摘 要 采用石墨烯（RGO）作載體，凝血酶適體（TBA）作探針，凝血酶為目標(biāo)蛋白，電化學(xué)阻抗譜（EIS）為檢測技術(shù)，建立了檢測蛋白質(zhì)的新方法。由于RGO可增大電極有效表面積并提高電極表面電子傳輸速率以及TBA的特異性識別能力，此方法具有較高的靈敏度和良好的選擇性。采用本方法檢測凝血酶的線性范圍為0.3～10 fmol/L，檢出限為0.26 fmol/L。本研究將RGO應(yīng)用于電化學(xué)適體傳感器，證實了RGO修飾電極在電化學(xué)適體傳感器領(lǐng)域中潛在的應(yīng)用價值。

關(guān)鍵詞 石墨烯； 適體傳感器； 電化學(xué)阻抗譜； 凝血酶

2011-07-16收稿；2011-09-24接受

本文系國家自然科學(xué)基金（No.20875047）和江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目

* E-mail: yangxiaodi@njnu.edu.cn; yhxiao@njnu.edu.cn

1 引 言

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蛋白質(zhì)生物分子是組成和維持生命活動的重要物質(zhì)，因此這類物質(zhì)的分析檢測具有重大意義。生物傳感器是簡單、快速檢測生物分子的重要工具，如免疫檢測中的抗體在檢測蛋白質(zhì)的生物傳感器中廣泛應(yīng)用。隨著體外人工進(jìn)化程序的出現(xiàn)，提供了能分離識別各種各樣目標(biāo)分子的核酸適體。與抗體相比較，適體具有高特異性、高親和力、分子量小、與目標(biāo)分子結(jié)合空間位阻小、可重復(fù)利用和穩(wěn)定性良好等優(yōu)點。適體不僅可以與酶、生長因子等較大的蛋白質(zhì)分子結(jié)合，而且也可以與金屬離子、氨基酸等小分子物質(zhì)結(jié)合，甚至可以與完整的病毒顆粒、細(xì)菌和細(xì)胞等結(jié)合[1～5]，在治療與診斷方面成為與抗體競爭的對手。在適體眾多的目標(biāo)待測物中，蛋白質(zhì)的研究是一個熱點。

石墨烯（RGO）是單層碳原子緊密排列的二維納米材料，其特殊的二維結(jié)構(gòu)，使其除具有納米效應(yīng)外，還具有完美的量子隧道效應(yīng)、半整數(shù)的量子霍爾效應(yīng)和從不消失的電導(dǎo)率[6]等一系列優(yōu)異性質(zhì)；其內(nèi)部電子運(yùn)動速率可達(dá)光速的1/300[7]，修飾于電極表面可有效促進(jìn)電子轉(zhuǎn)移[8]，以上這些性質(zhì)使RGO成為電化學(xué)生物傳感器的理想材料。目前RGO可用于檢測NO2[9]、多巴胺[10]、葡萄糖[11]、蛋白質(zhì)[12，13]、細(xì)胞色素[14]。以光學(xué)為檢測信號的RGO適體傳感器已有報道[15，16]，但將RGO應(yīng)用于電化學(xué)適體傳感器的研究鮮有報道。

本研究將RGO通過一定的方法修飾于電極表面，以高特異性分子識別物質(zhì)凝血酶適體（TBA）作為探針，凝血酶為目標(biāo)蛋白，利用高靈敏性的電化學(xué)阻抗譜（EIS），建立了檢測蛋白質(zhì)的新方法。將氧化石墨烯（GO）固定在玻碳電極（GCE）表面，利用還原反應(yīng)獲得RGO修飾電極。進(jìn)一步通過π -π堆積作用，或利用碳二亞胺反應(yīng)[17]結(jié)合TBA。當(dāng)TBA與環(huán)境中凝血酶結(jié)合時會形成四聚體-凝血酶復(fù)合物，導(dǎo)致修飾電極表面交流阻抗值發(fā)生變化。本研究以氧化還原指示劑[Fe（CN）6/Fe（CN）6]3

