摘 要 采用噬菌體展示肽庫技術(shù)篩選雷公藤內(nèi)酯醇的靶蛋白，得到了一個(gè)肽段，并通過酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）和免疫共沉淀驗(yàn)證了該片段對(duì)雷公藤內(nèi)酯醇的結(jié)合特異性。用Basic Local Alignment Search Tool （BLAST）進(jìn)行序列對(duì)比后，找到了77個(gè)匹配序列，其中最為匹配的序列是人類類固醇生成因子-1（hSF-1），因此hSF-1可能是雷公藤內(nèi)酯醇的一個(gè)潛在受體。在大腸桿菌中表達(dá)純化了hSF-1的配體結(jié)合域（LBD），熒光光譜實(shí)驗(yàn)表明雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)hSF-1-LBD有熒光淬滅作用、等溫滴定量熱（ITC）實(shí)驗(yàn)表明雷公藤內(nèi)酯醇與hSF-1-LBD發(fā)生焓驅(qū)動(dòng)的特異性結(jié)合，表面等離子體共振（SPR）實(shí)驗(yàn)表明雷公藤內(nèi)酯醇可以與hSF-1-LBD劑量依賴性結(jié)合， 這些都證實(shí)了hSF-1與雷公藤內(nèi)酯醇存在特異性相互作用。

關(guān)鍵詞 雷公藤內(nèi)酯醇；類固醇生成因子-1；噬菌體隨機(jī)肽庫；熒光光譜；等溫滴定量熱

2011-05-16收稿；2011-09-30接受

本文系國家自然科學(xué)基金支持（No81072712）

*E-mail: wjzheng@nju.edu.cn

1 引 言

雷公藤內(nèi)酯醇是從中草藥雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook F.）根中提取的一種二萜內(nèi)酯活性化合物。雷公藤用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、發(fā)燒、水腫以及各種癰腫（carbuncles）[1]。美國國家衛(wèi)生研究院資助的一項(xiàng)臨床試驗(yàn)證實(shí)，雷公藤對(duì)于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎具有顯著療效[2，3]。雷公藤內(nèi)酯醇具有多種生物活性，包括強(qiáng)力的抗炎及免疫抑制活性，有效的抗增殖及其抗癌作用等[4，5]。陸靜等[6]采用高效液相色譜發(fā)分離雷公藤內(nèi)酯醇的相關(guān)衍生物，探索了該藥物的穩(wěn)定性和可能的降解機(jī)理。有研究表明，雷公藤內(nèi)酯醇可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但具體是通過膜受體途徑還是線粒體途徑起作用[7～9]以及雷公藤內(nèi)酯醇誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是否依賴于p53都尚有爭議[10，11]。目前對(duì)雷公藤內(nèi)酯醇作用機(jī)理的研究主要集中在雷公藤內(nèi)酯醇的作用結(jié)果上，缺少對(duì)雷公藤內(nèi)酯醇靶蛋白的確定和作用途徑等核心問題的研究[12]。雖然Leuenroth等曾找到一些雷公藤內(nèi)酯醇可能的結(jié)合蛋白，但是尚缺乏直接的結(jié)合數(shù)據(jù)和深入的研究[13～15]。以往的研究顯示，雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)多種生物學(xué)途徑、多種生物分子都有影響，因此雷公藤內(nèi)酯醇可能存在多個(gè)作用靶點(diǎn)，篩選雷公藤內(nèi)酯醇的靶蛋白，對(duì)深入了解其作用機(jī)制、闡明其作用途徑，是十分必要的。

雷公藤內(nèi)酯醇很難被直接標(biāo)記和檢測，迄今沒有雷公藤內(nèi)酯醇的特異性抗體，而用[.3H]標(biāo)記雷公藤內(nèi)酯醇又非常復(fù)雜[13]。噬菌體肽庫展示技術(shù)是篩選生物分子多肽配體的一種有用工具，已經(jīng)成功用于篩選小分子化合物、蛋白質(zhì)甚至細(xì)胞的多肽配體[16～18]，因此用噬菌體肽庫展示技術(shù)篩選雷公藤內(nèi)酯醇的多肽配體確定其可能的靶蛋白，可能是一種有效的途徑。

