摘 要 將DMF（N，N-二甲基甲酰胺）分散的多壁碳納米管（MWNT）修飾在金電極表面，再將修飾電極依次沉積納米金和L-半胱氨酸（L-Cys），并通過(guò)半胱氨酸中的巰基吸附Fe₃O₄@Au納米復(fù)合材料，再固載甲胎蛋白抗體（anti-AFP），以牛血清白蛋白（BSA）封閉非特異性吸附位點(diǎn)，構(gòu)建了高靈敏、穩(wěn)定的新型電流型甲胎蛋白免疫傳感器。實(shí)驗(yàn)通過(guò)掃描透射電子顯微鏡（TEM）對(duì)DMF-MWNT和Fe₃O₄@Au復(fù)合納米粒子進(jìn)行了表征。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，此免疫傳感器對(duì)甲胎蛋白抗原的檢測(cè)范圍為0.1～150

SymbolmA@ g/L，檢出限為0.03

SymbolmA@ g/L。

關(guān)鍵詞 Fe₃O₄@Au納米復(fù)合粒子；碳納米管；L-半胱氨酸；甲胎蛋白；免疫傳感器

2011-07-05收稿; 2011-10-16接受

本文系國(guó)家自然科學(xué)基金（No. 20675064）和重慶市自然科學(xué)基金（No. CSTC-2005 BB 4100）資助項(xiàng)目

* E-mail: judy20060830@163. com

1 引 言

甲胎蛋白（AFP）是甲種胎兒蛋白的簡(jiǎn)稱。血清中AFP的升高對(duì)原發(fā)性肝癌診斷具有重要意義[1，2]。目前已有的檢測(cè)方法有熒光分析法[3，4]、化學(xué)發(fā)光分析法[5]、酶聯(lián)免疫法[6]、色譜分析法、酶標(biāo)電泳法及放射免疫法等[7]。這些方法靈敏、可靠，但大多需要對(duì)抗原或抗體進(jìn)行酶標(biāo)記或放射標(biāo)記，操作步驟繁瑣，且需要昂貴的儀器及專業(yè)的技術(shù)人員[8]。而利用氧化還原探針間接檢測(cè)免疫反應(yīng)的非標(biāo)記電流型免疫傳感器[9]因具有檢出限低、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)微型化、綠色化等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注。因此探究新型免疫傳感器對(duì)AFP檢測(cè)具有重要意義。

多壁碳納米管（MWNT）是制備傳感器的優(yōu)良材料。因?yàn)閷?duì)電極表面進(jìn)行修飾時(shí)，除了可將材料本身的物化特性引入電極界面外，同時(shí)也會(huì)由于納米材料的小粒徑、大比表面積效應(yīng)，使得粒子表面帶有較多的功能基團(tuán)，而對(duì)某些物質(zhì)的電化學(xué)行為產(chǎn)生特有的催化效應(yīng)。MWNT良好的生物相容性，可加快電子傳遞、增加電流響應(yīng)、提高檢測(cè)靈敏度和線性范圍。與石墨材料制備的傳感器相比，具有更高的靈敏度，因此，MWNT已被廣泛應(yīng)用于免疫傳感器的研究中[10～12]。

磁性納米粒子作為一種新型功能材料在近年來(lái)得到了快速發(fā)展［13］。其中，核殼型Fe₃O₄@Au納米復(fù)合粒子以其獨(dú)特的電學(xué)性質(zhì)和催化特性，以及良好的穩(wěn)定性和生物相容性，適合用于表面修飾和功能化研究[14，15]。本研究結(jié)合以上無(wú)機(jī)納米材料的優(yōu)點(diǎn)，利用靜電吸附和共價(jià)鍵和作用，將DMF分散的MWNT修飾在金電極表面，再將修飾電極依次沉積納米金、L-Cys，并通過(guò)半胱氨酸中的巰基吸附Au@ Fe₃O₄納米復(fù)合材料，最后固載甲胎蛋白抗體（anti-AFP）。此傳感器有望實(shí)現(xiàn)納米金和Fe₃O₄顆粒與抗原抗體及電極之間的直接電化學(xué)作用，從而提高免疫傳感器的靈敏度[16]。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

