摘 要 建立了以活性碳纖維作吸附劑，流動注射在線預(yù)富集與高效液相色譜聯(lián)用法測定水產(chǎn)品中4種磺胺類藥物（磺胺噻唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺喹GFDA1啉）殘留含量的方法。樣品經(jīng)磷酸鹽緩沖溶液提取后，采用活性碳纖維作吸附劑流動注射在線預(yù)富集，在pH 3.0的甲酸溶液-甲酸甲醇溶液（60∶40， V/V）的流動相體系中， 用Eclipse XDB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5

SymbolmA@ m）分離，流速1.0 mL/min；檢測波長270 nm。結(jié)果表明， 4種磺胺類藥物在0.001～0.064 mg/L濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r為0.9997～0.9999；檢出限為0.48～1.15

SymbolmA@ g/L（S/N＝3）；富集倍數(shù)在137～406之間；加標(biāo)回收率為93.5%～104.0%。本方法操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高。

關(guān)鍵詞 流動注射；在線預(yù)富集；高效液相色譜；磺胺類藥物

2011-06-23收稿；2011-09-09接受

本文系國家青年科學(xué)基金（No. 20905057）資助

* E-mail：yanrq@tzc.edu.cn

1 引 言

磺胺類藥物是以對氨基苯磺酰胺為基本化學(xué)結(jié)構(gòu)的一類合成抗菌藥物。通過任何途徑攝入的磺胺類藥物都會在人體中蓄積，對人類的身體健康產(chǎn)生危害[1～3]。歐盟將磺胺類藥物列為必須嚴(yán)格監(jiān)控藥物，并制定動物源食品中磺胺類藥物的最大殘留限量為0.1 mg/kg。我國農(nóng)業(yè)部第235號文件也規(guī)定其總殘留限量為100

SymbolmA@ g/kg[4～6]。

目前，殘留磺胺類藥物的測定方法主要有液液萃取-液相色譜[7，8]\\，固相萃取-高效液相色譜法［9～11］等。液液萃取法耗時(shí)、費(fèi)力、低效、污染大，并且萃取液常會出現(xiàn)乳化現(xiàn)象；固相萃取作為一種新型的樣品處理技術(shù)，雖具有低污染、低成本、高效、高選擇性、不易乳化等優(yōu)點(diǎn)，但操作步驟繁瑣，富集效率受水樣過柱速度影響較大，樣品前處理時(shí)間較長。流動注射預(yù)富集作為一種集采樣、萃取和富集于一體的樣品前處理方法，不僅能夠克服液液萃取和固相萃取的缺點(diǎn)，而且操作簡單、快速，并能有效排除基體成分干擾，提高測定的準(zhǔn)確度和靈敏度，同時(shí)能改善精密度[12]。本研究采用流動注射在線預(yù)富集-高效液相色譜法，建立了同時(shí)測定磺胺噻唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶和磺胺喹GFDA1啉含量的有效方法。

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2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；流動注射分析處理儀（北京吉天儀器有限公司）；DELTA320 pH計(jì)（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；Milli-Q純水超純水系統(tǒng)（密理博中國有限公司）。

磺胺噻唑（ST）、磺胺二甲嘧啶（SM2）、磺胺間甲氧嘧啶（SMM）、磺胺喹GFDA1啉（SQ）均為標(biāo)準(zhǔn)品（美國Supelco公司）；甲醇（色譜純，TEDIA公司）；正己烷（分析純，中國上海試劑總廠）；KH2PO₄和K2HPO₄（分析純，上?；瘜W(xué)試劑有限公司）；H2PO₄、甲酸（分析純，無錫市展望化工試劑有限公司）；超純水由純水機(jī)制得。

2.2 實(shí)驗(yàn)條件

2.2.1 樣品制備和前處理方法 草魚：去鱗、去皮，沿背脊取肌肉部分；水潺：去頭，取可食肌肉部分；大竹蟶：去外殼，取可食部分；蝦：去頭、去殼，取可食部分。取后洗凈晾干水分，切成碎塊，經(jīng)電動勻漿機(jī)充分勻漿后制得樣品。準(zhǔn)確稱取約4 g樣品，加30 mL磷酸鹽緩沖液，渦旋振蕩3 min后，40 ℃超聲提取20 min，于50 mL離心管中以4000 r/min離心10 min；取上層清液，加10 mL正己烷脫脂；下層離心沉淀物抽濾，用少量磷酸鹽緩沖液洗滌；合并水層，用流動相定容至250 mL，實(shí)驗(yàn)前調(diào)至pH 3.0。