雷公藤內(nèi)酯醇不含游離氨基或羧基，不能直接包被到多孔板上。用琥珀酸酐修飾雷公藤內(nèi)酯醇，并將它與卵清蛋白偶聯(lián)，命名為Tri-OVA[19]。由于增加了游離的羧基，Tri-OVA可以很容易地包被到多孔板上，成為雷公藤內(nèi)酯醇配體篩選及檢測的理想的起始材料。本研究采用兩種噬菌體展示肽庫（線性7肽庫和環(huán)7肽庫）篩選雷公藤內(nèi)酯醇多肽配體，最終從環(huán)7肽庫中富集到一組七肽序列。ELISA和免疫沉淀檢測均證明，出現(xiàn)頻率最高的七肽序列的噬菌體克?。–7C-1）與雷公藤內(nèi)酯醇親和力最高。用Basic Local Alignment Search Tool （BLAST）進(jìn)行序列比對(duì)后，確定其中得分較高的人類固醇生成因子1（Human steroidogenic factor-1，hSF-1）為雷公藤內(nèi)酯醇可能的靶蛋白之一。在大腸桿菌中表達(dá)并純化了hSF-1的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（LBD），通過熒光光譜實(shí)驗(yàn)、等溫滴定量熱（ITC）實(shí)驗(yàn)和表面等離子體共振（SPR）實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了hSF-1與雷公藤內(nèi)酯醇的特異性結(jié)合，證明雷公藤內(nèi)酯醇在體外可以與hSF-1特異性結(jié)合，但這種結(jié)合較弱。鑒于雷公藤內(nèi)酯醇生物學(xué)效應(yīng)的多樣性和廣泛性，推測雷公藤內(nèi)酯醇可能存在多個(gè)生物學(xué)靶點(diǎn)和其它特異性受體，需要進(jìn)一步的篩選和研究。2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 肽庫及宿主菌

噬菌體隨機(jī)環(huán)7肽庫（Ph.D.-C7C， 美國New England BioLabs公司）由南京大學(xué)沈萍萍饋贈(zèng)。肽庫利用大腸桿菌絲狀噬菌體M13構(gòu)建，隨機(jī)肽庫融合在次要衣殼蛋白pⅢ的N端，在大腸桿菌ER2738菌株中維持和擴(kuò)增。噬菌體的多樣性為1.2×10.9個(gè)轉(zhuǎn)化子，滴度為2×1011 pfu/

SymbolmA@ L，滴度測定按照說明書操作。

2.2 Tri-OVA的包被

雷公藤內(nèi)酯醇購自美國Sigma公司。雷公藤內(nèi)酯醇的修飾，及其與卵清蛋白（OVA）的偶聯(lián)參見文獻(xiàn)[19]。用包被緩沖液（0.1 mol/L NaHCO₃， pH 8.6）將偶聯(lián)產(chǎn)物Tri-OVA配成5 g/L，100

SymbolmA@ L/孔；微孔板用保鮮膜覆蓋后放入增濕容器，4 ℃過夜。TBST（20 mmol/L Tris-HCl， 150 mmol/L NaCl， 0.05% Tween 20， pH 7.5）洗滌3次，拍干；對(duì)照孔用相同濃度的OVA包被。用5 g/L BSA的包被液封閉，200

SymbolmA@ L/孔，37 ℃濕盒中作用3 h，TBST 洗滌3次，拍干。

2.3 噬菌體環(huán)7肽庫的篩選

10

SymbolmA@ L原始肽庫（1×1011 pfu/

SymbolmA@ L）用90

SymbolmA@ L TBS稀釋后加入對(duì)照孔中，室溫孵育30 min，以去除與OVA或者平板結(jié)合的噬菌體， 上清轉(zhuǎn)移到包被Tri-OVA的孔中。孵育1 h后棄上清液，TBST洗滌10次。加入100