CHI660D電化學(xué)工作站（上海辰華儀器公司）； MP230酸度計(jì)（瑞士Mettler-Toledo公司）；AB204-S電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；透射電子顯微鏡（TEM，H600， 日本Hitachi Instrument 公司）；BRANSONIC 200 超聲清洗儀（德國(guó)Branson Ultrashall公司）; 所有玻璃儀器用K2Cr2O7-H2SO₄浸泡，超聲清洗儀超聲，晾干。

甲胎蛋白抗體（anti-AFP）及抗原（AFP）、FeCl₃#8226;6H2O，F(xiàn)eCl2#8226;4H2O（鄭州博賽生物技術(shù)股份有限公司）; L-Cys（0.02 mol/L，以 pH 5.0醋酸緩沖溶液配制）、BSA（質(zhì)量分?jǐn)?shù)96%～99%）及氯金酸（HAuCl₄）均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司; 檸檬酸鈉（上?；瘜W(xué)試劑公司）; MWNT （純度＞95%，中國(guó)科學(xué)院成都有機(jī)化學(xué)研究所）， 其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水。

2.2 DMF-MWNT納米復(fù)合物的制備

由于MWNT的管間具有很強(qiáng)的范德華力，極易團(tuán)聚，使用時(shí)必須將其置于一定的溶劑中超聲分散。同時(shí)，為結(jié)合碳納米管和其它納米粒子，需對(duì)碳納米管表面進(jìn)行共價(jià)或者非共價(jià)修飾，或高分子膜修飾[17，18]。在80 ℃下，將 MWNT用濃HNO₃-濃H2SO₄（3∶1， V/V）混合液處理5 h，水洗后真空干燥[19，20] ，備用。取0.15 mg處理后的MWNT分散于1 mL 5 %（V/V）DMF溶液中（pH 7.4），在25 ℃下超聲30 min，使其充分分散即得DMF-MWNT復(fù)合物，放置在4 ℃冰箱里備用。

2.3 Fe₃O₄@Au復(fù)合納米粒子的制備

按文獻(xiàn)[21]配制磁性納米Fe₃O₄粒子。稱量4.64 g FeCl₃#8226;6H2O 和1.22 g FeCl2#8226;4H2O，加入250 mL水，配制成Fe2＋-Fe3＋（1:2， n/n）的混合溶液，并加入2 mL 0.2 mol/L H2SO₄（防止Fe2＋在溶液中被氧化為Fe3＋）。用氨水（質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%）將溶液調(diào)至pH 9.0～9.5，并在室溫下攪拌30 min。將制得Fe2＋/Fe3＋混合物加熱到80 ℃，維持30 min。此時(shí)得到黑色懸濁液，放置在超聲儀中超聲10 min，使其分散均勻后，利用磁鐵將磁性Fe₃O₄納米粒子與流體分離開(kāi)，并用熱水將上層清液洗至中性，即得氨基化的磁性納米Fe₃O₄。

取1 mL氨基化的磁性納米Fe₃O₄懸濁液滴加到不斷攪拌、溫度為99 ℃的檸檬酸鈉溶液（100 mL水溶解0.229 g）中。然后加入2.5 mL 1% （w/w）HAuCl₄與之反應(yīng)15 min后停止加熱。繼續(xù)攪拌15 min，此時(shí)為酒紅色的懸濁液。

圖1 免疫傳感器的制備過(guò)程

Fig．1 Schematic illustration of the stepwise immunosensor fabrication process: （a） formation of N，N-dimethylformamide multi-walled nanotubes （DMF-MWNTs）; （b） electrodeposition-Au（DpAu）; （c） electrodeposition-cysteine（DpCys）; （d） adsorption of Fe₃O₄@Au nanocomposites; （e） anti-a-fetoprotein （AFP） loading; （f） blocking with BSA

