摘 要 G-四鏈體DNA酶是由核酸G-四鏈體與氯化血紅素（Hemin）結(jié)合后形成的一種具有過(guò)氧化物酶活性的人工酶，利用這種DNA酶，可進(jìn)行多種化學(xué)及生物傳感器的設(shè)計(jì)。為提高G-四鏈體DNA酶類Hg2＋傳感器的選擇性，本研究在傳感器的設(shè)計(jì)過(guò)程中引入了分子內(nèi)裂分G-四鏈體，即將形成G-四鏈體的富G序列拆分成兩部分，分別放置在Hg2＋探測(cè)序列的兩端。在無(wú)Hg2＋存在時(shí)，部分富G序列被包埋在某一分子內(nèi)二倍體結(jié)構(gòu)中，無(wú)法形成G-四鏈體。而在Hg2＋存在下，Hg2＋對(duì)T-T堿基錯(cuò)配的穩(wěn)定能力可以促使Hg2＋探測(cè)序列形成分子內(nèi)二倍體結(jié)構(gòu)，并伴隨著原有分子間二倍體結(jié)構(gòu)的破壞及分子內(nèi)裂分G-四鏈體的生成。利用生成的裂分G-四鏈體與Hemin作用后檢測(cè)體系酶活性的提高，實(shí)現(xiàn)Hg2＋傳感器的設(shè)計(jì)。利用該傳感器，可在50～500 nmol/L及2.0～7.5

SymbolmA@ mol/L兩個(gè)濃度范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)Hg2＋的定量檢測(cè)，檢出限為47 nmol/L。由于裂分G-四鏈體DNA酶的使用強(qiáng)化了傳感器對(duì)Hg2＋的依賴性，極大地提高了設(shè)計(jì)的Hg2＋傳感器的選擇性。對(duì)實(shí)際水樣的加標(biāo)回收結(jié)果顯示，回收率為97.5%～104.5%，證明此傳感器可以滿足實(shí)際水樣中痕量Hg2＋的分析要求。

關(guān)鍵詞 脫氧核糖核酸酶; 裂分G-四鏈體; 傳感器; 汞

2011-07-27收稿；2011-10-27接受

本文系國(guó)家自然科學(xué)基金（No. 20975055）和973項(xiàng)目（No. 2011CB707700）資助

* E-mail:kongdem@nankai.edu.cn

1 引 言

G-四鏈體是由富含鳥(niǎo)嘌呤堿基G的DNA或RNA序列形成的一種特殊的核酸二級(jí)結(jié)構(gòu)[1]。G-四鏈體DNA酶則是由G-四鏈體與氯化血紅素（Hemin）結(jié)合后形成的具有過(guò)氧化物酶活性的DNA酶[2，3]。與一些天然的過(guò)氧化物酶相比，G-四鏈體DNA酶具有價(jià)廉，易于制備、儲(chǔ)存，易于修飾及水解穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性好等優(yōu)勢(shì)。近年來(lái)，利用這類DNA酶，已設(shè)計(jì)了多種化學(xué)及生物傳感器，包括核酸傳感器、金屬離子傳感器及適配體傳感器等[4～19]。

汞是一種常見(jiàn)的環(huán)境污染物。汞的污染極大地威脅著人類的健康，它可以引起腦部、腎臟損傷及多種認(rèn)知和行動(dòng)的紊亂。借助于G-四鏈體DNA酶，本課題組設(shè)計(jì)了一種Hg2＋傳感器[20]。本方法利用Hg2＋存在下富G的DNA鏈從分子間二倍體結(jié)構(gòu)向G-四鏈體結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化，以及隨之所引起的檢測(cè)體系酶活性的提高。雖然該傳感器設(shè)計(jì)方案可以很容易地延伸用于多種金屬離子及適配體底物的測(cè)定，但僅就Hg2＋檢測(cè)而言，所面臨的問(wèn)題是少數(shù)幾種金屬離子（如Ni2＋， Co2＋， Cd2＋和Pb2＋）的存在會(huì)干擾Hg2＋的檢測(cè)，尤其是Pb2＋的干擾，即使是在加入掩蔽劑PDCA（吡啶-2，6-二羧酸）時(shí)也無(wú)法消除。究其原因，Pb2＋對(duì)G-四鏈體的超強(qiáng)穩(wěn)定能力導(dǎo)致其對(duì)檢測(cè)體系中二倍體和G-四鏈體兩種構(gòu)型的平衡產(chǎn)生了嚴(yán)重的影響。Pb2＋的離子半徑略小于K＋，同K＋一樣，Pb2＋也可以進(jìn)入到G-四鏈體的兩個(gè)G-四分體平面中間，并對(duì)G-四鏈體結(jié)構(gòu)起到穩(wěn)定作用。相比于K＋穩(wěn)定下的G-四鏈體，Pb2＋穩(wěn)定下的G-四鏈體結(jié)構(gòu)更加緊湊、穩(wěn)定性更高。即Pb2＋對(duì)G-四鏈體的穩(wěn)定能力更強(qiáng)[21]。若上述Hg2＋檢測(cè)體系中存在Pb2＋，由于Pb2＋推動(dòng)二倍體G-四鏈體平衡向G-四鏈體方向移動(dòng)，將會(huì)導(dǎo)致體系酶活性提高，進(jìn)而產(chǎn)生正干擾。為了消除Pb2＋等的干擾，本研究對(duì)前述Hg2＋傳感器的設(shè)計(jì)進(jìn)行了改進(jìn)，即將形成G-四鏈體的富G序列拆分成了兩段，而將Hg2＋探測(cè)序列插入這兩段富G序列中間。只有當(dāng)Hg2＋探測(cè)序列在Hg2＋的存在下進(jìn)行適當(dāng)折疊后，兩段富G序列才能相互接近，進(jìn)而折疊成分子內(nèi)的裂分G-四鏈體DNA酶。這樣的探針設(shè)計(jì)可以增加G-四鏈體結(jié)構(gòu)的形成對(duì)Hg2＋的依賴性，進(jìn)而減弱甚至消除Pb2＋的干擾。2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