SymbolmA@ L含0.1% BSA的0.2 mol/L Gly-HCl緩沖液（pH 2.2）洗脫結(jié)合噬菌體，室溫孵育10 min后加入15

SymbolmA@ L 1 mol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 9.1）中和洗脫液。收集后即為第一輪洗脫噬菌體（Output phage）。按照說明書測定噬菌體滴度并進(jìn)行擴(kuò)增。

后繼篩選過程按上述步驟進(jìn)行，但TBST中的Tween 20濃度增加至0.5%，洗滌次數(shù)增加至20次。第四輪、第五輪分別隨機(jī)挑取20和40個(gè)克隆進(jìn)行DNA測序。

2.4 檢測克隆對(duì)雷公藤內(nèi)酯醇的親和力

2.4.1 ELISA方法 如上所述制備Trip-OVA包被孔和對(duì)照孔，每孔加入2×1011 pfu的噬菌體克隆，室溫孵育2 h。TBS-0.5% Tween20 洗板6次。然后每孔加入100

SymbolmA@ L 1:1000 稀釋的HRP-anti-M13 抗體，室溫孵育1 h。TBST洗板6 次。加入200

SymbolmA@ L的底物液ABTS（含2，2′-Azino-bis（3-ethylbenz-thiazoline-6-sulfonic acid）的檸檬酸緩沖液，pH 4.0，30% H2O2），室溫孵育30 min后用酶標(biāo)儀檢測410 nm的OD值。

2.4.2 免疫沉淀法 雷公藤內(nèi)酯醇抗血清（本實(shí)驗(yàn)室制備）與Protein G-瓊脂糖4℃孵育過夜。同時(shí)將篩選到的噬菌體克?。?×1010 pfu）與2

SymbolmA@ g Trip-OVA 在4 ℃孵育過夜。相同數(shù)量的噬菌體克隆與2

SymbolmA@ g OVA孵育12 h后作為陰性對(duì)照。將抗血清和Protein G-瓊脂糖的混合物（總體積40

SymbolmA@ L）分別加到噬菌體和雷公藤內(nèi)酯醇的混合物管及陰性對(duì)照管中，4 ℃旋轉(zhuǎn)混勻5 h。按如下方法洗10次：加750

SymbolmA@ L TBS-0.1% Tween 20，溫和混勻，4 ℃ 500 r/min離心5 min，棄上清液，沉淀重懸并再次洗滌。最終沉淀重懸于100

SymbolmA@ L TBS-0.1% Tween 20中并檢測其噬菌體滴度。

2.5 hSF-1配體結(jié)合域（LBD）的克隆構(gòu)建和表達(dá)純化

根據(jù)Gene Bank中人SF-1的基因序列（NM-004959），設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增hSF-1的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（G220-T461），引物序列如下：

上游引物：5′-GGAATTCCATATGGGGCCCAACGTGCCTGAGCT-3′；

下游引物：5′-AAACTCGAGTCAAGTCTGCTTGGCTTGCAGCATTTC -3′；

Trizol法提取人腎上腺組織（江蘇省中醫(yī)院饋贈(zèng)）的總RNA，以逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板PCR擴(kuò)增hSF-1-LBD片段，連接到 pET28a載體（Invitrogen）構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-hSF-1-LBD。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21 Star， 3 mL過夜菌轉(zhuǎn)接至400 mL LB中，37 ℃培養(yǎng)至OD600=0.3，加入750

SymbolmA@ mol/L IPTG，20 ℃培養(yǎng)14 h。離心收集菌體，20 mL PBS重懸，超聲后12000 r/min離心15 min，上清液過Ni2＋柱。以含50 mmol/L咪唑的PBS洗去雜蛋白，含250 mmol/L咪唑的PBS洗脫目的蛋白，12% SDS-PAGE檢測蛋白純度。

2.6 驗(yàn)證雷公藤內(nèi)酯醇與hSF-1-LBD的結(jié)合的實(shí)驗(yàn)

