1 引 言

生脈注射液是由紅參、麥冬和五味子3種藥材經(jīng)提取后制成的滅菌水溶液，為國(guó)家中藥保護(hù)品種，具有益氣養(yǎng)陰，復(fù)脈固脫的功效。前期的分析實(shí)驗(yàn)表明，生脈注射液中含有有機(jī)酸類成分。根據(jù)生脈注射液的生產(chǎn)工藝和3種藥材的的化學(xué)成分研究報(bào)道，分析生脈注射液中的有機(jī)酸主要來(lái)源于五味子。五味子含有檸檬酸、蘋(píng)果酸、琥珀酸等多種有機(jī)酸成分。目前，有機(jī)酸的分析方法有氣相色譜法[1]、高效液相色譜法[2]、毛細(xì)管電泳法[3]及離子色譜法[4]。這些方法專屬性差或樣品制備繁瑣，而離子排斥色譜法（IEC）樣品前處理簡(jiǎn)單[5]，準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好，適合于同時(shí)定量分析多種有機(jī)酸。本研究利用離子排斥色譜法對(duì)生脈注射液中的主要水溶性有機(jī)酸進(jìn)行了分析，結(jié)果穩(wěn)定可靠。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑 850離子色譜儀（瑞士Metrohm公司），配備電導(dǎo)檢測(cè)器、英藍(lán)超濾系統(tǒng)、magIC Net 工作站；Sartorius BT 224S型電子天平。生脈注射液由國(guó)內(nèi)4個(gè)廠家提供。檸檬酸、蘋(píng)果酸、琥珀酸（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；H2SO₄（分析純，北京化工廠）； 丙酮（色譜純，J. T. Baker USA）； 實(shí)用用水為Millipore高純水。

2.2 對(duì)照品及供試品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取檸檬酸119.2 mg，蘋(píng)果酸130.3 mg，琥珀酸55.5 mg，置于50 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度得對(duì)照品儲(chǔ)備液，用水稀釋配成系列濃度的混合標(biāo)樣；取生脈注射液2 mL于50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45

SymbolmA@ m 濾膜過(guò)濾， 取續(xù)濾液。

2.3 色譜條件 Transgenomic Sep-ION-300色譜柱（300 mm×7.8 mm i.d.， 8

SymbolmA@ m）；淋洗液：5 mmol/L H2SO₄：丙酮（95∶5， V/V）；進(jìn)樣體積20

SymbolmA@ L，流速0.4 mL/min，柱溫70 ℃。抑制系統(tǒng)：100 mmol/L LiCl。

3 結(jié)果與討論

3.1 Transgenomic Sep-ION-300色譜柱分離機(jī)理 Transgenomic Sep-ION-300色譜柱的填料是完全磺化的聚苯乙烯/二乙烯苯（ PS/DVB ）共聚物，因填料完全磺化，填料表現(xiàn)為帶負(fù)電荷的球體，不帶電荷的分析物可被填料吸附。這種平衡可由有機(jī)酸的酸解離常數(shù)（pKa）調(diào)節(jié)。因此，分析物按離子排斥的機(jī)理得到分離， 并按pKa的順序先后洗脫。生脈注射液中主要含有的3種有機(jī)酸： 檸檬酸、蘋(píng)果酸和琥珀酸，它們的pKa值分別為3.13， 3.40和4.21，保留時(shí)間分別為13.9， 16.6和19.7 min，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Transgenomic Sep-ION-300色譜柱的分離機(jī)理相互印證。

3.2 色譜條件的優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)分別考察了不同濃度的H2SO₄，以及不同配比的H2SO₄/Acetone等多種淋洗液。結(jié)果表明，在淋洗液中加入丙酮，可以有效改善有機(jī)酸的峰形，提高靈敏度，同時(shí)提高目標(biāo)化合物檸檬酸、蘋(píng)果酸、琥珀酸與雜質(zhì)的分離度； 而H2SO₄和丙酮的濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不大，因此通過(guò)幾組實(shí)驗(yàn)對(duì)比，并考慮實(shí)驗(yàn)時(shí)間和成本等因素，最終選用5 mmol/L H2SO₄和5% Acetone為有機(jī)酸分析的淋洗液。對(duì)柱溫也進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，選取高柱溫70 ℃有利于改善峰形，提高分離度。采用LiCl為再生液，由于Li的電導(dǎo)率比H低，經(jīng)過(guò)抑制后，將淋洗液中的H2SO₄轉(zhuǎn)化為電導(dǎo)率更低的Li2SO₄，降低背景，提高靈敏度。在上述確定的色譜條件下，對(duì)照品及樣品的典型色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 有機(jī)酸對(duì)照品 （A） 和生脈注射液色譜圖 （B）

