摘 要 在A型流感病毒等許多包膜病毒的病毒顆粒中，除包含病毒基因組編碼的結(jié)構(gòu)蛋白外，還包含來源于宿主細(xì)胞的多種蛋白。然而，在雞胚內(nèi)增殖的病毒顆粒所包含的宿主蛋白的種類尚不清楚。本研究采用20%～60%（w/w）蔗糖密度梯度離心法分離純化了繁殖于雞胚的流感病毒，并用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE）結(jié)合質(zhì)譜法對(duì)純化的流感病毒顆粒進(jìn)行了全面的蛋白質(zhì)組學(xué)分析。結(jié)果表明，在病毒顆粒中，除包含9種病毒編碼蛋白外，還發(fā)現(xiàn)了12種來源于雞胚的蛋白，如膜聯(lián)蛋白A2、肽酰脯氨酰順反異構(gòu)酶B、過氧化物酶1、磷酸甘油酸激酶、丙酮酸激酶肌組織異構(gòu)酶等，以及2種細(xì)胞骨架蛋白（微管蛋白b-3和肌動(dòng)蛋白）。

關(guān)鍵詞 雞胚； 流感病毒； 凝膠電泳； 質(zhì)譜分析

2011-06-08收稿；2011-10-25接受

本文系國家自然科學(xué)基金（No.21175055）、吉林省科技廳（Nos.20090952，20110739，20110731） 和吉林大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)（Nos. 450060445316，450060326056）資助。

* E-mail: zhouqw@jlu.edu.cn， liu_ning@jlu.edu.cn

1 引 言：

包膜病毒是一類在核衣殼外包有脂質(zhì)雙層膜的病毒，包膜來自受感染宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜或核膜。目前認(rèn)為，成熟的包膜病毒顆粒中除包含其基因組編碼的結(jié)構(gòu)蛋白外，還包含多種宿主蛋白[1]。在病毒顆粒中已發(fā)現(xiàn)了系列宿主蛋白[2～5]，其中一些蛋白對(duì)病毒的復(fù)制和包裝有重要作用[6～8]。流感病毒是一種包膜病毒，其成熟病毒顆粒含有9種病毒基因組編碼的結(jié)構(gòu)蛋白。通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法可對(duì)在Vero細(xì)胞中增殖的流感病毒進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)成熟的病毒顆粒結(jié)合有36種宿主蛋白[9]。目前，此類研究均選擇來源于哺乳動(dòng)物的細(xì)胞株作為流感病毒增殖的宿主。

在細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展起來之前，研究者多采用雞胚作為流感病毒增殖宿主。由于成本低、產(chǎn)量高，雞胚已成為生產(chǎn)流感病毒疫苗的主要宿主。但是，雞胚與細(xì)胞株在很多方面存在差異。在雞胚內(nèi)增殖的流感病毒顆粒結(jié)合宿主蛋白的情況尚不清楚，因此有必要對(duì)在雞胚內(nèi)增殖的流感病毒顆粒所包裹的來源于宿主雞胚的蛋白進(jìn)行全面的分析。據(jù)此，本研究采用SDS-PAGE與質(zhì)譜分析結(jié)合的方法，分析了純化的在雞胚內(nèi)增殖的流感病毒顆粒的蛋白組成譜，發(fā)現(xiàn)除了9種病毒編碼蛋白外，還有12種雞胚宿主編碼的蛋白結(jié)合于病毒顆粒內(nèi)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Optima L-100K超速離心機(jī)（美國Beckman Coulter公司）；ZipTip C18 Pipette Tips微量層析柱（美國Millipore公司）；PicoTip電噴霧針（美國New Objective公司）；納升電噴霧源（丹麥Protana公司）；QSTAR四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Applied Biosystems公司）；Mini-Cell垂直電泳儀（美國Bio-Rad公司）；GS800掃描儀（美國Bio-Rad公司）。

乙腈和甲醇（HPLC級(jí)，F(xiàn)isher公司）；測序級(jí)胰蛋白酶（Promega公司）；抗烯醇化酶1和抗溶菌酶C的單克隆抗體（Santa Cruz公司）；BCA蛋白檢測試劑盒（Pierce Chemicals公司）；A型禽流感病毒H5N1（Avian influenza virus A/Chicken/Hong Kong/YU22/2002），在III級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室（BL-3）中進(jìn)行培養(yǎng)。

