摘 要 通過比較兩種極性差異較大的基質(zhì)2，5-二羥基苯甲酸（DHB）和2′，6′-二羥基苯乙酮（DHAP）按不同比例混合時(shí)，Angiotensin Ⅱ的基質(zhì)輔助激光解析電離-傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜（MALDI-FT/ICRMS）譜圖的不同，并結(jié)合基質(zhì)-Angiotensin Ⅱ在不同結(jié)晶方式下的共結(jié)晶和基質(zhì)晶體的掃描電鏡照片，發(fā)現(xiàn)基質(zhì)為10

SymbolmA@ mol/L DHB和15

SymbolmA@ mol/L DHAP以體積比4:1組成的混合物時(shí)，基質(zhì)結(jié)晶為致密的層狀結(jié)構(gòu)，而以薄層法與Angiotensin Ⅱ生成的共結(jié)晶，Angiotensin Ⅱ在基質(zhì)晶體上面形成分散的柱狀小晶體，此時(shí)得到的MALDI-FT/ICRMS質(zhì)譜圖優(yōu)于干滴法。

關(guān)鍵詞 基質(zhì)輔助激光解析電離; 傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜; 肽; 薄層法; 干滴法

2011-06-15收稿；2011-11-10接受

* E-mail: chenjun05@tsinghua.org.cn

1 引 言

傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜（FT/ICRMS）是一種具有高質(zhì)量分辨率的質(zhì)譜技術(shù)[1，2]。FT/ICRMS的主要優(yōu)點(diǎn)是分辨率在一個(gè)較寬的質(zhì)荷比范圍內(nèi)極高，可以達(dá)到10.5 ～10.6[3]。在一定的頻率范圍內(nèi)，只要在足夠長的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行采樣，均可獲得高分辨數(shù)據(jù)，獲得高的質(zhì)量準(zhǔn)確性[4～6]。

基質(zhì)輔助激光解析電離技術(shù)（MALDI）是一種軟電離技術(shù)，利用其對于肽類及蛋白樣品的分析較為深入[7]，樣品的前處理是該技術(shù)的關(guān)鍵步驟。常見的樣品前處理技術(shù)主要包括MALDI靶上前處理和基質(zhì)的選擇。靶上前處理方法主要有：利用靶上修飾物與分析物的特異吸附作用，富集分析物[8]；通過浸洗步驟除鹽，增加質(zhì)譜靈敏度[9]等。采用MALDI源對分析物進(jìn)行電離時(shí)，基質(zhì)的主要作用是分散分析物和傳遞激光能量。分析物均勻地分散于基質(zhì)內(nèi)，也被形象地稱為固態(tài)溶液[10]。形成這種固態(tài)溶液要求基質(zhì)和分析物的極性具有一定的相似性[10]。因此，選擇合適的基質(zhì)以及采用適當(dāng)?shù)幕|(zhì)樣品共結(jié)晶，對于MALDI技術(shù)非常重要。對于肽類分析的基質(zhì)為2，5-二羥基苯甲酸（DHB）[11]，也有文獻(xiàn)報(bào)道利用2′，6′-二羥基苯乙酮（DHAP）和檸檬酸氫二銨（DAHC）的混合物作為基質(zhì)，取得了更好的分析效果。MALDI-MS檢測多肽類化合物往往能夠得到較多的碎片離子，而利用DHAP/DAHC的混合基質(zhì)得到的碎片離子少很多[12，13]。還有文獻(xiàn)報(bào)道，以香豆素類化合物與DHB為混合基質(zhì)，分析多糖和糖蛋白，效果較好[14]。目前，MALDI源的基質(zhì)樣品共結(jié)晶方式主要有干滴法\\，薄層法及三明治法。這3種方式本身無優(yōu)劣之分，在對于具體基質(zhì)和分析物時(shí)，要通過實(shí)驗(yàn)考察，以確定最佳的共結(jié)晶制備方式。

本研究選取了兩種極性差異較大的多肽分析常用基質(zhì)DHB和DHAP[10]，通過考察配比混合基質(zhì)\\，樣品制備方式\\，激發(fā)激光能量等實(shí)驗(yàn)條件對短鏈多肽MALDI-FT/ICRMS分析的影響，并結(jié)合基質(zhì)與分析物共結(jié)晶的掃描電鏡照片，分析基質(zhì)組成和結(jié)晶方式對于化合物質(zhì)譜行為的影響。2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

920傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀（7T磁體，美國Varian公司）；MALDI激光源為Orion air-cooled Nd:YAG （美國New Wave Research公司），其固定激發(fā)波長為532，355和266 nm；S-3700N掃描電鏡和E-1045離子濺射儀（日本Hitachi公司）。

2，5-二羥基苯甲酸（2，5-Dihydroxybenzoic acid，DHB， TCI-EP，東京化成工業(yè)株式會社）；2′，6′-二羥基苯乙酮（2′，6′-Dihydroxyacetophenone，DHAP），Leu-Val和Angiotensin Ⅱ（10

SymbolmA@ mol/L，美國Sigma-Aldrich公司）；乙腈（色譜純，美國CNW公司）；實(shí)驗(yàn)用水經(jīng)Milli-Q Integral 3 A10純水系統(tǒng)制備。

基質(zhì)儲備液配制：精確稱取DHB和DHAP，加入乙腈-水（1∶1，V/V）溶液，分別配制濃度為10和15

SymbolmA@ mol/L的儲備液，置于4 ℃保存?；旌匣|(zhì)溶液是將DHB和DHAP儲備液分別按照體積比1∶1，2∶1，1∶2，3∶1，1∶3，4∶1和1∶4混合使用。

2.2 樣品準(zhǔn)備

2.2.1 MALDI-FT/ICRMS樣品制備 （1）薄層法 在MALDI靶上分別點(diǎn)加1，2，3和4

SymbolmA@ L的DHB或DHAP，以及各不同比例的混合基質(zhì)溶液，于空氣中揮干后，再分別點(diǎn)加1

SymbolmA@ L二肽和多肽溶液，于空氣中揮干。（2）干滴法 預(yù)先分別將2.1節(jié)中各基質(zhì)溶液與Angiotensin Ⅱ溶液按照體積比1∶1混合，在MALDI靶上點(diǎn)樣2

SymbolmA@ L，以保證樣品點(diǎn)包含的基質(zhì)與分析物的絕對量與薄層法制得的樣品點(diǎn)中相同。（3）三明治法 在薄層法制樣的基礎(chǔ)上，再點(diǎn)加相同體積的基質(zhì)溶液。

2.2.2 電鏡樣品制備 將1

SymbolmA@ L 2.1節(jié)中各基質(zhì)溶液，以及2.2.1中的各基質(zhì)與待分析樣品混合溶液點(diǎn)樣于導(dǎo)電玻璃上，空氣中揮干。在基質(zhì)溶液揮干后的痕跡上，再次點(diǎn)加1

SymbolmA@ L Angiotensin Ⅱ溶液，于空氣中揮干，然后再次點(diǎn)加1

SymbolmA@ L基質(zhì)溶液，空氣中揮干。分別得到純基質(zhì)晶體。分別采用干滴法、薄層法和三明治法制備晶體。置于離子濺射儀中，10 mA，噴金30 s。

2.3 FT/ICRMS參數(shù)設(shè)置

數(shù)據(jù)收集軟件為Omega （9.0 beta， Varian）。對于Leu-Val掃描范圍為m/z 150～300，對于Angiotensin Ⅱ掃描范圍為m/z 150～2000，正離子模式檢測，掃描時(shí)間為262.144 ms，經(jīng)兩次采集，得到512 K寬帶瞬間時(shí)域。質(zhì)譜質(zhì)量軸通過PEG400進(jìn)行校準(zhǔn)。

3 結(jié)果與討論

3.1 DHB和DHAP作為基質(zhì)用于Leu-Val的分析

按照薄層法，分別以DHB和DHAP為基質(zhì)， Leu-Val的MALDI-FT/ICRMS譜圖如圖1所示。各主要離子的精確質(zhì)量和分辨率分別為：253.1635（50200）；275.1452（42400）；291.1191（42500）。

圖1 10

SymbolmA@ mol/L DHB （A）和15

SymbolmA@ mol/L DHAP （B） 各1

SymbolmA@ L作為基質(zhì)測定Leu-Val的質(zhì)譜圖

Fig．1 Mass spectrometry of Leu-Val with 1

SymbolmA@ L 10

SymbolmA@ mol/L 2，5-dihydroxybenzoic acid（DHB） （A） and 15

SymbolmA@ mol/L 2，6-dihydroxyacetophenone （DHAP） （B） as matrix

Leu-Val的計(jì)算分子量為230。m/z 253為[M＋Na].＋峰，m/z 275為[M

Symbolm@@ H＋2Na].＋峰，m/z 291為[M

Symbolm@@ H＋Na＋K].＋峰。DHAP為基質(zhì)時(shí)，與DHB為基質(zhì)一樣，m/z 275峰作為基峰，m/z 291峰降低45.74%，m/z 253峰強(qiáng)增強(qiáng)17.89%。這表明DHAP有抑制Leu-Val結(jié)合多個(gè)堿金屬離子的能力。