2.6.1 熒光光譜方法 用磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）溶解蛋白和雷公藤內(nèi)酯醇，蛋白濃度為50 mg/L，配制雷公藤內(nèi)酯醇成與蛋白的摩爾比分別為0.5， 1， 2， 5和10的溶液。先加入200

SymbolmA@ L蛋白于石英比色皿中，再加入12

SymbolmA@ L不同濃度的雷公藤內(nèi)酯醇，室溫放置15 min后用熒光分光光度計(jì)（F7000，日本日立公司）檢測，激發(fā)波長280 nm，記錄290～450 nm的發(fā)射譜。發(fā)射與激發(fā)狹縫寬度為2.5 nm， 掃描速度為60 nm/min， 記錄hSF-1-LBD與雷公藤內(nèi)酯醇相互作用的同步熒光光譜。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)測量3次，并扣除背景，作熒光校正。

2.6.2 等溫滴定量熱（ITC）方法 用Microcal iTC200等溫滴定量熱儀（美國Microcal公司）檢測hSF-1-LBD與雷公藤內(nèi)酯醇的結(jié)合。雷公藤內(nèi)酯醇用PBS稀釋至0.4 g/L，DMSO的終濃度為8%。hSF-1-LBD蛋白用PBS稀釋至1.8 g/L，加入8% DMSO。60

SymbolmA@ L雷公藤內(nèi)酯醇溶液加入注射器，200

SymbolmA@ L蛋白加入樣品池。25 ℃恒溫，注射器轉(zhuǎn)速為1000 r/min，起始注射0.5

SymbolmA@ L，隨后以120 s的時(shí)間間隔注射19次，每次20

SymbolmA@ L。用ITC200自帶的Origin7軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。3 結(jié)果與討論

3.1 與雷公藤內(nèi)酯醇特異性結(jié)合的多肽克隆的篩選

洗脫的噬菌體滴度除以加入的噬菌體滴度即為回收率，從表1可見，從第1輪到第4輪，回收率從2.5×10

Symbolm@@ 9上升到了3.0×10

Symbolm@@ 7。而第5輪的回收率比第4輪只有輕微增加，表明5輪檢測后，結(jié)合雷公藤內(nèi)酯醇的噬菌體得到了有效富集。

3.2 對(duì)篩選到的噬菌體克隆進(jìn)行DNA測序

隨機(jī)選取第4輪篩選到的20個(gè)克隆測序，其中有3個(gè)具有相同的七肽序列：SKAYPHS。隨機(jī)選取第5輪篩選到的40個(gè)克隆進(jìn)行測序，得到4種重復(fù)序列，其中包括第4輪得到的重復(fù)序列SKAYPHS，并且重復(fù)率最高（7/40），結(jié)果見表2。

3.3 克隆C7C-1對(duì)雷公藤內(nèi)酯醇的親和力

3.3.1 ELISA檢測篩選結(jié)果 ELISA檢測結(jié)果如圖1所示，克隆C7C-1親和力最高，與SKAYPHS序列出現(xiàn)頻率最高一致。Tri-OVA包被孔的OD值是OVA包被孔的7倍，而在陰性對(duì)照中兩個(gè)孔的OD值相近。圖中數(shù)據(jù)均為3次檢測結(jié)果的平均值。

3.3.2 免疫沉淀法檢測結(jié)果 結(jié)果如圖2所示，C7C-1對(duì)雷公藤內(nèi)酯醇親和力最高，與ELISA結(jié)果一致。C7C-1對(duì)Tri-OVA的結(jié)合是OVA對(duì)照的22.8倍，表明免疫沉淀法相比ELISA具有更高的敏感性。圖中數(shù)據(jù)為3次檢測結(jié)果的平均值。

Fig．1 Detection of selected phage clones by ELISA

Fig．2 Detection of selected phage clones by immunoprecipitation assay

3.4 C7C-1克隆序列比對(duì)

對(duì)篩選到的重復(fù)頻率最高的七肽序列SKAYPHS用BLAST對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索后，得到了77個(gè)蛋白序列。綜合考慮，確定其中得分較高的人類固醇生成因子1（hSF-1）為雷公藤內(nèi)酯醇可能的靶蛋白之一。

