季亞軍

中藥自身的特點決定了其體內分布、代謝過程的特殊性與復雜性，因此，僅靠一種類型的分析技術并不能滿足中藥分析的要求，而需采用聯(lián)用多種分析技術進行綜合分析。微透析(Microdialysis，MD)探針技術是近年來興起的生物活體取樣技術。它利用透析的原理，可在清醒、自由活動的動物身上進行原位、實時、在線取樣［1］。近年來，微透析探針與色譜分析儀器聯(lián)用，為中藥體內分析開辟了高效精確的新途徑。本文介紹微透析取樣技術的原理、組成、探針類型、特點以及在體微透析取樣技術在中藥體內分析中的應用，為藥學工作者提供中藥體內分析方法的新思路。

1 微透析取樣技術的基本原理

微透析取樣技術的原理是將探針植入生物體內，同時，開動體外微量灌流泵，使灌流液流經探針頭部的半透膜;可通過半透膜的小分子藥物順濃度差擴散進入透析管，并被透析管內連續(xù)流動的灌流液不斷帶出，灌流液和組織液中的待測藥物達到動態(tài)平衡，從而達到活體組織取樣的目的。

2 微透析取樣技術的組成

微透析裝置的組成并不復雜，主要包括探針、連接導管、微量灌流泵、灌流液、樣品收集器及定量分析儀器。微量灌流泵以注射泵為佳，可避免恒流泵和蠕動泵的波動，流速一般為1～5μL/min。灌流液應選用細胞外液的等滲液，其中也會加入適宜的改性劑(如β-環(huán)糊精)，以提高探針的回收率［2］。探針是微透析裝置的核心部件，微透析的探針通常由一管式的再生纖維或聚碳酸酯透析膜固定于由鋼、石英毛細管或塑料制成的雙層套管構成，其直徑一般為250～350μm。探針有多種形式，按其構造大致可分為4類［3］:①主要用于腦部的同心圓式探針(Concentric cannula probe);②主要用于血管的柔性探針(Flexible probe);③主要用于肌肉、皮膚、腫瘤、肝等外周組織的線性探針(Linear probe);④主要用于膽管的分流探針(Shunt probe)。探針的類型、內徑大小及切割分子量的大小可根據實際應用的要求選定。

3 微透析取樣技術的特點

與傳統(tǒng)的在體分析方法比較，微透析取樣技術有以下優(yōu)點:①連續(xù)性采樣:傳統(tǒng)在體分析方法中，樣品收集多采用侵入性的方式，此種方式受限于實驗動物(如鼠)的體液量，若采樣過于密集，可導致動物的低血容量;若取樣時間點不足，無法反映出藥物在體內的連續(xù)變化過程，進而影響實驗的客觀性。微透析技術的取樣量很小，不會導致實驗動物的體液流失過多，又可連續(xù)性地收集樣品，可“實時”反映藥物在體內的連續(xù)變化過程。②多部位采樣:可將微透析探針植入實驗動物的血管、肝臟、膽管、腦部等部位［4］，以擴大體內分析的范圍，獲取更多的藥物動力學信息。此外，微透析探針還能植入腫瘤組織中，以檢測其中藥物濃度的變化［5］。③無需樣品前處理:傳統(tǒng)在體分析方法多需要樣品前處理，如蛋白質沉淀、液液萃取等。而微透析取樣技術對分子量大小有一定的要求，因此，樣品相對干凈，除免去繁雜的處理步驟，還減少了樣品前處理帶來的人為誤差和雜質對分析的干擾。④自動篩選非結合型的游離態(tài)藥物:只有游離態(tài)的藥物才能到達細胞，并與其結合，產生進一步的藥理作用。體內分析的目的是檢測游離態(tài)藥物的濃度。傳統(tǒng)的在體分析方法通常無法將結合型與非結合型藥物分開，而結合型藥物通常無法透過微透析裝置中的半透膜。因此，微透析取樣技術得到的樣品皆為游離態(tài)藥物，而能更真實地反映藥物在體內的藥理活性。

當然，微透析取樣技術也有其局限性，一是微透析取樣是在非平衡條件下進行的，所測得的透析液中，化合物濃度只是探針周圍樣品基質中實際濃度的一部分，而非組織中的藥物濃度。雖然可用探針的回收率來修正測定值，但不夠完善，如脂溶性藥物會吸附在探針上，進而影響回收率的測定［3］。二是微透析技術要求探頭必須準確插在同一取樣部位，因此，不適合對很小的腦內神經核團采樣。另外，由于微透析膜體積小，灌流液的流速低，想以“秒”為單位進行動態(tài)觀察較難實施。

4 微透析取樣技術在中藥體內分析中的應用

4.1 在腦內分析中的應用 微透析技術最初主要用于研究藥物在腦中的分布和轉運［6］。一方面，由于微透析技術開發(fā)的目的是用于神經化學方面的研究;另外，早期微透析探針的剛性設計只適于腦內放置。用微透析取樣技術測定腦內藥物濃度比其他測定方法有明顯的優(yōu)勢，如具有較好的時間和空間分辨性，選擇性好，且不受代謝物的干擾。利用微透析技術測定腦中中藥有效成分的含量或考察中藥的藥理作用的研究也早已開展。Tsai等［7］應用微透析探針對黃芩素在海馬區(qū)中的藥物動力學進行研究，同時使用環(huán)孢霉素A考察P-糖蛋白對黃芩素代謝的影響。張群林等［8］應用微透析-液相色譜-化學發(fā)光法測定大鼠腦組織中丹參酚類化合物的濃度，實現(xiàn)了腦組織中游離丹參素濃度的動態(tài)監(jiān)測，具有高選擇性和高靈敏度等優(yōu)點。呂允鳳等［9］應用微透析技術和質譜法測定川芎嗪對大鼠腦內乙酰膽堿釋放量的影響，方法學考察顯示，該法能夠準確反映藥物對大鼠腦內乙酰膽堿釋放量的影響，與傳統(tǒng)方法相比，具有明顯優(yōu)勢。劉培等［10］應用微透析結合HPLC-ECD快速測定正常和原發(fā)性痛經模型大鼠下丘腦中的5-羥吲哚乙酸(5-HIAA)含量。微透析樣品中5-HIAA的檢測限和定量限分別是1.5、5.0 ng/mL。痛經模型大鼠的5-HIAA的含量比正常對照組顯著增加，表明原發(fā)性痛經可導致5-HIAA增加。而經過香附四物湯治療后，5-HIAA含量降低，顯示香附四物湯通過降低下丘腦的5-羥色胺的代謝率減輕原發(fā)性痛經的疼痛綜合征。