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Symbolm@@ 在電極/電解液界面電子轉(zhuǎn)移電阻（Ret）發(fā)生變化作為檢測信號，將RGO應(yīng)用于電化學(xué)適體傳感器，為蛋白疾病的診斷和臨床治療提供具有應(yīng)用價值的分析方法與技術(shù)。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

CHI660B電化學(xué)工作站（上海Chenhua公司）； 2100型透射電子顯微鏡（日本電子公司）； 數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州Guahua公司）； 傅里葉變換紅外光譜儀（美國Varian公司）。

TBA為5′-NH2-GGT TGG TGT GGT TGG-3′，由上海柏業(yè)貿(mào)易有限公司合成；GO為實驗室自行合成；人體α-凝血酶（Sigma公司）；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）購自Sigma-Aldrich公司；牛血清白蛋白（BSA）和胰蛋白酶（TYP）購自上海瑞鼎化學(xué)技術(shù)有限公司；其它化學(xué)試劑均為分析純，實驗用水均為二次蒸餾水（18.25 MΩ#8226;cm）。

2.2 實驗方法

2.2.1 GO電極的制備 GCE依次用0.3 和0.05 μm的α-A12O₃拋光至呈鏡面，依次用水和無水乙醇清洗、超聲2 min，最后用水沖洗干凈，室溫下干燥。將2 μL殼聚糖（CS）和GO混合溶液（1∶4，V/V， 0.6 g/L GO）滴涂在GCE表面，室溫干燥6 h，得GO電極。

2.2.2 RGO電極的制備 GO修飾電極浸于85%的水合肼中，在恒溫60 ℃下加熱6 h，停止加熱后，繼續(xù)浸泡18 h，取出電極后依次用水、0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液（PBS）沖洗干凈，得RGO電極。

2.2.3 TBA在 RGO電極上的固定

將RGO電極于1.5 V電位下活化5 min，然后將其浸于0.5 mL 含有10 mmol/L NHS 和10 mmol/L EDC的0.10 mol/L PBS中16 h，電極室溫晾干后，用水多次沖洗，再將電極浸于1.0 mL含有1.0 μmol/L TBA、0.1 mol/L NaCl 和4 mmol/L EDTA的PBS中24 h。取出電極后用水沖洗，以除去電極表面未結(jié)合的TBA，得TBA修飾的RGO電極。

2.2.4 電化學(xué)檢測

將TBA修飾的RGO電極浸入含不同濃度凝血酶的1.0 mL 0.10 mol/L PBS中， 于室溫下作用20 min后，用PBS和水先后沖洗電極，以除去未發(fā)生反應(yīng)的凝血酶，然后置于含10 mmol/L [Fe（CN）6/Fe（CN）6]3

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Symbolm@@ 和0.1 mol／L KCl 的0.10 mol/L PBS電解液中進(jìn)行EIS檢測。

3 結(jié)果與討論

3.1 實驗原理

實驗原理圖參見圖1。在處理好的GCE表面自組裝一層GO膜，以CS為粘合劑，室溫晾干后，得GO電極。將它浸于水合肼中還原，獲得RGO電極。再將RGO電極功能化，使RGO的表面形成NHS酯鍵，通過NHS酯與NH2之間的酰胺反應(yīng)和RGO與TBA之間的π -π堆積作用結(jié)合NH2標(biāo)記的TBA，得到TBA修飾的RGO電極，最后用EIS中Ret的變化對凝血酶進(jìn)行定量檢測。

圖1 石墨烯適體傳感器的構(gòu)建和性能示意圖

Fig．1 Schematic diagram of construction and performance of graphene （RGO）-based aptasensor