UV-1901紫外分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），配有微量池架；40

SymbolmA@ L的微量石英比色池（England，Starna Brand）；Jasco J-820分光偏振器。

實(shí)驗(yàn)中所用到的寡核苷酸鏈均從上海生工生物技術(shù)有限公司定制合成。其濃度以單鏈濃度的形式表示，通過(guò)測(cè)量260 nm處的吸光度值除以相應(yīng)的摩爾吸光系數(shù)計(jì)算得到[22]。每條寡核苷酸鏈的摩爾吸光系數(shù)由以下網(wǎng)站上提供的軟件計(jì)算得出（http://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer）。配制的儲(chǔ)備液于

Symbolm@@ 20 ℃下分裝保存。TritonX-100，氯化血紅素（Hemin），三羥甲基氨基甲烷 （Tris），HAc，KAc，ABTS（2，2′-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽），H2O2，二甲亞砜（DMSO），Hg（Ac）2，Ca（Ac）2，Mg（NO3）2，Cu（NO3）2，Mn（Ac）2，Zn（Ac）2，Cr（NO3）3，Pb（NO3）2，Ni（NO3）2，Co（Ac）2，Cd（NO3）2均為分析純，購(gòu)自Sigma公司。

Hemin溶液：稱取0.01304 g Hemin，溶于4 mL DMSO中，使用前根據(jù)需要稀釋。

2.2 Hg2＋的檢測(cè)

在10 mmol/L Tris-HAc（pH＝7.0），50 mmol/L KAc，0.002% （V/V） TritonX-100緩沖溶液中，加入終濃度分別為0.5 和2.0

SymbolmA@ mol/L 的鏈A和鏈B。為保證鏈A能夠充分地與鏈B結(jié)合形成分子間二倍體結(jié)構(gòu)，將上述混合溶液在90 ℃條件下加熱5 min，緩慢降至室溫， 并在室溫下放置20 min；向其中加入不同濃度的Hg2＋，室溫下放置40 min；再加入終濃度為1

SymbolmA@ mol/L的Hemin，室溫下放置1 h；加入ABTS（終濃度為3.2 mmol/L）和H2O2（終濃度為2.0 mmol/L）至總體積100

SymbolmA@ L。5 min后，用UV-1901紫外分光光度計(jì)掃描反應(yīng)產(chǎn)物ABTS#8226;＋的吸收光譜，利用418 nm處的吸光度值進(jìn)行定量分析。

2.3 圓二色（CD）光譜檢測(cè)

按2.2節(jié)的方法配制DNA混合物，在高溫下加熱并降至室溫后，向其中加入4

SymbolmA@ mol/L Hg2＋，室溫下隔夜放置。用1 cm比色皿在235～320 nm范圍內(nèi)測(cè)定圓二色光譜，平均掃描3次，掃描速度為100 nm/min，響應(yīng)時(shí)間為1 s，帶寬為0.1 nm。

2.4 實(shí)際樣品中Hg2＋回收率的檢測(cè)

按2.2節(jié)的方法配制DNA混合物，將該混合物在高溫下加熱并降至室溫后，向其中加入50

SymbolmA@ L實(shí)際水樣（占總體積的1/2）和一定濃度的Hg2＋，室溫下放置40 min；再加入終濃度為1

SymbolmA@ mol/L的Hemin，室溫下放置反應(yīng)1 h；最后加入ABTS（終濃度為3.2 mmol/L）和H2O2（終濃度為2.0 mmol/L）至總體積