4.2 在血液分析中的應用 由于微透析取樣能收集不含蛋白質的樣品，并能長期持續(xù)地從靜脈中取樣，所以倍受關注。汪晉［11］使用自制的微透析探針，結合液質聯(lián)用分析技術，檢測大鼠血液中游離態(tài)三七總皂苷的含量。方法學驗證實驗表明，該法為在體、實時及持續(xù)檢測方法，可更為準確地檢測體內游離態(tài)藥物濃度。凌家俊等［12］采用微透析技術采血，應用高效液相色譜法分析青藤堿在大鼠血液中的濃度，得出青藤堿在大鼠體內的藥動學過程符合靜注二室模型，分布相和消除相的半衰期分別為10.98、44.71min，表明采用微透析技術檢測青藤堿血液濃度方法有效可行。也有研究者利用微透析技術測定川芎嗪在大鼠腦紋狀體及血液中的濃度。川芎嗪在兩部位的AUC值說明，其具有較高的血腦屏障滲透性，與川芎嗪可改善中樞神經系統(tǒng)相吻合［13］。王小坡等［14］在鬼臼毒素血液微透析樣品中加入依托泊苷(內標)，經乙酸乙酯液-液提取后，進行UFLC-MS/MS測定。經方法學驗證，該法的日內、日間精密度及準確度均較小。結果表明，該法簡單可行。

4.3 在皮膚和皮下組織分析中的應用 經皮微透析(Cutaneous microdialysis，CMD)技術的優(yōu)點很多［15］，最大的優(yōu)點是可真實反映局部皮膚藥物濃度及代謝情況，并解決由于體外切除皮膚所遇到的水合、變性及細菌生長等問題。近年來，有關中藥及其制劑的CMD研究越來越多。鄧亞利等［16］采用微透析聯(lián)用HPLC的方法，研究青藤堿雷公藤甲素巴布劑裸鼠的在體透皮吸收過程，方法學驗證表明，該法能夠在體、實時監(jiān)測裸鼠皮下青藤堿和雷公藤甲素的動態(tài)濃度，為中藥透皮吸收的研究提供新的方法。凌家俊等［17］利用微透析技術研究不同工藝制備的青藤堿貼劑的生物等效性，以裸鼠為實驗動物，經皮給藥，采用微透析法測定青藤堿的體內藥量。結果表明，青藤堿的脂質體凝膠貼劑比普通凝膠貼劑具有更高的局部生物利用度，CMD技術可用于透皮貼劑的生物利用度及生物等效性研究。同年，該研究小組又以大鼠為研究對象，分別進行經皮及腹腔注射給藥，采用微透析技術取樣，高效液相色譜法分析，測定皮膚局部青藤堿濃度的動態(tài)變化。結果證實，微透析取樣技術可以實現(xiàn)皮膚局部藥物濃度的動態(tài)測定，與傳統(tǒng)的皮膚藥物濃度測定方法相比，具有明顯優(yōu)勢［18］。王丹等［19］采用在體微透析取樣技術聯(lián)用RP-HPLC的方法，對大鼠皮膚中的葛根素進行了體內藥代動力學考察。方法學考察證實，此法能夠在體、實時監(jiān)測大鼠皮下葛根素濃度，方法快速、準確、簡便，為葛根素經皮給藥體內藥代動力學研究提供了理論基礎。

4.4 在其他組織中分析的應用 Tsai等［20］利用微透析聯(lián)合HPLC，同時測定了小檗堿在大鼠血液、肝臟、膽汁中的濃度。藥時曲線表明，小檗堿iv給藥后20min，在肝臟和膽汁達到峰濃度，在膽汁的濃度明顯高于在血液和肝臟的濃度，提示小檗堿可能在膽汁中排泄。張英豐等［21］將微透析探針植入大鼠的右心室，實時、活體采集肌注鹽酸青藤堿后的透析液樣品，結果表明，鹽酸青藤堿肌注后，血藥濃度呈一級速率、一室模型，微透析法能較好地反映鹽酸青藤堿肌注給藥的藥動學特征。

5 結語

目前，中藥藥效研究的核心是物質基礎研究，而中藥物質基礎的體內分析是實現(xiàn)這一核心的重要手段。微透析取樣技術具有高時間分辨性和選擇性的優(yōu)勢，在中藥藥效研究中具有廣闊的前景。然而，筆者認為，在中藥的研究中普及微透析取樣技術亟需解決2個問題:一是微透析在中藥體內分析中的重現(xiàn)性較差，在檢測濃度極低的同一種活性物質時，結果有時相差近10倍［22］，仍需尋找完善的回收率測定方法;二是目前微透析裝置的核心部件(如微透析泵)均為國外進口，價格昂貴，對實驗普及不利，國內自主微透析設備的開發(fā)勢在必行。

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