3.5 hSF-1配體結(jié)合域（LBD）的克隆構(gòu)建和表達(dá)純化 圖3 hSF-1-LBD序列PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖

Fig．3 Gel electrophoresis diagram of hSF-1-LBD PCR products

M. DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DNA marker）； 1. 擴(kuò)增產(chǎn)物（PCR products）。

根據(jù)NCBI中hSF-1基因的保守序列設(shè)計(jì)引物，以人腎上腺組織的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得了大小為751 bp的目的條帶（圖3）。

構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET28a-hSF-1-LBD經(jīng)測序驗(yàn)證后，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE結(jié)果如圖4所示，誘導(dǎo)后得到了目的蛋白。經(jīng)Ni2＋柱純化，純度約為97.3%。

3.6 驗(yàn)證雷公藤內(nèi)酯醇與hSF-1-LBD的結(jié)合

3.6.1 熒光光譜方法 熒光光譜檢測結(jié)果（圖5）顯示，在280 nm激發(fā)波長下，hSF-1-LBD在330 nm處有較強(qiáng)的熒光發(fā)射峰。隨著雷公藤內(nèi)酯醇濃度的增加，hSF-1-LBD的內(nèi)源熒光強(qiáng)度在330 nm附近有規(guī)律地降低，說明雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)hSF-1-LBD的熒光有猝滅現(xiàn)象。激發(fā)波長280 nm時(shí)色氨酸最大熒光發(fā)射峰為330 nm，而復(fù)合體系在330 nm處熒光強(qiáng)度顯著降低，表明雷公

Fig．4 SDS-PAGE diagram of hSF-1-LBD expression and purification

1. 超聲后的沉淀（Precipitate after sonication）； 2. 超聲后的上清液（Supernatant after sonication）； 3. 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)（Protein marker）； 4，5. 穿透組分（Penetration）； 6. 50 mmol/L咪唑洗脫液（Elution by 50 mmol/L imidazole）； 7. 250 mmol/L咪唑洗脫液（Elution by 250 mmol/L imidazole）； 箭頭標(biāo)注為目的蛋白（Arrow indicates the target protein）。

Fig．5 Influence of triptolide on hSF-1-LBD fluorescence spectrum by triptolide

a． 25 mg/L hsf-1-LBD蛋白（hsf-1-LBD protein）；b～f． 蛋白與雷公藤內(nèi)酯醇的摩爾比分別為1∶0.5，1∶1， 1∶5， 1∶10， 1∶20（Mol ratio of protein and triptolide: 1∶0.5，1∶1， 1∶5， 1∶10， 1∶20）。

藤內(nèi)酯醇與hSF-1-LBD結(jié)合時(shí)接近色氨酸。測定雷公藤內(nèi)酯醇溶液在激發(fā)波長280 nm處無熒光，因此可忽略內(nèi)濾光效應(yīng)。滴定過程中，加入雷公藤內(nèi)酯醇的累加體積遠(yuǎn)小于蛋白溶液體積，可忽略稀釋效應(yīng)對(duì)蛋白熒光強(qiáng)度的影響。根據(jù)圖5中的數(shù)據(jù)，由Stern-Volmer方程：F0/F＝1＋KSV [Q]＝1＋Kqτ0[Q ]，計(jì)算得到雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)hSF-1-LBD的熒光猝滅速率常數(shù)Kq約為2.0 ×1012 L/（mol#8226;s），遠(yuǎn)大于各類猝滅劑對(duì)生物大分子的最大擴(kuò)散碰撞猝滅速率常數(shù)2.0 ×1010 L/（mol#8226;s）。說明雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)于hSF-1-LBD的熒光猝滅是由于二者形成了復(fù)合物而引起的靜態(tài)猝滅。