2.2 病毒培養(yǎng)和離心純化

將A型禽流感病毒H5N1接種于雞胚中，在35 ℃條件下孵育72 h，收集尿囊液；用0.03%福爾馬林在4 ℃滅活72 h；將含有病毒的尿囊液以5000 r/min離心15 min，收集上清液。所有對(duì)活病毒進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)操作均在三級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室完成。

將上述含有滅活病毒的上清液在4 ℃以40000 r/min離心1 h，棄去上清液，沉淀懸浮于含有10 mmol/L Tris-HCl （pH 8.0）、150 mmol/L NaCl和25 mmol/L β-巰基乙醇的緩沖液中。取適量病毒懸液，加入到20%～60% （w/w）蔗糖梯度溶液液面上，于4 ℃以23000 r/min離心16 h，收集含有病毒的區(qū)帶，再以40000 r/min離心沉淀病毒顆粒1 h，用上述緩沖液重懸沉淀。以上操作至少重復(fù)3次，以保證病毒顆粒的純度。收集含有病毒的區(qū)帶，混懸于上述緩沖液中，凍存于

Symbolm@@ 80 ℃待用。

2.3 SDS-凝膠電泳（PAGE）分析

采用BCA蛋白檢測試劑盒對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測定。取含10

SymbolmA@ g蛋白的病毒樣品溶液，加入等體積的還原性上樣緩沖液（2% SDS， 20% 甘油， 20 mmol/L Tris-HCl， pH 6.8， 160 mmol/L Dithiothreitol， 微量溴酚蘭），煮沸5 min后，用小型垂直電泳系統(tǒng)進(jìn)行蛋白分離。電泳結(jié)束后，膠片進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)G250染色，然后用掃描儀進(jìn)行掃描。

2.4 質(zhì)譜分析鑒定蛋白

將凝膠的電泳條帶切成30個(gè)連續(xù)的2 mm寬的條帶，脫色后，在37 ℃，用新配制的含測序級(jí)胰蛋白酶的溶液進(jìn)行膠內(nèi)水解16 h。用C18微量層析柱對(duì)消化后的肽進(jìn)行脫鹽和濃縮，然后加于電噴霧針。采用配置納升電噴霧源的四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀對(duì)樣品進(jìn)行分析。在一級(jí)質(zhì)譜圖中，根據(jù)各種分子離子峰的同位素分布特征，確定其帶電荷狀態(tài)；對(duì)感興趣的分子離子用二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行分析，以得到其多肽序列信息。一級(jí)質(zhì)譜的詳細(xì)參數(shù)設(shè)置如下：噴霧電壓（IS）950 V，第一去簇電壓（DP1）50 V，第二去簇電壓（DP2）10 V，聚焦電壓（FP）100 V，掃描區(qū)間350～1500 Da，氣幕30。二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜除了掃描區(qū)間為50～1000 Da外，參數(shù)設(shè)置均同上，碰撞能量（CE）根據(jù)具體情況在25～40之間調(diào)節(jié)。

二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜分析結(jié)束后，所得數(shù)據(jù)用Analyst QS 1.1軟件（MDS Sciex）轉(zhuǎn)換為MGF格式文件，并使用MASCOT搜索引擎在Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行蛋白檢索。檢索參數(shù)設(shè)置如下：1 個(gè)漏切位點(diǎn)，母離子允許誤差 0.2 Da，子離子允許誤差 0.1 Da，固定修飾為半胱氨酸烷基化，可變修飾為甲硫氨酸氧化。

2.5 蛋白印記分析

取含20

SymbolmA@ g蛋白的病毒樣品溶液，進(jìn)行12% 聚丙烯酰胺凝膠電泳。將電泳分離的蛋白條帶電轉(zhuǎn)移到Polyvinylidene fluoride （PVDF）膜上，分別用抗烯醇化酶1和抗溶菌酶C的單克隆抗體雜交后， 加入相應(yīng)的聯(lián)接有HRP的二抗，以ECL增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色。

