luò)與穴位現(xiàn)象。

3.3 結(jié)論 斑馬魚、錦鯉魚、新月魚體表感受器的簇狀分布及線性排列類似于中醫(yī)的穴位與經(jīng)絡(luò)，其神經(jīng)纖維趨向頭側(cè)并向體干側(cè)線管前端匯聚，在體表形成一個(gè)以神經(jīng)縱向走行為主的感覺系統(tǒng)，與經(jīng)絡(luò)的縱向傳導(dǎo)相似，對(duì)經(jīng)絡(luò)研究有借鑒意義。

魚類體表感受器可分為四類：感覺芽、丘狀感覺器、側(cè)線器官、羅倫甕。其中丘狀感覺器又稱陷器或神經(jīng)丘，由于其感覺細(xì)胞低于四周的支持細(xì)胞，因而形成中凹的小丘狀構(gòu)造，能感覺水流和水壓。側(cè)線器官是最高度分化的、魚類及水生兩棲類生物所特有的皮膚感覺器，呈溝狀或管狀，具有感覺水流、確定方位、輔助趨流性定向、感受低頻率聲波等功能[13]。神經(jīng)丘是側(cè)線的重要組成部分，典型的神經(jīng)丘分布于魚類頭部或體干的溝槽或管道內(nèi)（如側(cè)線管），此外，也有游離分布的神經(jīng)丘，但其分布尤其是在體干部的分布規(guī)律知之甚少。由于耳支是神經(jīng)系統(tǒng)種系發(fā)生過程中魚類和兩棲類支配側(cè)線器官的最后殘留物，本研究首次應(yīng)用活體熒光染色的方法觀察，了解到錦鯉體表游離神經(jīng)丘的分布規(guī)律，豐富了魚類學(xué)的內(nèi)容。

我們的實(shí)驗(yàn)認(rèn)為：在動(dòng)物的外周組織中到處都有神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)[14]，軀干和四肢上的膽堿脂酶陽性小，神經(jīng)束的神經(jīng)末梢形成的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)多分布在小血管周叢。我們采用甲苯胺藍(lán)染色法對(duì)肥大細(xì)胞[15]鏡下觀察顯示，在經(jīng)絡(luò)皮部組織內(nèi)，可見穴區(qū)真皮內(nèi)肥大細(xì)胞的分布，皮下組織內(nèi)肥大細(xì)胞存在脂肪組織中，集中于血管周圍，肥大細(xì)胞數(shù)量最多。經(jīng)典解剖學(xué)認(rèn)為，迷走神經(jīng)耳支是迷走神經(jīng)末梢在周圍皮膚的分支，中樞走行中有舌咽神經(jīng)和面神經(jīng)加入，屬于一般軀體神經(jīng)，投射到三叉神經(jīng)脊束核。

經(jīng)絡(luò)理論是中醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)，數(shù)千年前中國古人就發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)存在氣血密不可分的調(diào)控系統(tǒng)[16]，并稱之為“經(jīng)絡(luò)”。經(jīng)絡(luò)由經(jīng)脈和絡(luò)脈組成，合稱經(jīng)絡(luò)；“經(jīng)”之路徑，“絡(luò)”之網(wǎng)絡(luò)，像網(wǎng)絡(luò)樣的錯(cuò)綜聯(lián)結(jié)，遍及周身。

近半個(gè)多世紀(jì)以來，隨著科學(xué)尤其是生命科學(xué)的進(jìn)步，我國科研工作者對(duì)經(jīng)絡(luò)、腧穴理論進(jìn)行了大量的研究，證實(shí)了經(jīng)絡(luò)現(xiàn)象的客觀存在性，同時(shí)認(rèn)為經(jīng)絡(luò)現(xiàn)象是普遍存在于人群之中的一種正常生命現(xiàn)象[16]，但至今仍未能發(fā)現(xiàn)經(jīng)絡(luò)和穴位存在的形態(tài)結(jié)構(gòu)，現(xiàn)有的研究結(jié)果又很難完整地解釋腧穴和經(jīng)絡(luò)現(xiàn)象。鑒于穴位是一種固有的生命現(xiàn)象，低等脊椎動(dòng)物亦應(yīng)存在穴位或類似結(jié)構(gòu)。

前期研究工作已發(fā)現(xiàn)，斑馬魚、新月魚、錦鯉魚等均存在體表感受器的簇狀分布與線性排列，類似于傳統(tǒng)的穴位與經(jīng)絡(luò)，因此，應(yīng)用低等脊動(dòng)物錦鯉，以其體表感受器為研究對(duì)象，進(jìn)行穴位與經(jīng)絡(luò)研究，以期運(yùn)用比較生物學(xué)的方法，探討穴位存在的生物學(xué)證據(jù)。