3.2 電鏡表征

圖2為GO電極的透射電鏡（TEM）圖，電極表面有皺褶的片狀結(jié)構(gòu)，能明顯觀察到雙層甚至單層的GO，說明GO被修飾在GCE上。進(jìn)一步還原GO電極獲得RGO電極，對RGO電極進(jìn)行掃描電鏡（SEM）測試，并與文獻(xiàn)[18]中的電極SEM圖對照，結(jié)果基本一致。

3.3 EIS表征

不同修飾電極的電化學(xué)阻抗譜圖如圖3所示，半圓曲線的半徑越大，修飾電極的Ret越大。由圖3可見，裸電 Fig．2 TEM of graphene oxide （GO） electrode極的Ret為2826 Ω（圖3a）；修飾GO后Nyquist圖顯示為一條直線（圖3b），這是由于GO的膜電阻很大，電子的遷移過程受到極大的抑制。

而還原后得到的RGO修飾電極，Ret 為658 Ω（圖3c），可解釋為還原反應(yīng)可去除GO的含氧基團(tuán)[19]，如羧基和羥基，使RGO具有良好的導(dǎo)電性。將TBA修飾到RGO改性電極上后，Ret顯著增長到1308 Ω（圖3d），有機(jī)分子的存在使得電極Ret大幅增加，該現(xiàn)象說明通過這種方法將TBA有效固定到RGO改性電極上。

3.4 紅外光譜表征

為進(jìn)一步驗證TBA在RGO電極上的固定，用紅外光譜分別對TBA、RGO電極和TBA修飾的RGO電極進(jìn)行表征。由圖4可見，與RGO電極（圖4b）相比，TBA修飾的RGO電極（圖4c）上出現(xiàn)一些特征吸收峰：3360 cm

Symbolm@@ 1處為TBA中N-H和O-H鍵的伸縮振動峰，同時在1648和1587 cm

Symbolm@@ 1處的振動為CONH的特征振動。在1289 cm

Symbolm@@ 1處為CH2的剪式彎曲振動。在1199和1128 cm

Symbolm@@ 1處的兩個峰為-P=O 特征吸收峰，兩個峰強(qiáng)度的增加是由于磷酸鹽溶劑中含有PO。967 cm

Symbolm@@ 1處的強(qiáng)振動為COC的伸縮振動。這些吸收峰和TBA固有的吸收峰（圖4a）相類似，說明TBA已經(jīng)被有效固定在RGO修飾電極上。而且，TBA修飾的RGO電極的特征吸收峰較TBA的吸收峰位置向低頻方向移動，這是由于TBA與RGO之間的π -π堆積使體系的電子云密度平均化的結(jié)果。 圖3 不同電極的交流阻抗圖

Fig．3 Nyquist plot of Faradic impedance

（a） 裸電極， （b） 氧化石墨烯電極， （c） 石墨烯電極， （d） 適體修飾的石墨烯電極。（a） bare GCE， （b） GO， （c） redaced graphene ocide（RGO） and （d） throbin-binding aptamer （TBA） modified RGO electrodes）.

Fig．4 Attenuated tatal reflection （ATR）-FTIR spectra of （a） TBA，（b） RGO electrode and （c） TBA modified RGO electrode

3.5 凝血酶的定量檢測

將制備好TBA修飾的RGO電極對不同濃度的凝血酶進(jìn)行了檢測，結(jié)果如圖5A所示。隨著凝血酶濃度的增加，Ret值逐漸增大，這是因為隨著凝血酶濃度增大，

電極表面就會有越多的TBA與之結(jié)合，導(dǎo)致[Fe（CN）6/Fe（CN）6]3

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Symbolm@@ 電子傳遞的空間位阻增大，從而Ret增大，所對應(yīng)的Ret與凝血酶濃度的關(guān)系曲線如圖5B所示。電極Ret隨凝血酶濃度的增加而增大，當(dāng)凝血酶濃度增大到一定值時，Ret值達(dá)到平臺。插圖為線性范圍內(nèi)Ret和凝血酶濃度的關(guān)系曲線，圖5 適體傳感器在不同濃度凝血酶中的交流阻抗圖（A）及其線性關(guān)系圖（B）