3 結(jié)果與討論

3.1 純化流感病毒顆粒中病毒編碼蛋白的鑒定

Fig．1 SDS PAGE of influenza virus

本研究中，以20%～60% （w/w）蔗糖密度梯度超速離心流感病毒，至少重復(fù)3次得到了高純度病毒顆粒，確保后續(xù)的質(zhì)譜分析中蛋白成分定性結(jié)果的可靠性。

將純化的病毒顆粒懸浮于等體積的含1% SDS的上樣緩沖液，煮沸5 min，用SDS-PAGE進(jìn)行分離，再用考馬斯亮藍(lán)G250染色（圖1）。凝膠塊中的蛋白經(jīng)蛋白酶消化后，進(jìn)行質(zhì)譜分析鑒定。在鑒定得到的蛋白中，有9種蛋白是由流感病毒基因編碼的（表1）。圖2為帶雙電荷的分子離子峰（m/z 469.2）的串聯(lián)質(zhì)譜圖，經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索，該譜峰被鑒定為來源于流感病毒基質(zhì)蛋白M1的一段氨基酸序列M*VLASTTAK （179-187），其中第179位的甲硫氨酸被氧化。從圖2可以看到連續(xù)的y系列碎片離子（y1～y7），以及部分a和b離子（a2，b2，b3等）。

表1 流感病毒編碼蛋白的鑒定

Table 1 Identification of influenza virus-encoded proteins

蛋白名稱

Protein identity登錄號(hào)

Accession numberMascot分值

Mascot score匹配肽段數(shù)/序列覆蓋率

Number of matched peptides/

Sequence coverage （%）等電點(diǎn)/理論分子量pI/Theoretical Mw （kDa）

PB1Q6DNX2877/119.26/86.41

PB2Q6DNL810910/169.44/85.83

PAQ6DNX6838/135.39/82.43

HAQ6DQ182218/256.15/63.21

NPQ6DPE545413/699.47/56.33

NAQ6DPJ8792/96.07/48.95

M1Q6DPT437812/849.24/27.93

M2Q6DPT5581/124.88/11.24

NEPQ6DP63671/75.20/14.38

Fig．2 MS/MS spectrum of a peak with m/z 469.2， which is identified as a tryptic peptide （M*VLASTTAK）from M1 protein of influenza virus

A型流感病毒基因組包含11個(gè)基因，編碼11種蛋白，包括HA， NA， NP， M1， M2， NS1， NEP， PA， PB1， PB1-F2和PB2。本研究確定了除NS1和PB1-F2外的9種蛋白在成熟流感病毒顆粒中的表達(dá)。值得注意的是，一些病毒蛋白在多個(gè)凝膠小塊中被鑒定出來，尤其是NP和M1。對(duì)于離子通道蛋白M2和核輸出蛋白NEP，僅鑒定出單一的肽段，可能是由于其在病毒顆粒中的含量明顯低于其它結(jié)構(gòu)蛋白，如HA和NA[10]。

3.2 純化流感病毒顆粒包裝宿主蛋白的鑒定

除了9種病毒編碼蛋白外，在純化的流感病毒顆粒中還鑒定出了12種來源于宿主雞胚的蛋白（表2）。圖3a為帶雙電荷的分子離子峰（m/z 877.4）的串聯(lián)質(zhì)譜圖，

圖3 （a） m/z 877.4的分子離子峰的串聯(lián)質(zhì)譜圖；（b） m/z 398.3的分子離子峰的串聯(lián)質(zhì)譜圖

Fig．3 （a） MS/MS spectrum of m/z 877.4 peak； （b） MS/MS spectrum of with m/z 398.3 peak

經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索，該譜峰被鑒定為雞胚宿主中溶菌酶的胰酶水解片段NTDGSTDYGILQINSR （64-79），共含有16個(gè)氨基酸殘基。從圖3a可見，多數(shù)y系列碎片離子（y1～y13）都能得到歸屬。圖3b為另一個(gè)帶雙電荷的分子離子峰（m/z 398.3）的串聯(lián)質(zhì)譜圖，經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索，該譜峰被鑒定為雞胚宿主中肌動(dòng)蛋白的胰酶水解片段IIAPPER （330-336）。該片段含有7個(gè)氨基酸殘基，全系列的y碎片離子（y1～y7）都很容易得到歸屬。

