沈瑤 白春學(xué) 金美玲 陳智鴻

（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科，＊呼吸科，上海 200032）

氣道表面液體是機(jī)體抵御有害物質(zhì)的第一道屏障，機(jī)體可以通過纖毛運(yùn)動清除氣道中的病原體和有毒物質(zhì)［1］。但是，持續(xù)過多的黏液會阻塞呼吸道管腔，導(dǎo)致氣流受限、氣道反復(fù)感染。黏蛋白（mucin，MUC）為氣道黏液的主要成分，已知人類有20種不同的黏蛋白，MUC5AC和MUC5B為氣道分泌物的主要成分，其中 MUC5AC為可誘導(dǎo)性，而MUC5B則多為持續(xù)性表達(dá)。吸煙、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、大氣污染、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）等均可刺激 MUC5AC的表達(dá)［2］。水份占?xì)獾鲤ひ嚎偭康?5%，水份減少將使黏蛋白／水鹽比例升高，凝膠層的黏液會下降，影響?zhàn)ひ海w毛的擺動。水通道蛋白（aquaporin，AQP）主要參與滲透壓驅(qū)動下水的轉(zhuǎn)運(yùn)。AQP1、AQP3、AQP4、AQP5為肺相關(guān)的水通道蛋白，其中AQP5位于肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞 （alveolar typeⅠcell，ATⅠ）的腔頂面和鼻咽和呼吸道黏膜下腺的上皮細(xì)胞腔頂［3］。小鼠屋塵螨致敏的慢性模型顯示AQP 5基因敲除鼠肺組織中MUC5AC較野生鼠降低［4］。應(yīng)用RNAi特異性抑制人肺腺癌細(xì)胞株SPC－A1中AQP5的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MUC5AC表達(dá)進(jìn)行性升高［5］，提示AQP 5在黏液分泌中起著重要的作用。

本研究擬采用黏液下腺SPC－A1細(xì)胞株，觀察LPS刺激后AQP5和MUC5AC的變化。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) SPC－A1細(xì)胞株在含10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)和傳代。

1.2 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reation，PCR） 采用Rotor－Gene RG 3000儀進(jìn)行檢測。①β－actin－sense：5′CCTGTACGCCAACACAGTGC3′，antisense： 5′ ATACTCCTGCTTGCTGATCC3′②AQP5－sense：5′CTGTCCATTGGCCTGTCTGTC3′，antisense：5′GGCTCATACGTGCCTTTGATG3′，③ MUC5AC－sense：5′GAGGGCAACAACGTCATCTCC 3′，antisense：5′TCT TGGTCAGCCACCTTCACA3′。

1.3 Western雜交 酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）按常規(guī)進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件，多組間兩兩比較采用方差分析，組間比較采用Student－Newman－Keuls檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 LPS刺激后AQP5mRNA和AQP5蛋白呈劑量依賴性降低 將 LPS 0μg／mL、5μg／mL、1 μg／mL、20μg／mL、40μg／mL加入SPC－A1細(xì)胞株中，24h檢測AQP5的蛋白和AQP5mRNA水平（圖1）。AQP5mRNA在LPS為10μg／mL時開始下降，LPS 為 20μg／mL 時至低谷（P＜0.05）。Western雜交顯示AQP5的蛋白水平也隨LPS濃度的增加逐漸降低，LPS 10μg／mL時開始下降，LPS為20μg／mL時減至低谷，故后續(xù)實驗選用20μg／mL的LPS濃度進(jìn)行。

圖1 LPS刺激SPC－A1細(xì)胞株后，AQP5mRNA和AQP5蛋白呈劑量依賴性降低

2.2 LPS刺激后AQP5呈時間依賴性降低 20 μg／mL濃度的LPS干預(yù)SPC－A1細(xì)胞株，0、12、24、48h后收集細(xì)胞，結(jié)果顯示LPS刺激6h后AQP5 mRNA（0.23±0.04）開始下降，24h后達(dá)低谷，48 h為最低。LPS刺激6h后AQP5蛋白水平開始下降，24h后達(dá)低谷，48h為最低（圖2）。