Fig．5 （A） Nyquist plot of Faradic impedance for RGO-based aptasensor in the presence of （a） 0， （b） 0.5， （c） 1， （d） 5， （e） 10， （f） 50， （g） 100 and （h） 500 fmol/L. α-thrombin in 0.10 mol／L PBS containing 10 mmol/L [Fe（CN）6/Fe（CN）6]3

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Symbolm@@ and 0.1 mol／L KCl （pH 7.4）. （B） Relationship between electron-transfer resistance （Ret） and thrombin concentration. Inset: linear relationship between Ret and thrombin concentration其濃度線性范圍為0.3～10 fmol/L，回歸方程為Ret ＝3.875C＋296.1，線性相關(guān)系數(shù)R.2＝0.9932。檢出限為0.26 fmol/L。比文獻(xiàn)[16，17]所報道的基于石墨烯的熒光共振能量轉(zhuǎn)移適體傳感器或基于碳納米管的阻抗適體傳感器的檢出限低。

3.6 傳感器的選擇性 圖6 適體傳感器的特異性分析

Fig．6 Specificity analysis of aptasensor tested in （a） blank and in the presence of （b） 25 nmol/L BSA; （c） 25 nmol/L trypsase （TYP）; （d） 25 nmol/L BSA， 25 nmol/L TYP and 5 fmol/L thrombin and （e） 25 nmol/L BSA， 25 nmol/L TYP and 50 fmol/L thrombin

為證實所研究的電化學(xué)適體傳感器對凝血酶蛋白的特異性識別能力，選擇了可保護(hù)蛋白活性的BSA、與凝血酶同屬絲氨酸蛋白酶家族的TYP作為對照蛋白進(jìn)行測定，結(jié)果如圖6所示。當(dāng)傳感器與BSA，TYP作用后，

Ret基本保持不變；而與含凝血酶的混合溶液作用后，Ret顯著增大，并且Ret隨著所含凝血酶濃度的增加進(jìn)一步增大。表明Ret的增長僅取決于溶液中凝血酶濃度的大小而與干擾蛋白質(zhì)無關(guān)，證明此適體傳感器對凝血酶的檢測具有高度的選擇性。

綜上所述，基于先進(jìn)碳材料石墨烯的阻抗型適體傳感器具有無須標(biāo)記、靈敏度高、選擇性好、檢出限低等優(yōu)異性能。如果選用其它合適的適體，此傳感器有望拓展至其它生物分子的檢測。

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Aptasensor Based on Graphene Chemically Modified Electrode

WANG Yan-Ping， XIAO Ying-Hong.*， WU Min， LU Tian-Hong， YANG Xiao-Di.*

（Jiangsu Key Laboratory of new power batteries， College of Chemistry and Materials Science，

Nanjing Normal University， Nanjing 210097， China）

Abstract By using graphene（RGO）as supporter， molecular recognition substance TBA as probe， thrombin as objective protein， electrochemical impedance spectroscopy（EIS）as determination technique， a method for the determination of proteins was developed. Because RGO can improve effective surface area of electrodes and accelerate electron transfer rate at electrode/electrolyte interface as well as TBA has the molecular recognition ability with the high specificity， this determination method possesses the high sensitivity and good specificity. In the linear range from 0.3 to 10 fmol/L for thrombin determination， the detection limit is 0.26 fmol/L. In this study， RGO was applied to the electrochemical aptasensor for the first time， demonstrating that RGO-modified electrode has the great potential for the application in the electrochemical aptasensor.

Keywords Graphene; Aptasensor; Electrochemical impedance spectroscopy; Thrombin

（Received 16 July 2011; accepted 24 September 2011）