3.3 蛋白印跡分析

為了對(duì)質(zhì)譜鑒定的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，分別用抗烯醇化酶1和抗溶菌酶C的單克隆抗體對(duì)相應(yīng)的質(zhì)譜鑒定結(jié)果進(jìn)行蛋白印記分析。結(jié)果表明，本研究純化的流感病毒顆粒中確實(shí)含有烯醇化酶1（圖4a）和溶菌酶C（圖4b），進(jìn)一步證實(shí)了質(zhì)譜分析結(jié)果。

3.4 小結(jié)

本研究利用超速密度梯度離心的方法，純化了繁殖于雞胚的流感病毒顆粒；并采用質(zhì)譜法，分析了流感病毒顆粒的蛋白表達(dá)譜，除了9種病毒編碼蛋白外，還鑒定了12種雞胚宿主編碼的蛋白。本研究

表2 純化病毒顆粒中宿主蛋白的鑒定

Table 2 Identification of host proteins packaged in purified virus particles登錄號(hào)

Accession

number蛋白名稱Protein identityMascot分值Mascot score匹配肽段數(shù)/序列覆蓋率Number of matchedpeptides/Sequencecoverage （%）等電點(diǎn)/

理論分子量pI/Theoretical

Mw （kDa）

P17785膜聯(lián)蛋白A2 Annexin A2934/126.92/38.64

P51913烯醇化酶1 Enolase 11337/306.17/47.31

P53478肌動(dòng)蛋白， 細(xì)胞質(zhì)5型 Actin， cytoplasmic type 51025/235.30/41.84P00698溶菌酶C Lysozyme C2218/389.36/16.24

P24367肽酰-脯氨酰-順反式異構(gòu)酶B

Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase B926/339.40/22.41P24479S100鈣結(jié)合蛋白A11 S100 calcium-binding protein A11764/376.08/11.41P51903磷酸甘油酸激酶 Phosphoglycerate kinase1397/238.31/44.72P0CG62多聚泛素-B Polyubiquitin-B832/426.94/34.37P0CB50過氧化物氧化還原酶-1 Peroxiredoxin-11314/428.24/22.31

P003553-磷酸甘油醛脫氫酶

Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase1155/248.51/35.84

P00548

丙酮酸激酶肌同工酶 Pyruvate kinase muscle isoenzyme1295/117.29/58.01P09206微管蛋白 b-3 Tubulin b-3

1235/154.78/49.86

結(jié)果為更好地理解流感病毒與雞胚宿主之間的相互作用提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也有助于人們在分析水平上更清晰地認(rèn)識(shí)雞胚來源的流感病毒疫苗的潛在的過敏反應(yīng)。

Fig．4 （a） Western blot analysis of enolase 1 （a） and lysozyme C （b）

lane 1： 病毒樣品（Virus sample）； lane 2: 空白樣品（Blank sample） 。

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Identification of Host Proteins Packaged in H5N1 Avian

Influenza Virus Particles by Mass Spectrometry

WANG Zhi-Wu1，2， SUN Wan-Chun.1， ZHOU Yue.3， CONG Zhong-Yi.3， ZHOU Qing-Wei*3， LIU Ning*4

.1（Key Laboratory of Zoonosis， Ministry of Education， Jilin University， Changchun 130062， China）

. 2（School of Public Health， Jilin University， Changchun 130021， China）

.3（Institute of Frontier Medical Sciences， Jilin University， Changchun 130021， China）

.4（Central Laboratory， Second Hospital of Jilin University， Changchun 130041， China）

Abstract In this study， sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis （SDS PAGE） coupled with mass spectrometry were used to perform a comprehensive proteomics analysis of the purified influenza virus particles propagated from embryonated chicken eggs， which were purified by 20%－60% sucrose （w/w） density gradient centrifugation. In addition to the virus-encoded proteins， 12 proteins originated from embryonated chicken eggs were identified in the purified virus particles， such as Annexin A2， Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase B， Peroxiredoxin-1， Phosphoglycerate kinase， and Pyruvate kinase muscle isoenzyme. Two kinds of cytoskeletal proteins， tubulin b-3 and actin， were also detected.

Keywords Embryonated chicken eggs; Influenza virus; Gel electrophoresis; Mass spectrometry

（Received 8 June 2011; accepted 25 October 2011）