Fig．1 Schematic representation of Hg2＋ detection method using split G-quadruplex DNAzyme為100

SymbolmA@ L。5 min后，用UV-1901紫外分光光度計(jì)掃描反應(yīng)產(chǎn)物ABTS#8226;＋的吸收光譜，利用418 nm處的吸光度值并借助于建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算回收率。

3 結(jié)果與討論

3.1 Hg2＋傳感器的工作原理

設(shè)計(jì)的Hg2＋傳感器使用了兩條寡核苷酸鏈（圖1，鏈A和鏈B）。其中鏈A由3部分組成，I和III兩部分分別位于鏈A的5′-端和3′-端，為可形成G-四鏈體的富G序列（圖1帶下劃線的序列）。對(duì)于I和III兩部分而言，由于分別含有3個(gè)和1個(gè)GGG重復(fù)序列，各自都不具備G-四鏈體的形成條件。但若兩部分能夠相互接近，則可締合形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)。鏈A的II部分為富含胸腺嘧啶堿基T的序列，它位于上述兩段富G序列中間。鏈B與鏈A 中I和II兩部分連接處的一段序列互補(bǔ)。在特定的條件下，鏈A與鏈B結(jié)合形成分子間二倍體結(jié)構(gòu)。由于鏈A中I的部分序列被包埋在了該分子間二倍體結(jié)構(gòu)當(dāng)中，

使I和III兩部分無(wú)法相互接近形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)。而在Hg2＋存在下，鏈A中富T的II部分可自身彎折形成一個(gè)分子內(nèi)的二倍體結(jié)構(gòu)。該二倍體結(jié)構(gòu)中的T-T錯(cuò)配由于可以與Hg2＋作用形成T-Hg2＋-T堿基對(duì)而能夠穩(wěn)定存在[23，24]。由于該分子內(nèi)二倍體結(jié)構(gòu)的形成部分地占據(jù)了鏈B在鏈A上的結(jié)合位點(diǎn)，從而降低了鏈B與鏈A結(jié)合的穩(wěn)定性，使鏈B從鏈A上解締下來(lái)，釋放出富G序列。同時(shí)，上述分子內(nèi)二倍體結(jié)構(gòu)的形成又可以使位于其兩端的富G序列相互接近，兩者締合形成穩(wěn)定的G-四鏈體結(jié)構(gòu)。由于該G-四鏈體是由同一DNA鏈上的兩段富G序列締合而成，因此將其稱之為分子內(nèi)裂分G-四鏈體。該裂分G-四鏈體可以與Hemin結(jié)合，形成具有過(guò)氧化物酶活性的G-四鏈體DNA酶，催化H2O2氧化ABTS的反應(yīng)，生成的陽(yáng)離子自由基ABTS#8226;＋在波長(zhǎng)418 nm處有最大吸收，利用檢測(cè)體系在該波長(zhǎng)處吸光度值的變化可以實(shí)現(xiàn)Hg2＋的檢測(cè)。

圖2 鏈A（1）、鏈A＋鏈B（2）及鏈A＋鏈B＋7.5

SymbolmA@ mol/L Hg2＋（3）存在下檢測(cè)體系的吸光信號(hào)

Fig．2 Absorption signals of sensing systems containing Strand A （1）， Strand A＋Strand B （2）， Strand A＋Strand B＋7.5

SymbolmA@ mol/L Hg2＋ （3）

為驗(yàn)證上述Hg2＋傳感器的可行性，對(duì)3個(gè)不同的檢測(cè)體系所表現(xiàn)出的過(guò)氧化物酶活性進(jìn)行了比較研究，結(jié)果如圖2所示。當(dāng)只有鏈A存在時(shí)，檢測(cè)體系在λ＝418 nm處顯示了較強(qiáng)的吸收信號(hào)，說(shuō)明這時(shí)檢測(cè)體系具有較強(qiáng)的過(guò)氧化物酶活性。這是因?yàn)樵跊](méi)有鏈B存在時(shí)，鏈A中單鏈的II部分的柔韌性也可以導(dǎo)致兩端的富G序列相互接近形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，并在Hemin的存在下顯示較強(qiáng)的酶活性。而當(dāng)有鏈B存在時(shí)，檢測(cè)體系的酶活性顯著下降，證明鏈B的存在確實(shí)可以抑制G-四鏈體結(jié)構(gòu)的形成。當(dāng)向此檢測(cè)體系中加入Hg2＋后，檢測(cè)體系的酶活性又明顯增強(qiáng)，與預(yù)期的結(jié)果相符。證明Hg2＋的存在破壞了鏈A與鏈B的結(jié)合作用，促進(jìn)了分子內(nèi)裂分G-四鏈體結(jié)構(gòu)的形成。