Fig．1 Chromatograms of standard solution of organic acids （A） and Sheng-mai Injection （B）

1．檸檬酸（Citric acid）；2. 蘋(píng)果酸（Malic acid）；3. 琥珀酸（Succinic acid）。

3.3 線性關(guān)系及檢出限

取適量對(duì)照品儲(chǔ)備液，稀釋成系列濃度的混合標(biāo)樣，采用本方法測(cè)定。檸檬酸、蘋(píng)果酸和琥珀酸分別在7.45～476.5 mg/L，8.14～521.0 mg/L和3.47～222.0 mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系；檢出限分別為0.8， 0.5和0.8 mg/L。

3.4 精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性 取混合對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，檸檬酸、蘋(píng)果酸和琥珀酸峰面積RSD分別為2.3%， 1.4%和0.4%。取同一批注射液樣品，平行制備6份供試品溶液，測(cè)定含量，檸檬酸、蘋(píng)果酸和琥珀酸含量的RSD分別為1.4%， 1.1%和1.3%。

取同一份供試品溶液，分別于0， 2， 8， 16和24 h進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明，檸檬酸、蘋(píng)果酸和琥珀酸在24 h內(nèi)穩(wěn)定，RSD分別為1.3%， 1.2%和2.3%。

3.5 回收率實(shí)驗(yàn) 取有機(jī)酸對(duì)照品（檸檬酸122.8 mg，蘋(píng)果酸45.2 mg，琥珀酸34.8 mg），置于50 mL容量瓶中，以水定容，得對(duì)照品儲(chǔ)備液；取2 mL已知含量的生脈注射液9份，置于50 mL容量瓶中，分為3組，分別加入對(duì)照品儲(chǔ)備液2.5，3.0和3.5 mL（加入量近似為2 mL樣品中檸檬酸、蘋(píng)果酸和琥珀酸含量的80%，100%和120%），加水稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液測(cè)定。根據(jù)測(cè)得量和加入量計(jì)算回收率。檸檬酸、蘋(píng)果酸和琥珀酸的平均回收率分別為97.1%，96.9%和95.1%，RSD分別為2.7%，2.3%和1.9%。

3.6 樣品測(cè)定 分別對(duì)4個(gè)廠家15批樣品進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，不同廠家3種有機(jī)酸的含量差異很大，檸檬酸、蘋(píng)果酸和琥珀酸的含量分別在0.0071～4.6727 g/L，0.0608～2.1169 g/L和0.0202～0.8641 g/L之間；3種有機(jī)酸含量之和在0.0917～7.3535 g/L之間。生脈注射液中的有機(jī)酸主要來(lái)源于五味子，五味子的生產(chǎn)工藝為水提醇沉后活性炭煮沸過(guò)濾。不同廠家的注射液中有機(jī)酸含量差異大， 可能與各生產(chǎn)廠家的原料來(lái)源、處理方式以及生產(chǎn)工藝的不同有關(guān)。

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Determination of Organic Acids in Sheng-mai Injection by

Ion Exclusion Chromatography

LIU Rui1，2， NIE Li-Xing .2， SUN Huan.3， LI Tao.3， WANG Gang-Li*2， LIN Rui-Chao1，2

.1（Beijing University of Chinese Medicine， School of Chinese Materia Medica， Beijing 100029， China）

.2（National Institute for Food and Drug Control， Beijing 100050， China）

.3（Metrohm China Limited， Central Laboratory， Beijing 100005， China）

Abstract A method was developed for the separation and determination of three organic acid， viz citric acid， malic acid and succinic acid in Sheng-mai Injection by ion exclusion chromatography with suppressed conductivity detection. The chromatographic separation was performed on a Transgenomic Sep-ION-300 column （300 mm length ×7.8 mm i.d.， 8

SymbolmA@ m） at 70 ℃ and eluted with a mixture of 5 mmol/L sulphuric acid and acetone （95∶5） at the flow rate of 0.4 mL/min. The effects of the concentration of sulphuric acid， the volume ratio of acetone and column temperature were investigated and optimized. The calibration curve for citric acid， malic acid and succinic acid was in a good linearity in the range of 7.45－476.5 mg/L， 14－521.0 mg/L and 3.47－222.0 mg/L， respectively. The average recovery for citric acid， malic acid and succinic acid was 97.12% with RSD 2.7%， 96.9% with RSD 2.3%， and 95.09% with RSD 1.9%， respectively. The validated method was successfully applied to determination of organic acids in 15 batches of Sheng-mai Injection.

Keywords Ion exclusion chromatography; Organic acids; Sheng-mai injection

（Received 19 July 2011; accepted 28 September 2011）