摘 要 以鹽酸克倫特羅為模板分子，采用沉淀聚合法合成了克倫特羅的分子印跡聚合物，并以其為離子載體，制得分子印跡聚合物膜克倫特羅離子選擇性電極。在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，電極對克倫特羅陽離子的檢出限可達(dá)7.0 × 10

Symbolm@@ 8 mol/L，線性范圍為1.0 × 10

Symbolm@@ 7～1.0 × 10

Symbolm@@ 4 mol/L，能斯特斜率為55.7 mV/decade。此電極具有優(yōu)越的選擇性、快速的響應(yīng)時(shí)間以及良好的穩(wěn)定性；已成功應(yīng)用于實(shí)際豬尿樣品中克倫特羅的測定，加標(biāo)回收率為98%～107%，檢測時(shí)間小于3 min。

關(guān)鍵詞 分子印跡聚合物； 電位型傳感器； 克倫特羅

2011-08-10收稿；2011-09-22接受

本文系國家自然科學(xué)基金（No. 20977073）、山東省自然科學(xué)杰出青年基金（No.JQ200814）以及山東省“泰山學(xué)者”人才計(jì)劃項(xiàng)目資助

* E-mail: wqin@yic.ac.cn

1 引 言

“瘦肉精”的主要化學(xué)成分包括克倫特羅、萊克多巴胺以及沙丁醇胺等，其中在中國使用最廣泛的是克倫特羅?？藗愄亓_是一種腎上腺素類神經(jīng)興奮劑，早期僅用于醫(yī)學(xué)急救和肺病平喘；后來發(fā)現(xiàn)，將其作為飼料添加劑用于畜牧生產(chǎn)時(shí)，可以提高動(dòng)物瘦肉率。然而，克倫特羅使用后會在動(dòng)物體組織中殘留，人食用后會對肝、腎等內(nèi)臟器官造成損害，嚴(yán)重者甚至?xí)劳鯷1]。2011年，我國相繼發(fā)生的“瘦肉精”事件，引起了人們對克倫特羅的高度關(guān)注，因此開發(fā)生物樣品中克倫特羅檢測方法具有重要意義。

目前，檢測克倫特羅的方法主要有高效液相色譜法（HPLC）[2]、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）[3]、金標(biāo)快速檢測卡、免疫層析［4］和酶聯(lián)免疫法（ELISA）[5]等。然而，HPLC和GC-MS法存在儀器成本高，分析速度慢等缺點(diǎn)；金標(biāo)快速檢測卡法的假陽性率高，干擾因素較多；ELISA法多用于定性檢測，難以進(jìn)行準(zhǔn)確定量?；瘜W(xué)傳感器因其具有操作簡單、攜帶方便、易于現(xiàn)場監(jiān)測等優(yōu)越性能而備受關(guān)注。聚合物敏感膜離子選擇性電極是化學(xué)傳感器的重要分支，它具有裝置簡單、成本低廉、選擇性高等諸多優(yōu)點(diǎn)，已成功應(yīng)用于工業(yè)分析、臨床化驗(yàn)、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域[6～8]。然而，采用離子選擇性電極電位法檢測克倫特羅的研究還未見報(bào)道。

分子印跡聚合物（MIPs）是通過分子印跡技術(shù)合成對目標(biāo)分子具有特異性識別功能的聚合物[9，10]。MIPs能夠顯著提高分析方法的選擇性和靈敏度，且MIPs具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性， 可以抵抗檢測的惡劣環(huán)境。因此MIPs是離子選擇性膜電極在復(fù)雜基體中實(shí)現(xiàn)可靠檢測的理想離子載體。本研究以克倫特羅分子印跡聚合物作為離子載體，采用離子選擇性電極法，實(shí)現(xiàn)了豬尿液中克倫特羅的快速、高靈敏、高選擇性電位檢測。2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

PXSJ-216離子計(jì)（上海精科公司）；DU-800紫外/可見光分光光度計(jì)（美國Beckman公司）；S-4800冷場發(fā)射掃描電鏡（日本日立公司）。

鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院）；甲基丙烯酸（MAA）、甲基丙烯酸甲酯（MMA）、丙烯酸三甲氧基丙烷三甲酯（TRIM）、二乙烯基苯80（DVB 80）、高分子量聚氯乙烯（PVC）、鄰硝基苯辛醚（o-NPOE）、四（3，5-二（三氟甲基）苯基）硼酸鈉（NaTFPB）、四氫呋喃（THF）及鹽酸萊克多巴胺（Sigma-Aldrich公司）；偶氮二異丁腈（AIBN，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）。MAA、TRIM、DVB 80以及THF使用前須真空蒸餾，AIBN使用前經(jīng)甲醇重結(jié)晶，其余試劑均為分析純試劑直接使用。實(shí)驗(yàn)用水均為二次去離子水（Pall Cascada，18.2 MΩ cm）。0.1 mmol/L克倫特羅（pKa＝9.6）溶液采用5 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液（pH 7.4）配制，以保證克倫特羅以陽離子形式存在；其余濃度均采用緩沖溶液逐級稀釋得到。

2.2 克倫特羅分子印跡聚合物的合成

采用沉淀聚合法合成克倫特羅分子印跡聚合物[11]，具體合成步驟如下：取0.4 mmol鹽酸克倫特羅、2.5 mmol MAA和0.83 mmol MMA，溶于40 mL甲醇中，靜置1 h。將1 mmol TRIM和0.4 mmol DVB及0.5 mmol AIBN加入到上述混合物中，通氮?dú)?0 min。將上述反應(yīng)容器在氮?dú)夥諊旅芊?，?0 ℃下反應(yīng)24 h，得到白色固體顆粒。將所得白色固體顆粒分別采用甲醇-乙酸溶液（9∶1，V/V）及甲醇多次洗滌，直至洗脫液于紫外光譜下λ＝245 nm處無吸收峰為止。非分子印跡聚合物（NIP）的制備步驟除不加入鹽酸克倫特羅外，其余均與分子印跡的制備過程相同。模板克倫特羅分子以及功能單體MAA與MMA的分子結(jié)構(gòu)式如下所示：

2.3 分子印跡聚合物膜離子選擇性電極的制備

電極膜由分子印跡聚合物（MIP）或非分子印跡聚合物（NIP）、親脂性的陽離子交換劑（NaTFPB）、增塑劑（o-NPOE）和膜基體（PVC）組成。取5.0% （w/w）MIP或NIP、1.0% （w/w）NaTFPB 、62.6% （w/w） o-NPOE及31.4% （w/w） PVC，共360.0 mg，溶于3.5 mL THF中，得到電活性物質(zhì)溶液。攪拌2 h至溶液均勻后，倒入直徑為3.6 cm的玻璃圓環(huán)中，室溫下自然揮發(fā)12 h，即得分子印跡聚合物敏感膜。利用打孔器將敏感膜切割成直徑9 mm的均勻圓形切片，采用THF將敏感膜粘附于聚氯乙烯管頂端。測定電極對克倫特羅的電位響應(yīng)時(shí)，電極內(nèi)充液和活化液均為1.0 ×10

Symbolm@@ 4 mol/L克倫特羅溶液（5 mmol/L Tris-HCl溶液，pH 7.4），使用前活化24 h。測定選擇性系數(shù)時(shí)，電極內(nèi)充液和活化液均為0.01 mol/L NaCl，使用前活化24 h。

2.4 檢測方法

以自制分子印跡電極為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，采用PXSJ-216離子計(jì)記錄電極電位。其中，測試電池的結(jié)構(gòu)為：Hg2Cl2， Hg|KCl（飽和溶液）|待測液|PVC敏感膜|內(nèi)充液|Ag， AgCl （3 mol/L KCl）。采用Henderson公式和Debye-Hückel方程分別對液接電位及活度系數(shù)進(jìn)行校正。

3 結(jié)果與討論

3.1 MIP與NIP形貌表征

采用掃描電鏡對所合成的克倫特羅MIP與NIP顆粒進(jìn)行了形貌表征。如圖1a所示，沉淀聚合所得

圖1 克倫特羅分子印跡聚合物以及非印跡聚合物顆粒的掃描電鏡圖

Fig．1 SEM images of obtained （a） clenbuterol-MIP and （b） NIP beads

到的MIP顆粒粒徑較規(guī)整均一，粒徑多分布在0.5～1.0

SymbolmA@ m之間。根據(jù)本研究組已報(bào)道的研究結(jié)果[12]可知，與主體聚合所得到的不規(guī)則粒徑顆粒相比，粒徑均一的MIP顆粒較易分散于PVC基體的聚合物膜相中，從而使得膜相中產(chǎn)生更多的有效鍵合位點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，采用粒徑均一的MIP顆粒作為載體的電極響應(yīng)時(shí)間較短，且電位噪音較小。由圖1b可知，NIP與MIP顆粒具有類似的表觀形貌與粒徑分布。