當(dāng)懸濁液冷卻到室溫后，用磁鐵分離出固體顆粒，并用水洗滌，該固體顆粒即為Fe₃O₄@Au復(fù)合納米粒子；用20 mL水將其分散，并保存在4 ℃冰箱內(nèi)備用[22]。

2.4 免疫傳感器的制備

將金電極（Φ＝4 mm）依次用0.3和0.05

SymbolmA@ m 的Al2O₃糊拋光成鏡面，用水沖洗除去拋光粉，然后依次在水、無(wú)水乙醇和水中超聲清洗5 min，室溫晾干備用。

SymbolmA@ L DMF-MWNT復(fù)合物，滴涂在預(yù)處理好的金電極表面，等自然晾干成膜后將其置于3 mL HAuCl₄溶液（直徑16 nm）中，以

Symbolm@@ 0.2 V電壓沉積30 s，取出，用水洗凈，置于5 mL 0.02 mol/L L-半胱氨酸溶液中，在電壓為

Symbolm@@ 0.5～1.0 V條件下，以10 mV/s掃速循環(huán)掃描30 min，取出再次用水沖洗修飾電極。將15

SymbolmA@ L Fe₃O₄@Au復(fù)合納米粒子滴涂在修飾電極上，自然晾干，將修飾好的電極浸泡在anti-AFP-水（1∶1， V/V）的的混合物中，在4 ℃下放置16 h。用0.25%（w/w）BSA溶液封閉電極表面非特異性吸附位點(diǎn)。修飾好的電極置于4 ℃的冰箱中保存待用。圖1為免疫傳感器制備過(guò)程示意圖。

2.5 檢測(cè)方法

采用循環(huán)伏安法（CV）表征了電極不同修飾階段的電化學(xué)特性，實(shí)現(xiàn)對(duì)AFP的定量測(cè)定。測(cè)量電極電流采用三電極體系：參比電極為飽和甘汞電極（SCE），鉑絲電極為對(duì)電極，工作電極為被修飾的金電極。測(cè)試底液為5.0×10

Symbolm@@ 3 mol/L Fe（CN）63

Symbolm@@ /4

Symbolm@@ ＋0.1 mol/L KCl＋PBS （pH 7.4）溶液，循環(huán)伏安測(cè)定的電位范圍為

Symbolm@@ 0.2～0.6 V，電位掃描速度為50 mV/s，無(wú)特別說(shuō)明實(shí)驗(yàn)溫度均為（25±5） ℃。

3 結(jié)果與討論

3.1 不同納米材料的透射電鏡（TEM）分析

圖2為免疫傳感器制備過(guò)程中選用納米材料的TEM表征圖。圖2 a、b為DMF分散的 MWNT復(fù)合物的TEM圖。從圖2可見(jiàn)，MWNT被均勻地分散，呈長(zhǎng)形帶狀; MWNT的管徑為10～20 nm。圖2c和2d分別為Fe₃O₄ 納米粒子和Fe₃O₄@Au復(fù)合納米粒子的TEM圖。圖2d中趨于球型的黑色物質(zhì)為金殼包裹住的Fe₃O₄納米粒子，粒徑較圖2 c中的粒徑偏大。由TEM圖可得，實(shí)驗(yàn)成功制備了DMF-MWNT復(fù)合物及Fe₃O₄@Au復(fù)合納米粒子。