當(dāng)基質(zhì)體積增加為2

SymbolmA@ L時(shí)（圖2），DHB組中，基峰仍然為m/z 275，而m/z 291峰強(qiáng)下降41.93%，而m/z 253.16峰強(qiáng)上升36.58%。在DHAP組中，m/z 253成為基峰，而m/z 291低于檢出限而未被檢到。此結(jié)果更證實(shí)了DHAP有抑制Leu-Val與多個(gè)堿金屬離子結(jié)合的能力。當(dāng)基質(zhì)體積增加到4

SymbolmA@ L時(shí)，DHB組得到的譜圖與2

SymbolmA@ L無明顯區(qū)別，而DHAP組雜峰明顯增加，而準(zhǔn)分子離子峰下降明顯。

圖2 10

SymbolmA@ mol/L DHB （A）和15

SymbolmA@ mol/L DHAP （B）各2

SymbolmA@ L測定Leu-Val的質(zhì)譜圖

Fig．2 Mass spectrometry of Leu-Val with 2

SymbolmA@ L 10

SymbolmA@ mol/L DHB （A） and 15

SymbolmA@ mol/L DHAP （B） as matrix

3.2 DHB和DHAP作為基質(zhì)用于Angiotensin Ⅱ的分析

Angiotensin Ⅱ的氨基酸序列為Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe，計(jì)算分子量為1045.54。按照薄層法，分別用1

SymbolmA@ L的DHB和DHAP作為基質(zhì)對Angiotensin Ⅱ進(jìn)行分析（圖3）。DHB作基質(zhì)時(shí)，準(zhǔn)分子離子峰簇主要有m/z 1090（1.34%），m/z 1068（6.31%）和m/z 1046（100%），分別為[M

Symbolm@@ H＋2Na].＋，[M＋Na].＋和[M＋H].＋；主要碎片離子為m/z 931，899，802，784和767，分別為[MSymbolmA@ L作為基質(zhì)測定angiotensin Ⅱ的質(zhì)譜圖

Fig．3 Mass spectrometry of angiotensin Ⅱ with 1

SymbolmA@ L 10

SymbolmA@ mol/L DHB （A） and 15

SymbolmA@ mol/L DHAP （B） as matrix

3.3 DHB和DHAP混合作為基質(zhì)用于Angiotensin Ⅱ的分析

將10

SymbolmA@ mol/L DHB和15

SymbolmA@ mol/L DHAP按照體積比分別為1∶1，1∶2，2∶1，1∶3，3∶1，1∶4和4∶1混合制成混合基質(zhì)。由于DHB和DHAP的活性氫摩爾比為3∶2，故二者的摩爾濃度比選擇為2∶3，以確保在任何體積比混合時(shí)，使活性氫摩爾數(shù)相同。

樣品結(jié)晶方式采用薄層法。比較7種不同配比混合基質(zhì)條件下MALDI-FT/ICRMS譜圖數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)體積比為1∶3和1∶4時(shí)，分子離子峰強(qiáng)度下降明顯。而體積比為1∶1，1∶2，2∶1和3∶1時(shí)，譜圖與純DHB為基質(zhì)時(shí)較為相似。而當(dāng)VDHB∶VDHAP＝4∶1時(shí)， [M＋Na].＋峰減弱73.4%，且 [M

Symbolm@@ H＋2Na].＋峰未被測到。這表明，VDHB∶VDHAP＝4∶1時(shí)，能夠?qū)HB對Angiotensin Ⅱ的離子化能力和DHAP降低Angiotensin Ⅱ與多個(gè)堿金屬結(jié)合的能力相結(jié)合，從而更好地提高靈敏度和選擇性?；|(zhì)體積為1～2

SymbolmA@ L時(shí)，譜圖差異不大，但當(dāng)基質(zhì)體積大于3

SymbolmA@ L后，譜圖信號減弱明顯。

3.4 不同樣品制備方式的比較

干滴法、薄層法和三明治法在MALDI-MS實(shí)驗(yàn)中均有廣泛運(yùn)用[15]。本研究比較了VDHB∶VDHAP＝4∶1時(shí)， 不同制備方式對FT/ICRMS響應(yīng)的影響。干滴法點(diǎn)樣量為2