3.2 電極膜組成優(yōu)化

聚合物膜組成對電極響應(yīng)性能有重要影響。本實(shí)驗(yàn)的離子選擇性電極膜組分包括MIP、NaTFPB、增塑劑及PVC。其中，MIP是離子載體。MIP上的功能單體MAA和MMA中的氧基可與克倫特羅分子中的氨基形成較強(qiáng)的氫鍵作用，選擇性地識別克倫特羅陽離子，并將其萃取入有機(jī)膜相；NaTFPB作為陽離子交換劑，不僅可以提供陽離子位點(diǎn)及提高電極的選擇性，而且有利于降低電極膜阻抗；增塑劑可以將離子載體與離子位點(diǎn)均勻溶解于膜中，并促進(jìn)膜內(nèi)離子的遷移；PVC構(gòu)成膜的基體部分，保證有機(jī)液膜具有良好的機(jī)械穩(wěn)定性。如表1所示，離子交換劑含量對電極響應(yīng)性能有較大影響。隨著離子交換劑含量增加， 電極能斯特響應(yīng)范圍逐漸變寬，但當(dāng)其含量超過1%時(shí)，電極響應(yīng)范圍變窄，推測可能為離子交換劑量越大，膜上陽離子位點(diǎn)越多，導(dǎo)致膜對干擾離子選擇性降低。離子載體MIP的含量決定了電極膜上選擇性鍵合位點(diǎn)的數(shù)量，伴隨著MIP的加入，電位線性響應(yīng)范圍逐漸變寬；然而，當(dāng)MIP的量大于5%時(shí)，MIP在膜相中難以完全分散，膜變得不透明，導(dǎo)致電極響應(yīng)性能降低。另外，極性增塑劑o-NPOE（介電常數(shù)εr＝24.0）與非極性增塑劑DOS（εr＝4.8）或DOP（εr＝5.0）相比，相應(yīng)電極具有更寬的線性響應(yīng)范圍。這可能是由于在極性條件下，電極對于克倫特羅陽離子具有更高的選擇性。本實(shí)驗(yàn)中，膜電極的最佳組成為31.3%（w/w）PVC，62.7%（w/w）NPOE，1%（w/w）NaTFPB，5% （w/w）MIP。

51.7±0.5 .a 3次測量平均值 ±標(biāo)準(zhǔn)偏差 （Average from three measurements ±standard deviation）\\.NPOE: Nierophenyl octyl ether ; DOP: Dioctyl phthalate; NaTFPB: Sodiom tetrakis ［3，5-bis（trifluoro-methyl）phenyl］borate.

Fig．2 Effect of sample pH on the electrode response of 0.1 mmol/L clenbuterol

3.3 溶液pH值的影響

在pH 1～11范圍內(nèi)，考察了樣品酸度對電極電位檢測的影響，結(jié)果如圖2所示。在pH 7.0～8.5范圍內(nèi)，電極電位響應(yīng)基本恒定。當(dāng)pH＞8.5時(shí)，電極電位逐漸下降，這是因?yàn)殡S著溶液pH值升高，克倫特羅將逐漸以電中性分子形式存在，而無法被離子選擇性電極所檢測；當(dāng)pH＜7.0時(shí)，電極電位響應(yīng)逐漸降低，其原因可能是克倫特羅在酸性條件下發(fā)生水解反應(yīng)，導(dǎo)致其濃度減小[13]。

3.4 電極校正曲線

如圖3所示，在最佳電極膜組成條件下， MIP膜電極響應(yīng)的線性范圍

Symbolm@@ 8 mol/L。可以看出，MIP膜電極與對照（NIP）膜電極以及空白膜（不含任何印跡聚合物）電極相比線性響應(yīng)范圍更寬、檢出限更低。MIP膜電極良好的電位響應(yīng)歸因于電極敏感膜中的MIP與待測克倫特羅陽離子之間的強(qiáng)特異性鍵合作用，而NIP膜電極以及空白膜電極的弱電位響應(yīng)緣于電極膜對于克倫特羅陽離子的非特異性結(jié)合作用。