2.2.2 流動注射在線富集原理及條件 采用預(yù)先裝好活性碳纖維吸附劑的預(yù)富集圓形柱（實(shí)驗(yàn)室自制）代替液相色譜手動進(jìn)樣器的定量環(huán)進(jìn)行在線富集。六通閥在“Load”狀態(tài)下將樣品溶液或者標(biāo)準(zhǔn)溶液通過聚四氟乙烯泵管富集到預(yù)富集圓形柱中活性碳纖維上，流動注射泵參數(shù)為240 s， 60 r/min；將六通閥在“Load”狀態(tài)轉(zhuǎn)到“Inject”位置，吸附在活性碳纖維上的待分析樣品通過流動相進(jìn)行洗脫至色譜柱進(jìn)行分離分析。洗脫時(shí)間1.5 min，洗脫完成后，將六通閥轉(zhuǎn)到“Load”狀態(tài)，進(jìn)行下一個(gè)待測試液的富集。

2.2.3 色譜分離條件 Eclipse XDB-C18色譜柱 （250 mm×4.6 mm，5

SymbolmA@ m，美國安捷倫科技有限公司）；流動相：甲酸-甲酸甲醇溶液（60∶40，V/V， pH 3.0）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：270 nm。

2.3 溶液的配制準(zhǔn)確稱取磺胺噻唑、磺胺二甲嘧啶和磺胺間甲氧嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品各約40 mg，磺胺喹GFDA1啉標(biāo)準(zhǔn)品約160 mg（精確至0.1 mg），用水超聲溶解并定容至2000 mL，得磺胺混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，備用。

分別精確移取25， 50， 100， 200和400

SymbolmA@ L磺胺混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液至500 mL容量瓶中，用流動相定容，所得系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，避光冷藏保存。

磷酸鹽緩沖液：8.0 g KH2PO₄和2.0 g K2HPO₄，用水溶解并定容至1000 mL。

3 結(jié)果與討論

3.1 在線預(yù)富集參數(shù)的確定

用中間濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液考察預(yù)富集參數(shù)，先固定泵速60 r/min（流量約4.5 mL/min），嘗試了泵轉(zhuǎn)時(shí)間為60～600 s，進(jìn)行樣品裝載，以0.8～2.5 min的不同洗脫時(shí)間進(jìn)行洗脫。峰面積隨裝載時(shí)間和洗脫時(shí)間的變化見圖1。

由圖1可見。當(dāng)洗脫時(shí)間少于 1.5 min，裝載時(shí)間少于 240 s時(shí)，峰面積隨著裝載時(shí)間的延長而基本上呈線性增加，4種待測物能完全分開，且有良好的峰形；當(dāng)裝載時(shí)間大于 300 s時(shí)，峰面積雖有所增加，但是不呈線性增加。當(dāng)洗脫時(shí)間大于1.5 min時(shí)，隨著裝載時(shí)間的延長，信號有所增加，但是峰形出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，分離效果變差，且洗脫時(shí)間越長，拖尾越嚴(yán)重。綜合考慮，確定富集參數(shù)為：

圖1 峰面積與裝載時(shí)間（T）、洗脫時(shí)間（t）的關(guān)系

Fig．1 Relation of peak area vs. loading time and elution time

A． 磺胺噻唑； B. 磺胺二甲嘧啶； C. 磺胺間甲氧嘧啶； D. 磺胺喹GFDA1啉。A. Sulfathiazole; B. Sulfamethazine; C. Sulfa-

monomethoxine; Sulfaquinoxaline. 洗脫時(shí)間（Elution time）: 1， 0.8 min; 2， 1.2 min; 3， 1.5 min; 4， 2.0 min; 5， 2.5 min。泵速60 r/min，泵轉(zhuǎn)時(shí)間240 s，洗脫時(shí)間1.5 min。

3.2 流動相及流速的選擇

由于活性碳纖維易溶于乙腈，實(shí)驗(yàn)選擇了甲醇和水二元流動相。分別嘗試了甲醇-水、甲醇-乙酸、甲醇-甲酸等不同體系、不同pH值（2.0～6.0）及不同體積配比的流動相，并對流速從0.6～1.5 mL/min之間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，當(dāng)流動相為甲酸-甲酸甲醇溶液（60∶40，V/V，pH＝3.0），流速為1.0 mL/min時(shí)，不但能得到良好的峰形、適當(dāng)?shù)谋Ａ魰r(shí)間，同時(shí)能對各分析物質(zhì)得到較好的分離。這是由于磺胺類藥物結(jié)構(gòu)中帶有氨基，呈弱堿性，其中性分子與其離子形式在有機(jī)相和水相中分配性質(zhì)不同， 圖2 定性分析譜圖