SymbolmA@ L，而薄層法基質(zhì)點(diǎn)樣量和樣品點(diǎn)樣量均為1

SymbolmA@ L。結(jié)果表明，樣品制備方式對Angiotensin Ⅱ的MALDI-FT/ICRMS響應(yīng)的影響甚大。薄層法得到的譜圖主要是準(zhǔn)分子離子峰（圖4A），而干滴法得到的準(zhǔn)分子離子峰強(qiáng)度甚小（圖4B），碎片離子的種類明顯多于薄層法，且有m/z 453這個(gè)在薄層法得到的譜圖中未被檢測到的離子。此結(jié)果顯示，薄層法對于Angiotensin Ⅱ的檢測更為適合。而造成這一現(xiàn)象的原因則可能是由于干滴法中，基質(zhì)與Angiotensin Ⅱ作用較強(qiáng)，Angiotensin Ⅱ更多的被包埋在基質(zhì)晶體之內(nèi)，而難以被激發(fā)成為氣態(tài)離子，而從基質(zhì)中吸收的能量迫使Angiotensin Ⅱ的化學(xué)鍵斷裂，形成較多的碎片離子。干滴法中得到了薄層法中未得到的碎片離子，更證明了這兩種方法導(dǎo)致的Angiotensin Ⅱ在質(zhì)譜中的裂解原理不同。三明治法是薄層法結(jié)晶的基礎(chǔ)上，再點(diǎn)加適量基質(zhì)溶液，再次結(jié)晶。Angiotensin Ⅱ在基質(zhì)為DHB-DHAP（4∶1，V/V）溶液，基質(zhì)點(diǎn)樣體積為1

SymbolmA@ L×2，樣品體積為1

SymbolmA@ L時(shí)，激光能量從30%增加至40%，質(zhì)譜圖中均未發(fā)現(xiàn)樣品碎片。

圖4 薄層法（A）和干滴法（B）測定Angiotensin Ⅱ的質(zhì)譜圖

Fig．4 Mass spectrometry of angiotensin Ⅱ prepared by thin-layer （A） and dry-droplet method （B）

基質(zhì)為1

SymbolmA@ L的10

SymbolmA@ mol/L DHB-15

SymbolmA@ mol/L DHAP（4∶1，V/V）混合基質(zhì)，激光能量為30%。The matrix is 1

SymbolmA@ L mixture of 10

SymbolmA@ mol/L DHB-15

SymbolmA@ mol/L DHAP（4∶1，V/V）， and the laser energy is 30%.

3.5 不同激發(fā)能量的比較

由于不同激發(fā)能量對于化合物的質(zhì)譜裂解行為十分重要，能量過高，將導(dǎo)致碎片離子過多；能量不足，則導(dǎo)致靈敏度嚴(yán)重下降。本實(shí)驗(yàn)主要針對于3.4節(jié)的樣品，考察了激光能量分別為15%，20%，25%，30%和 35%時(shí)，對質(zhì)譜響應(yīng)的影響。當(dāng)能量低于25%時(shí)，兩種制樣方法均未能得到質(zhì)譜響應(yīng)。當(dāng)激光能量為25%和30%時(shí)，同種制樣方式的譜圖并未有明顯區(qū)別。而當(dāng)能量為35%時(shí)，薄層法得到的譜圖中碎片明顯增多，而分子離子峰強(qiáng)度下降顯著；干滴法得到的譜圖中，m/z 453和 437顯著增強(qiáng)，其它碎片被基線噪音淹沒，同時(shí)分子離子峰強(qiáng)度下降十分明顯。此結(jié)果也證明了m/z 437和 451主要來源于Angiotensin Ⅱ的裂解，且是不同于薄層法的質(zhì)譜裂解方式。

3.6 不同基質(zhì)結(jié)晶和與樣品共結(jié)晶的形態(tài)比較

利用掃描電鏡，觀察基質(zhì)混合后其結(jié)晶形態(tài)發(fā)生明顯變化（圖5）；不同的制樣方式得到的基質(zhì)與Angiotensin Ⅱ的共結(jié)晶形態(tài)也明顯不同（圖6）。