3.5 選擇性研究

由于動(dòng)物尿液樣品組成復(fù)雜，需要考慮共存離子對于電極檢測的影響。研究中采用分別溶液法測定電極的選擇性系數(shù)[14]，由Nicolskii-Eisenman方程計(jì)算電極對干擾離子的選擇性系數(shù)KpotI，J [15]。如表2所示，所采用的分子印跡聚合物膜離子選擇性電極對實(shí)際樣品中常見無機(jī)干擾離子及有機(jī)胺類化合物具有良好的選擇性，其中對Na.＋， K.＋， Ca2＋， Mg2＋， NH.＋4及萊克多巴胺陽離子的選擇性系數(shù)logKpotI， J分別為

由此證明，所采用的電極適用于動(dòng)物尿液中克倫特羅的電位測定。另外，分子印跡膜電極對常見的

.a 括號中為NIP膜電極的選擇性系數(shù) （Values in parentheses are the selectivity coefficients for NIP membrane electrode）。

Na.＋， K.＋的選擇性比非分子印跡對照膜電極更加優(yōu)越，從而進(jìn)一步證明了分子印跡方法的有效性。

3.6 電極響應(yīng)時(shí)間與穩(wěn)定性

測定了電極檢測克倫特羅的響應(yīng)時(shí)間（達(dá)95%平衡電位的時(shí)間），結(jié)果如圖4所示。當(dāng)克倫特羅濃度在1×10

Symbolm@@ 5～1×10

Symbolm@@ 4 mol/L之間變化時(shí)，電極響應(yīng)時(shí)間小于5 s。待測的克倫特羅溶液的濃度無論從低到高（1×10

Symbolm@@ 5～1×10

Symbolm@@ 4 mol/L）變化，還是從高到低（1×10

Symbolm@@ 4～1×10

Symbolm@@ 5 mol/L）變化，電極電位響應(yīng)均能在相同的時(shí)間內(nèi)達(dá)到相應(yīng)的平衡電位值，從而證明所研制的傳感器具有良好的可逆性。通過對電極長期穩(wěn)定性考察發(fā)現(xiàn)， 電極干態(tài)放置于4 ℃ 條件下儲存1個(gè)月后，電位響應(yīng)變化的相對偏差為6.4%。

3.7 實(shí)際樣品分析

將分子印跡聚合物膜離子選擇性電極應(yīng)用于豬尿樣品中克倫特羅含量的測定，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法計(jì)算經(jīng)0.22

SymbolmA@ m微孔濾膜過濾的豬尿樣品，測試結(jié)果見表3。樣品的加標(biāo)回收率在98%～107%之間，說明此分子印跡電位型傳感器具有較高的準(zhǔn)確性；另外，豬尿樣品僅經(jīng)簡單過濾而直接測定且電極響應(yīng)時(shí)間較短，總檢測時(shí)間在3 min內(nèi)。因此，本方法有望用于豬尿液樣品中克倫特羅含量的快速、準(zhǔn)確檢測。

圖4 分子印跡聚合物膜電極響應(yīng)時(shí)間測定

Fig．4 Potential response of the MIP based ISE

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Potentiometric Sensor Based on Molecularly Imprinted Polymer for

Rapid Determination of Clenbuterol in Pig Urine

LIANG Rong-Ning.1， GAO Qi1，2， QIN Wei*1

.1（Chinese Academy of Sciences and Shandong Provincial Key Laboratory of Coastal Zone Environmental Processes，

Yantai Institute of Coastal Zone Research， Chinese Academy of Sciences， Yantai 264003， China）

.2（Graduate University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China）

Abstract A polymeric membrane ion-selective electrode for the determination of clenbuterol is described. It is based on a molecularly imprinted polymer （MIP） as an ionophore for molecular recognition， which can be synthesized by precipitation polymerization using clenbuterol hydrochloride as a template molecule. Under the optimized conditions， the proposed membrane electrode exhibits Nernstian response to the protonated clenbuterol over the concentration range of 1.0×10

Symbolm@@ 7－1.0×10

Symbolm@@ 4 mol/L with a slope of 55.7 mV/decade， and the detection limit is 7.0×10

Symbolm@@ 8 mol/L. The MIP-based sensor shows excellent selectivity， rapid response time and satisfactory long-term stability. The potentiometric sensor has been successfully applied to determine the clenbuterol in pig urine samples with recoveries between 98% and 107% and an analytical time of less than 3 min.

Keywords Molecularly imprinted polymer; Potentiometric sensor; Clenbuterol

（Received 10 August 2011; accepted 22 September 2011）