圖2 不同納米材料的透射電子顯微鏡圖

Fig．2 TEM images of different nanomaterials

a and b. DMF-MWNTs; c. Fe₃O₄; d. Fe₃O₄@Au．

3.2 免疫傳感器的電化學(xué)特性 圖3 電極在修飾過(guò)程中的循環(huán)伏安圖

Fig．3 Cyclic voltammograms of different electrodes in 5 mL，5.0×10

Symbolm@@ 3 mol/L K₃Fe（CN）6＋K₄Fe（CN）6＋0.1 mol/L KCl＋0.1 mol/L PBS（pH＝7.4）: （a） Bare Au electrode; （b）DMF-MWNT/Au; （c）DpAu/DMF-MWNT/Au;（d）DpL-Cys/DpAu/DMF-MWNT/Au;（e）Fe₃O₄@Au/DpL-Cys/DpAu/DMF-MWNT/Au;（f）anti-AFP/Fe₃O₄@Au/DpL-Cys/DpAu/DMF-MWNT/Au;（g）BSA/anti-AFP/Fe₃O₄@Au/DpL-Cys/DpAu/DMF-MWNT/Au;（h）AFP/BSA/anti-AFP/Fe₃O₄@Au/DpL-Cys/DpAu/DMF-MWNT/Au .The scan rate was 50 mV/s.

采用循環(huán)伏安法（CV）研究了電極在組裝過(guò)程的電化學(xué)特性。圖3曲線a為金裸電極在5.0×10

Symbolm@@ 3 mol/L Fe（CN）63

Symbolm@@ /4

Symbolm@@ ＋0.1 mol/L KCl＋PBS （pH 7.4）

溶液中的氧化還原電流響應(yīng)曲線。圖中可見(jiàn)一對(duì)對(duì)稱可逆的氧化還原峰。這是因?yàn)榈滓褐醒趸€原探針鐵氰化鉀的存在。曲線b為電極修飾了DMF-MWNT復(fù)合物的循環(huán)伏安曲線。由于MWNT具有快的電子傳輸能力，且比表面積增大[23]，所以氧化還原電流值增大。利用恒電位沉積HAuCl₄法，制得功能化的DpAu-MWNT修飾電極。此時(shí)循環(huán)伏安曲線的氧化還原峰電流增大（圖3c），說(shuō)明形成的DpAu-MWNT納米復(fù)合膜大大提高了修飾電極的電化學(xué)活性，有利于電極與溶液之間電子的傳遞。當(dāng)沉積了L-Cys后，由于L-Cys組裝膜在一定程度上阻礙電子的傳輸[24]，所以圖3d中氧化還原峰電流隨之減小。利用L-Cys的巰基與金易形成巰金鍵的特性，將Fe₃O₄@Au復(fù)合納米粒子共價(jià)鍵和到電極表面。由圖3e可見(jiàn)，氧化還原峰電流再次增大，表明Fe₃O₄@Au復(fù)合納米粒子成功地被組裝到了電極表面，它增強(qiáng)了傳感器的電流響應(yīng)。當(dāng)anti-AFP通過(guò)靜電作用和疏水作用被固載到Fe₃O₄@Au復(fù)合納米粒子膜的表面，氧化還原峰電流值明顯降低（圖3f）。圖3g是用BSA封閉電極表面的非特異性吸附位點(diǎn)，峰電流值逐步降低，說(shuō)明蛋白質(zhì)分子阻礙電子的傳遞。最后，當(dāng)修飾電極與 20 mg/L AFP抗原孵育15 min 后，氧化還原峰電流值再次降低（圖3h），表明生成的免疫復(fù)合物阻礙電子傳輸。

圖4為免疫傳感器在pH＝7.4的K₃Fe（CN）6溶液中不同掃速的循環(huán)伏安表征圖。由內(nèi)到外掃描速率分別為：20，50，80，100，120，150，200，250，300和350 mV/s，隨著掃描速率的增加，還原峰電位負(fù)移，氧化峰電位正移，圖4中插圖表示多層膜修飾電極的氧化還原峰電流與掃描速率平方根呈線性關(guān)系，說(shuō)明在此范圍內(nèi)，電極的氧化還原反應(yīng)受擴(kuò)散過(guò)程控制。

圖4 免疫傳感器在不同掃描速度下的循環(huán)伏安圖.（插圖為響應(yīng)電流與掃速平方根的關(guān)系）

Fig．4 Cyclic voltammograms of immunosensor at different scan rates: 20， 50， 80， 100， 120， 150， 180， 200， 250， 300， 350 mV/s （from innter to outer）.Inset: The dependence of peak currents vs. v1/2