從外形上看，DHAP的結(jié)晶相對DHB小很多（圖5A，5B）。當(dāng)DHB和DHAP以體積比2∶1混合時(shí)，結(jié)晶形態(tài)發(fā)生了較為明顯的改變（圖5C）;當(dāng)DHB和DHAP體積比為4∶1混合時(shí)（圖5D），形成的結(jié)晶為較為致密的層狀結(jié)構(gòu)。干滴法得到的晶體（圖6A）比純基質(zhì)晶體（圖5D）更為致密。而以薄層法共結(jié)晶時(shí)，Angiotensin Ⅱ在基質(zhì)晶體表面形成分散的柱狀晶體（圖6B），能夠同時(shí)滿足分散分析物和避免基質(zhì)包埋分析物的要求，因此其質(zhì)譜行為優(yōu)于干滴法。

圖5 4種不同組成基質(zhì)結(jié)晶的掃描電鏡照片

Fig．5 Scanning electron microscope picture of 4 kinds of matrix

A. DHB； B. DHAP； C. 10

SymbolmA@ mol/L DHB-15

SymbolmA@ mol/L DHAP（2∶1，V/V）；D. 10

SymbolmA@ mol/L DHB-15

SymbolmA@ mol/L DHAP（4∶1，V/V）.圖6 不同制備方式的基質(zhì)與Angiotensin Ⅱ共結(jié)晶掃描電鏡照片

Fig．6 Scanning electron microscope picture of matrix-analyte crystal by different preparation methods

A. 干滴法； B. 薄層法； C. 三明治法。A. Dry-droplet method; B. Thinlayer method; C. Sandwich method

從電鏡照片可見，三明治法所得到的晶體結(jié)構(gòu)與干滴法所得晶體十分相似，但又比干滴法所得晶體顆粒大（圖6C）。這一結(jié)果提示，在該實(shí)驗(yàn)條件下，采用三明治法Angiotensin Ⅱ無法得到質(zhì)譜響應(yīng)的可能原因是基質(zhì)的過度包埋，使得分析物難以解析成為離子。

4 結(jié) 論

研究結(jié)果表明，DHAP有抑制Leu-Val和Angiotensin Ⅱ與堿金屬離子結(jié)合的能力。當(dāng)DHAP含量適當(dāng)時(shí)，譜圖中準(zhǔn)分子離子峰中結(jié)合堿金屬峰強(qiáng)含量較低，且碎片離子較少。而當(dāng)DHAP含量較高時(shí)，其抑制結(jié)合堿金屬的能力導(dǎo)致分析物離子化效果不佳，從而引起靈敏度下降。10

SymbolmA@ mol/L DHB和15

SymbolmA@ mol/L DHAP以體積比4∶1混合時(shí)，基質(zhì)結(jié)晶為致密的層狀結(jié)構(gòu)，而以薄層法與Angiotensin Ⅱ共結(jié)晶，Angiotensin Ⅱ在基質(zhì)晶體上面形成分散的柱狀小晶體，此時(shí)得到的MALDI-FT/ICRMS質(zhì)譜圖最佳。

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Effect of Interaction of Matrix and Analyte on Detection of

Low Molecular Weight Peptide by Matrix Assisted Laser

Desorption Ionization-Fourier Transform/Ion

Cyclotron Resonance Mass Spectrometry

CHEN Jun.*， YIN Jun， GAO Shuai， XU Li， XIAO Hong-Zhan

（Beijing Institute of Microchemistry， Beijing 100091， China）

Abstract Because of the suppression of 2′，6′-dihydroxyacetophenone （DHAP） to the combination of peptide with alkali metal ion and the advanced ability of 2，5-dihydroxybenzoic acid （DHB） to ionize peptide in MALDI-MS， it is illustrated in this work that the best MALDI-FT/ICRMS is obtained when matrix is composed of 10

SymbolmA@ mol/L DHB and 15

SymbolmA@ mol/L DHAP. The scanning electron microscope pictures of matrix with different compositions show that the crystal of matrix composed of 8

SymbolmA@ mol/L DHB and 3

SymbolmA@ mol/L DHAP is in a dense stratiform state that is quite different from crystal of matrix with other proportion of DHB and DHAP. It is also demonstrated that thin-layer method is the best peptide preparation method with matrix composed of 8

SymbolmA@ mol/L DHB and 3

SymbolmA@ mol/L DHAP among dry-droplet and sandwich method.

Keywords Matrix assisted laser desorption-ionization; Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry; Peptide; Thinlayer method; Dry-droplet method

（Received 15 June 2011; accepted 10 November 2011）