經(jīng)絡(luò)和穴位的研究一直是個(gè)熱點(diǎn)和難點(diǎn)。穴位主要功能是感覺，針刺穴位所產(chǎn)生的酸、麻、脹、痛、熱等針效均表現(xiàn)為感覺器官的反應(yīng)。我們研究發(fā)現(xiàn)感覺器官在軀體的有規(guī)律的集中分布[1][2][3]，其功能上類似于穴位。最近研究發(fā)現(xiàn)感覺器官在多數(shù)魚類中具有多種功能，如感覺平衡、水流方向、速度、信息交流、群體活動(dòng)、交配、捕食和逃避被捕食等，部分魚類的此類器官還可以放電和發(fā)光。中醫(yī)對(duì)經(jīng)絡(luò)的經(jīng)典描述，在軀干部分與本研究所觀察到的感覺器官所形成的線有相似之處，都形成若干條線。因此，有研究者推測，斑馬魚存在類穴位與類經(jīng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；斑馬魚皮膚感覺器官并不是均勻地分布于全身，而是若干感覺器官聚集在一起形成有規(guī)律的簇，而若干簇又有規(guī)律地沿軀體長軸排成線，類似于傳統(tǒng)經(jīng)絡(luò)與穴位。

既然透明斑馬魚等（觀賞魚類）神經(jīng)系統(tǒng)分布有規(guī)律可尋，那么，我們就有充分的理由對(duì)其機(jī)理研究進(jìn)行大量的、更加深入的挖掘工作。國外對(duì)斑馬魚在遺傳基因[17]等方面研究已有相關(guān)報(bào)導(dǎo)。目前，在國內(nèi)將觀賞魚類用于經(jīng)絡(luò)研究還只是剛起步，今后還有大量工作等待我們?nèi)ネ瓿伞?/p>

4 展望

最近美國科學(xué)家成功培育出一種透明斑馬魚，他們稱這種透明斑馬魚可以直視魚的內(nèi)部器官，實(shí)時(shí)地觀測活體器官的生長過程。此新培育出的斑馬魚會(huì)在整個(gè)生命過程中保持通體透明。斑馬魚是目前生命科學(xué)研究中重要的模式脊椎動(dòng)物之一。

自20世紀(jì)90年代初，斑馬魚因其多方面的優(yōu)點(diǎn)已成為醫(yī)學(xué)模式動(dòng)物家族中重要的一員，受到越來越多地重視和利用，使得人類不斷發(fā)現(xiàn)一些新的研究成果。斑馬魚作為模式生物有以下優(yōu)點(diǎn)：斑馬魚是脊椎動(dòng)物，有獨(dú)立的組織器官如腦、感受器、心臟、肝、胰、腎、腸、骨、肌肉等，且其器官與人體器官在結(jié)構(gòu)、生理、分子水平等方面有著驚人的相似點(diǎn)；個(gè)體小，喂養(yǎng)和費(fèi)用便宜，所需空間場地不大；胚胎透明，完整的活體可觀察到所有內(nèi)部器官和結(jié)構(gòu)，可以避免殺死或解剖動(dòng)物，從而可多角度對(duì)其進(jìn)行觀察。此外，雌性斑馬魚可產(chǎn)卵200枚，胚胎在24小時(shí)內(nèi)就可發(fā)育成形，這使得生物學(xué)家可以在同一代魚身上進(jìn)行不同的實(shí)驗(yàn)，對(duì)于疾病機(jī)制的研究非常有益。

綜上所述，斑馬魚、錦鯉魚、新月魚的皮膚作為一種直觀感覺器官，具有其他器官無法比擬的優(yōu)勢，由于神經(jīng)系統(tǒng)是所有器官組織中最復(fù)雜的系統(tǒng)，而皮膚卻直觀可視，尤其是透明觀賞魚類不僅美觀大方，而且可以直視魚的內(nèi)部器官，也為神經(jīng)系統(tǒng)的可視性研究提供了可靠保障。我們通過對(duì)透明斑馬魚等實(shí)驗(yàn)研究切實(shí)體會(huì)到，雖然存在困難和阻力，但是，它仍然具有其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無法比擬的明顯優(yōu)勢。我們相信隨著中醫(yī)針灸事業(yè)的不斷發(fā)展，斑馬魚等將在針灸經(jīng)絡(luò)研究領(lǐng)域?yàn)橹嗅t(yī)事業(yè)作出自己應(yīng)有的貢獻(xiàn)。