3.6.2 ITC方法 ITC實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖6）表明，雷公藤內(nèi)酯醇與hSF-1-LBD反應(yīng)的熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)ΔH為

Symbolm@@ 507.2 cal/mol， ΔS為18.2 cal/（mol#8226;deg）， 反映了hSF-1-LBD與雷公藤內(nèi)酯醇發(fā)生了焓驅(qū)動(dòng)的特異性相互作用，這種相互作用符合單位點(diǎn)結(jié)合模式。但平衡常數(shù)（SD＝2.24×10.4 mol

Symbolm@@ 1）較小，表明二者的結(jié)合作用比較弱。本研究采用表面等離子體共振（SPR）方法的結(jié)果顯示，雷公藤內(nèi)酯醇流經(jīng)偶聯(lián)hSF-1-LBD的芯片后，芯片表面的RU值升高，證實(shí)了雷公藤內(nèi)酯醇與hSF-1-LBD蛋白發(fā)生了結(jié)合，并呈劑量依賴性芯片。

Fig．6 Isothermal titration calorimetry （ITC） experiments for interactions of triptolide with hSF-1-LBD

3.7 雷公藤酯醇厚的生物學(xué)效應(yīng)

雷公藤內(nèi)酯醇具有多種明確的生物學(xué)效應(yīng)，而且前期的構(gòu)效關(guān)系研究顯示雷公藤內(nèi)酯醇的不同生物學(xué)效應(yīng)可能依賴于不同的功能基團(tuán)，因此可以認(rèn)為雷公藤內(nèi)酯醇可能存在多種不同的靶蛋白，不同的生物學(xué)效應(yīng)與不同的靶蛋白及不同的作用途徑之間存在對(duì)應(yīng)關(guān)系。這種對(duì)應(yīng)關(guān)系將有助于指導(dǎo)藥物分子的修飾和改造，開發(fā)高效低毒、特異性針對(duì)某一條作用途徑起作用的藥物分子。

通過噬菌體表面展示肽庫技術(shù)篩選到與雷公藤內(nèi)酯醇特異性結(jié)合的氨基酸序列，并通過序列比對(duì)確定hSF-1可能是雷公藤內(nèi)酯醇的靶蛋白之一。實(shí)驗(yàn)證明，雷公藤內(nèi)酯醇與hSF-1的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（LBD）存在特異性的相互作用，雖然這種作用力比較弱，但是屬于直接的相互作用。當(dāng)然體外研究不能代表在細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)情況，還需要在細(xì)胞水平上進(jìn)一步驗(yàn)證hSF-1與雷公藤內(nèi)酯醇的特異性作用。

References

1 Ding G S. Clin. Ther.， 1987， 9（4）： 345～357

2 Tao X， Cush J J， Garret M， Lipsky P E. J. Rheumatol.， 2001， 28（10）： 2160～2167

3 Tao X， Younger J， Fan F Z， Wang B， Lipsky P E. Arthritis Rheum， 2002， 46（7）： 1735～1743

4 Lu H， Hachida M， Enosawa S， Li X K， Suzuki S， Koyanagi H. Transplant Proc.，1999， 31（5）： 2056～2057

5 Lue Y， Sinha Hikim A P， Wang C， Leung A， Baravarian S， Reutrakul V， Sangsawan R， Chaichana S， Swerdloff R S. J. Androl.， 1998， 19（4）： 479～486

6 LU Jing， XIANG Li-Li， JI Min， CHEN Dong-Ying. Chinese J. Anal.Chem.， 2011， 39（8）： 1266～1269

陸 靜， 象麗麗， 季 盿， 陳東英. 分析化學(xué)， 2011， 39（8）： 1266～1269

7 Wang X， Matta R， Shen G， Nelin L D， Pei D， Liu Y. J. Mol. Med.， 2006， 84（5）： 405～415

8 Wan C K，Wang C， Cheung H Y， Yang M， Fong W F. Cancer Lett.， 2006， 241（1）： 31～41

9 Carter B Z， Mak D H， Schober W D， McQueen T， McQueen T， Harris D， Estrov Z， Evans R L， Andreeff M. Blood， 2006， 108（2）： 630～637