Fig．2 Chromatogram of sulfonamides

ST. 磺胺噻唑（Sulfathiazole）； SM2. 磺胺二甲嘧啶（Sulfamethazine）； SMM. 磺胺間甲氧嘧啶（Sulfamonomethoxine）； SQ. 磺胺喹GFDA1啉（Sulfaquinoxaline）。因此在鍵合相是反相的色譜情況下，在流動相中加入一定比例的酸性溶液，使磺胺類藥物在流動相中呈離子形式存在，同時(shí)在流動相中加入酸有助于色譜柱內(nèi)硅膠硅醇基的質(zhì)子化，消除硅醇基與磺胺之間的相互作用，減少峰拖尾，改善磺胺的色譜峰形和分離效果。經(jīng)在線富集后定性分析見圖2。

3.3 樣品提取條件的選擇

由于磺胺類藥物難溶于水，較易溶于稀酸、稀堿和有機(jī)溶劑[13～15]。本實(shí)驗(yàn)分別對比了3種試劑對約4.0 g加標(biāo)蝦樣品中磺胺藥物的提取效果。3種提取溶劑分別為30 mL甲醇、30 mL磷酸鹽緩沖液、30 mL 0.1% H₃PO₄溶液。提取效果見表1。由表1可知，甲醇與磷酸鹽緩沖液的提取效果較好；0.1% H₃PO₄溶液的提取效果較差。但由于甲醇毒性較大，故選擇了磷酸鹽緩沖液作為提取液。

表1 不同提取液的提出效果對照表

Table 1 Extraction effect of different extractants（%）

提取劑Extratants基線Baseline回收率 Recovery （%）STSM2SMMSQ

甲醇 Methanol平衡 Balance90.894.1105.4100.2

磷酸鹽緩沖液Phosphate buffer solution平衡 Balance100.1101.599.8100.8

0.1% H₃PO₄漂移Drift55.860.400

3.4 線性范圍、檢出限、定量限、精密度及富集倍數(shù)

對5個(gè)梯度濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在線富集后分析測定，根據(jù)質(zhì)量濃度-峰面積作圖，得其線性關(guān)系和相關(guān)系數(shù)。按照儀器基線噪聲的3倍（S/N＝3）求得所測4種磺胺類藥物的檢出限LOD和水產(chǎn)品樣品中4種磺胺類藥物的定量限LOQ（S/N＝10）。另外配制了峰面積在經(jīng)富集后的工作線性范圍內(nèi)的5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)濃度溶液，采用直接進(jìn)樣方式，根據(jù)質(zhì)量濃度-峰面積作圖，得4條工作曲線，利用斜率之比求得富集倍數(shù)。結(jié)果見表2。

4 結(jié) 論

采用活性炭纖維流動注射在線預(yù)富集-高效液相色譜同時(shí)測定水產(chǎn)品中4種磺胺類藥物，實(shí)現(xiàn)了集采樣、富集于一體的新的樣品前處理方法。有效排除了基體成分干擾，簡化了樣品前處理過程。結(jié)果表明：待測組分能有效分離，4種磺胺類藥物線性關(guān)系良好，回收率高，精密度好，且不受樣品中其它組分的干擾，取得了較好的實(shí)驗(yàn)效果，適用于在日常生活中檢測其它水產(chǎn)品中磺胺類藥物的含量。

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Determination of Four Kinds of Sulfonamides in Aquatic Products by

Flow Injection On-line Preconcentration and High

Performance Liquid Chromatography

LIU Gui-Hua， HAN De-Man， LIANG Hua-Ding， TANG Shou-Wan， PAN Fu-You， YAN Rui-Qiang.*

（School of Pharmaceutical and Chemical Engineering， Taizhou University， Linhai 317000， China）

Abstract Using activated carbon fibre as the absorbent， a flow injection on-line preconcentration-high performance liquld chromatographic method for the determination of four kinds of sulfonamides （sulfathiazole， sulfamethazine， sulfamonomethoxine and sulfaquinoxaline） in aquatic products was established. The samples were extracted by phosphate buffer solution， then preconcentrated on activated carbon fibre by flow injection. The separation was carried out with an Eclipse XDB-C18 column （250 mm×4.6 mm， 5

SymbolmA@ m） in the mobile phase system of formic acid solution-formic acid methanol solution （60∶40， V/V） at pH＝3.0， the flow rate was 1.0 mL/min . The detection was performed at 270 nm wavelength. The experiment result showed that the good linear relationship was obtained in the sulfonamides concentrations from 0.001－0.064 mg/L with the correlation coefficient from 0.9997 to 0.9999. The detection limit was 0.48－1.15

SymbolmA@ g/L（S/N＝3）. The enrichment factors for the four sulfonamides were from 137 to 406. The recoveries were 93.5%－104.0%. This method was easy to operate with precise result and good repetition and can be successfully applied to the determination of sulfathiazole， sulfamethazine， sulfamonomethoxine and sulfaquinoxaline.

Keywords Flow injection; On-line preconcentration; High performance liquid chromatography; Sulfonamides

（Received 23 June 2011; accepted 9 September 2011）