圖2 LPS刺激SPC－A1細(xì)胞株后，AQP5mRNA和AQP5蛋白呈時間依賴性降低

2.3 LPS刺激后 MUC5AC mRNA和 MUC5AC蛋白水平呈劑量依賴性增加 將0μg／mL、5μg／mL、10μg／mL、20μg／mL、40μg／mL濃度的 LPS加入SPC－A1細(xì)胞株中，培養(yǎng)24h后觀察不同濃度LPS刺激后MUC5AC mRNA和MUC5AC蛋白的變化。PCR顯示LPS濃度10μg／mL時MUC5AC mRNA水平開始上升（1.3±0.14），LPS為40μg／mL時上升最多，再增加LPS濃度其并未繼續(xù)上升。ELISA檢測MUC5AC蛋白水平可見LPS 10μg／mL時MUC5AC蛋白水平開始上升，LPS為40 μg／mL時上升最多，再增加LPS濃度并未繼續(xù)上升（圖3）。

圖3 LPS刺激SPC－A1細(xì)胞株后，MUC5AC mRNA和MUC5AC蛋白水平呈劑量依賴性升高

2.4 LPS刺激 MUC5AC mRNA和 MUC5AC蛋白水平呈時間依賴性增加 20μg／mL濃度的LPS刺激SPC－A1細(xì)胞株0、12、24、48h后收集細(xì)胞檢測MUC5AC mRNA和MUC5AC蛋白含量。PCR顯示刺激6h時，MUC5AC mRNA水平開始上升，24h后達(dá)高峰。ELISA檢測MUC5AC蛋白水平，可見刺激6h后MUC5AC蛋白水平開始上升，24h后達(dá)高峰（圖4）。

圖4 LPS刺激SPC－A1細(xì)胞株后，MUC5AC mRNA和MUC5AC蛋白水平呈時間依賴性增加

3 討 論

慢性阻塞性肺病急性發(fā)作期常和細(xì)菌感染有關(guān)。LPS為革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁，是細(xì)菌致病的主要成分。本研究顯示LPS刺激黏液下腺SPC－A1細(xì)胞株后，AQP5mRNA和AQP5蛋白水平呈劑量和時間依賴性降低，同時MUC 5AC的mRNA及MUC5AC蛋白水平。呈劑量和時間依賴性升高。黏蛋白雖然只占呼吸道黏液總量的2%，卻是黏液粘性和彈性的主要來源，它能吸附異物顆粒和病原微生物，隨纖毛擺動將其排除體外。哮喘和慢性阻塞性肺病患者氣道黏液MUC5B／MUC5AC比例增高，且MUC2含量減少。說明在不同疾病狀態(tài)下，呼吸道黏液譜及比例可能不同。很多因素如吸煙、中性粒細(xì)胞等均刺激上皮細(xì)胞MUC5AC的產(chǎn)生［2］。近期國內(nèi)有研究顯示，原代培養(yǎng)的兔氣道上皮，置于高滲液體中，AQP5下降，MUC5AC分泌上升。因此，LPS可以降低黏液下腺細(xì)胞中AQP5的表達(dá)，同時增加MUC5AC的表達(dá)，使黏蛋白比例失衡、黏液增多且黏稠不易咳出。

［1］ Pedersen PS，Braunstein TH，J?rgensen A，et al.Stimulation of aquaporin－5and transepithelial water permeability in human airway epithelium by hyperosmotic stress［J］.Pflugers Arch，2007，453（6）：777－785.

［2］ Chen Y，Thai P，Zhao YH，et al.Stimulation of airway mucin gene expression by interleukin（IL）－17through IL－6paracrine／autocrine loop［J］.J Biol Chem，2003，278（19）：17036－17043.

［3］ Ma T，F(xiàn)ukuda N，Song Y，et al.Lung fluid transport in aquaporin－5knockout mice［J］.J Clin Invest，2000，105（1）：93－100.

［4］ Shen Y，Wang YL，Chen ZH，et al.Role of aquaporin 5in antigen－induced airway inflammation and mucous hyperproduction in mice［J］.J Cell Mol Med，2011，15（6）：1355－1363.

［5］ Chen Z，Wang X，Gao L，et al.Regulation of MUC5AC mucin secretion by depletion of AQP5in SPC－A1cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2006，342（3）：775－781.