3.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

3.3.1 緩沖溶液pH的優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)研究了PBS緩沖溶液的pH值在4.0～8.0范圍內(nèi)免疫傳感器的響應(yīng)情況。由實(shí)驗(yàn)可得，pH值從4.0增至7.4，免疫傳感器的氧化還原電流值隨之逐漸增大。當(dāng)pH＝7.4時(shí)，氧化還原電流值達(dá)到最大值。pH值繼續(xù)增大，氧化還原電流值逐漸減小。因此，選擇pH＝7.4的K₃Fe（CN）6緩沖溶液為測(cè)試底液。

3.3.2 孵育時(shí)間和孵育溫度的優(yōu)化 抗原與抗體發(fā)生免疫反應(yīng)與時(shí)間有關(guān)。將制備的免疫傳感器在20

SymbolmA@ g/L AFP溶液中分別孵育2，5，8，10，12，15，20和25 min，循環(huán)伏安圖中分別對(duì)應(yīng)的峰電流值隨著孵育時(shí)間的增加開(kāi)始時(shí)降低，15 min時(shí)響應(yīng)電流降到最低，15 min后基本保持不變， 如圖5。因此，本實(shí)驗(yàn)的孵育時(shí)間選擇為15 min。

溫度對(duì)免疫蛋白分子的活性有一定的影響。溫度過(guò)低，蛋白質(zhì)分子的活性降低，使抗原與抗體結(jié)合的速度慢，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)；溫度較高時(shí)，蛋白質(zhì)分子活性高，抗原抗體結(jié)合的速度快，反應(yīng)時(shí)間短。但是，過(guò)高的溫度將導(dǎo)致抗原和抗體失活或蛋白質(zhì)流失。因此，適宜的孵育溫度能夠使抗原抗體充分有效的結(jié)合。本實(shí)驗(yàn)研究了免疫傳感器在不同溫度（10～45 ℃）下對(duì)同一濃度的AFP的響應(yīng)電流。從圖6可見(jiàn)，免疫電極的響應(yīng)電流值隨測(cè)試溫度的升高而逐漸減小，說(shuō)明抗原和抗體結(jié)合的速度隨著溫度的增加而提高。在37 ℃時(shí)， 免疫反應(yīng)最充分，電流響應(yīng)最大。當(dāng)溫度繼續(xù)上升，響應(yīng)電流略有增大，表明過(guò)高的孵育溫度使少數(shù)免疫分子變形或失活，導(dǎo)致免疫傳感器表面修飾的抗原抗體部分脫落。鑒于長(zhǎng)時(shí)間高溫也會(huì)影響免疫傳感器的活性、靈敏性和壽命，免疫傳感器的孵育溫度選擇25 ℃為宜。

圖5 孵育時(shí)間對(duì)免疫傳感器的影響

Fig．5 Effect of incubating time on immunoreaction

圖6 孵育溫度對(duì)免疫傳感器的影響

Fig．6 Effect of incubating temperature on immunoreaction

3.4 免疫傳感器的性能

3.4.1 免疫傳感器對(duì)AFP抗原的響應(yīng)性能 在上述選定的實(shí)驗(yàn)條件下，免疫傳感器與不同濃度的AFP標(biāo)準(zhǔn)溶液孵育后，得到圖7中傳感器的氧化峰電流與AFP濃度的關(guān)系。結(jié)果表明，在0.1～150.0

SymbolmA@ g/L的濃度范圍內(nèi)， 氧化峰電流與AFP濃度的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系。其線性回歸方程分別為I＝

Symbolm@@ 15.34lgc＋199.3， 相關(guān)系數(shù)r＝0.9969，檢出限（3倍信噪比）為0.03

SymbolmA@ g/L。

圖7 峰電流與AFP 抗原濃度的關(guān)系

Fig．7 Linear relationship between anodic peak current response and AFP concentration

3.4.2 免疫傳感器的選擇性 免疫傳感器的特異性是免疫分析方法重要的指標(biāo)之一。免疫傳感器對(duì)其抗原類似物的交叉反應(yīng)過(guò)大，必然會(huì)影響分析的準(zhǔn)確性。將免疫傳感器分別置于含有20