10 Jiang X H，Wong B C， Lin M C， Zhu G H，Kung H F， Jiang S H， Yang D， Lam S K. Oncogene， 2001， 20（55）： 8009～8018

11 Kiviharju T M， Lecane P S， Sellers R G， Peehl D M. Clin. Cancer Res.， 2002， 8（8）： 2666～2674

12 XU Xiao-Yu， ZHENG Wei-Juan， Hua Zi-Chun. Chinese Medicinal Biotechnology， 2009， 10（4）： 367～369

徐曉昱， 鄭偉娟， 華子春. 中國醫(yī)藥生物技術(shù)， 2009， 10（4）： 367～369

13 McCallum C， Kwon S， Leavitt P， Shen DM， Liu W， Gurnett A. Immunobiology， 2007， 212（7）： 549～556

14 Leuenroth S J， Crews C M. Cancer Res.， 2008， 68（13）： 5257～5266

15 Leuenroth S J， Crews C M. Chem. Biol.， 2005， 12（12）： 1259～1268

16 Smith G P. Science， 1985， 228（4705）： 1315～1317

17 Goldman1 E R， Pazirandeh M P， Charlesb P T， Balighianb E D. Anal. Chim. Acta， 2002， 457（15）： 13～19

18 McGuire M J， Li S， Brown K C. Methods Mol. Biol.， 2009， 504： 291～321

19 TANG Bo， LIU Xiao， XU Xiao-Yu， YAO Qi-Zheng， ZHENG Wei-Juan， HUA Zi-Chun. J. Southeast Univ. （Med. Sci. Edi.）， 2008， 27（6）： 409～414

唐 波， 劉 曉， 徐曉煜， 姚其正， 鄭偉娟， 華子春. 東南大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）， 2008， 27（6）： 409～414

20 YU De-Quan， ZHANG Dong-Ming， WANG Huai-Bin，LIANG Xiao-Tian. Acta Pharmaceutica Sinica，1992， 27（11）： 830～836

于德泉， 張東明， 王淮濱， 梁曉天. 藥學(xué)學(xué)報(bào)， 1992， 27（11）： 830～836

Selection of Triptolide Ligands from a Random Phage Display

Library and Primary Verification of Their Combination

YANG Xu-Guang.1， XU Xiao-Yu.1， LI Jia-Huang.1， YAO Qi-Zheng.2，

ZHU Tong-Yang.1， HUA Zi-Chun.1， ZHENG Wei-Juan*1

.1（State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology，

School of Life Science， Nanjing University， Nanjing 210093， China）

.2（School of Pharmacy， China Phamaceutical University， Nanjing 210009， China）

Abstract Triptolide is an extract from the Chinese herb Tripterygium wilfordii Hook f. We screened out a peptide from a C7 phage display library and presumed it was a potential peptide ligand for triptolide. The specificity of the selected clone for triptolide was confirmed by ELISA and immunoprecipitation. After DNA sequencing， a BLAST search was carried out and 77 matching sequences was retrieved. The most promising candidate is human steroidogenic factor-1 （hSF-1）， a member of the nuclear receptor family that controls the synthesis of steroid hormones by regulating steroidogenic enzyme genes. We purified the ligand binding domain （LBD） of hSF-1 and then used it for further experiments. Fluorescence spectrum experiments showed that triptolide could cause fluorescence quenching of hSF-1-LBD， isothermal titration calorimetric（ITC） measurements showed a enthalpy-driven interaction between triptolide and hSF-1-LBD， and a dose-dependent interaction between them was observed by surface plasmon resonance（SPR）. All these results confirmed the specific interaction between hSF-1 and triptolide.

Keywords Triptolide; Human steroidogenic factor-1; Phage display; Fluorescence spectrum; Isothermal titration calorimetry; Surface plasmon resonance

（Received 16 May 2011; accepted 30 September 2011）