SymbolmA@ g/L AFP抗原的標(biāo)準(zhǔn)溶液孵育15 min后進(jìn)行CV檢測(cè)，記錄響應(yīng)電流值；再將其置于含有20

SymbolmA@ g/L AFP抗原以及模擬人體環(huán)境可能存在的干擾物質(zhì)的溶液中重復(fù)上述步驟。加入的干擾物質(zhì)有：癌胚抗原、乙肝表面抗原、乙肝核心抗原以及牛血清白蛋白、抗壞血酸。實(shí)驗(yàn)表明，檢測(cè)到的響應(yīng)電流無(wú)顯著變化。兩次的電流響應(yīng)值相比僅有2.8%的差異，表明該免疫傳感器有良好的選擇性。

3.5 免疫傳感器的初步應(yīng)用

為了進(jìn)一步研究該免疫傳感器的實(shí)用價(jià)值，對(duì)該免疫傳感器進(jìn)行了回收率測(cè)定。以0.1 mol/L PBS （pH 7.4） 為稀釋液，配制不同濃度的AFP血清樣品溶液。將制備好的免疫電極置于樣品溶液中培育15 min后，按實(shí)驗(yàn)方法測(cè)量響應(yīng)電流，部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表 1。結(jié)果表明本方法的回收率在93.0%～108.0%，此免疫測(cè)定方法有望應(yīng)用于人體血清中AFP的檢測(cè)。

表1 回收率測(cè)定

Table 1 Recovery of prepared immunosensor

SampleStandard value

（mg/L）Found

（mg/L）Recovery

（%）SampleStandard value

（mg/L）Found

（mg/L）Recovery

（%）

155.4108.035049.198.22109.393.04100103.4103.4

4 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)表明，DMF-MWNT復(fù)合物能夠有效增大電極比表面積。Fe₃O₄@Au復(fù)合納米粒子良好的生物相容性，較強(qiáng)的選擇性、較高的穩(wěn)定性、達(dá)到吸附平衡時(shí)間短及能夠固載更多的抗體等優(yōu)點(diǎn)，提高了免疫傳感器的靈敏性。同時(shí)，結(jié)合磁性納米材料的順磁性特點(diǎn)，還能進(jìn)行回收再生。因此，此免疫傳感器具有選擇性高、靈敏度高、回收率高、重復(fù)性好以及環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，具有很好的應(yīng)用前景。

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An Immunosensor for α-Fotoprotein Antigen Based on Multi-wakked

Nanotubes/L-Cysteine and Au@ Fe₃O₄ Nanocomposite

ZHU Yu-Ping1，2， YUAN Ruo.2， CHAI Ya-Qing.2， QIN Song.1， YUAN Ya-Li.2

.1（Department of Chemistry and Chemical Engineering， Neijiang Teachers College， Neijiang 641112， China）

.2（College of Chemistry and Chemical Engineering， Southwest University， Chongqing 400715， China）

Abstract N，N-Dimethylfomamide（DMF） dispersed MWNTS was firstly modified on the electrode surface， which was in further eletrodeposited a nano-Au layer for immobilization of L-cysteine. Subsequently， Fe₃O₄@Au nanocomposites were absorbed on the modified electrode surface by the SH-Au bond for increasing the specific surface area and further immobilizing anti-AFP. Finally， bovine serum albumin （BSA） was used to block the non-specific adsorption sites of the immunosensor to obtain a highly sensitive and stable immunosensor. Experiments by transmission electron micros-copy （TEM） were carried out to characterize the prepared MWCNTs and Fe₃O₄@Au composite nanoparticles. Under optimal conditions， the sensor has a good response to AFP， in the detection range form 0.1 to 150

SymbolmA@ g/L， and detection limit of 0.03 ng/mL.

Keywords Ferriferrous oxide@Au nanocomposites; Carbon nanotubes; L-Cysteine; α-Fotoprotein; Immunosensor

（Received 5 July 2011; accepted 16 October 2011）