圖3 鏈A（1）、鏈A＋鏈B（2）及鏈A＋鏈B＋4.0

SymbolmA@ mol/L Hg2＋（3）存在下的CD光譜曲線

Fig．3 CD spectra of Strand A （1）， Strand A＋Strand B （2）， Strand A＋Strand B＋4.0

SymbolmA@ mol/L Hg2＋ （3）

3.2 CD光譜檢測(cè)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述Hg2＋檢測(cè)機(jī)理的合理性，對(duì)不同檢測(cè)體系的CD光譜信號(hào)進(jìn)行了考察。CD光譜是進(jìn)行G-四鏈體結(jié)構(gòu)研究的重要手段。以往的研究結(jié)果顯示，平行構(gòu)型的G-四鏈體

的CD光譜在265 nm附近有一個(gè)正峰，在245 nm附近有一個(gè)負(fù)峰；反平行構(gòu)型的G-四鏈體在295 nm附近有一個(gè)正峰，在265 nm附近有一個(gè)負(fù)峰[25]；對(duì)于典型的雙螺旋DNA，其CD光譜在245 nm附近有一個(gè)負(fù)峰，正峰的位置則會(huì)隨具體DNA序列的不同而不同，一般出現(xiàn)在260～280 nm之間[26]。從圖3可見(jiàn)，當(dāng)只有鏈A存在時(shí)，檢測(cè)體系的CD光譜在265 nm處有一個(gè)正峰，在245 nm處有一個(gè)負(fù)峰，這是平行G-四鏈體的典型特征，證明鏈A自身可以折疊成平行的G-四鏈體。而當(dāng)鏈B存在時(shí)，檢測(cè)體系的CD光譜在280 nm附近出現(xiàn)了一個(gè)肩峰，證明了鏈A/鏈B分子間二倍體的形成。當(dāng)向檢測(cè)體系中加入Hg2＋時(shí)，280 nm處的肩峰消失，此時(shí)的CD光譜曲線的形狀與鏈A單獨(dú)存在時(shí)的情況相似，說(shuō)明鏈A/鏈B的分子間二倍體結(jié)構(gòu)被破壞，G-四鏈體結(jié)構(gòu)重新形成。

3.3 鏈B的優(yōu)化選擇

根據(jù)前面所描述的Hg2＋檢測(cè)原理，鏈B的長(zhǎng)度要進(jìn)行仔細(xì)的選擇。鏈B既不能太短，也不能太長(zhǎng)。太短會(huì)導(dǎo)致鏈B與鏈A之間不能形成穩(wěn)定的分子間二倍體，從而無(wú)法有效抑制鏈A自身折疊成G-四鏈體。鏈B太長(zhǎng)，則會(huì)導(dǎo)致鏈B與鏈A之間形成的分子間二倍體太過(guò)穩(wěn)定，即使加入Hg2＋也無(wú)法破壞兩條鏈的締合作用。本研究設(shè)計(jì)了5條不同長(zhǎng)度的鏈B（B1～B5），并通過(guò)對(duì)比有無(wú)Hg2＋存在下檢測(cè)體系吸光信號(hào)的變化，對(duì)這5條鏈進(jìn)行選擇（圖4）。對(duì)于無(wú)Hg2＋存在的情況下，當(dāng)鏈B的堿基 圖4 鏈B的優(yōu)化選擇。

白色：無(wú)Hg2＋；黑色：加入

7.5

SymbolmA@ mol/L Hg2＋

Fig．4 Selection of strand B， white bars: without Hg2＋; black bars: 7.5

SymbolmA@ mol/L Hg2＋;

B1： 5′-AAACAATCCC; B2: 5′-AAACAATCCCG; B3: 5′-AAACAATCCCGC; B4: 5′-AAACAATCCCGCC; B5: 5′-AAACAATCCCGCCC.數(shù)目由10個(gè)（B1）增加到12個(gè)（B3）時(shí)，檢測(cè)體系的吸光度值逐漸下降。隨著鏈B長(zhǎng)度的繼續(xù)增加，檢測(cè)體系的吸光度值變化不大。此結(jié)果表明，12個(gè)堿基長(zhǎng)度的鏈B3足以與鏈A形成穩(wěn)定的分子間二倍體結(jié)構(gòu)，有效抑制G-四鏈體結(jié)構(gòu)的形成。而對(duì)于Hg2＋存在下的情況而言，檢測(cè)體系的吸光度值也隨著鏈B長(zhǎng)度的增加而下降。這是因?yàn)殒淏越長(zhǎng)，鏈A/鏈B分子間二倍體的解締也越困難，Hg2＋參與下形成的G-四鏈體越少。為此，選擇兩種條件下吸光度差值（ΔA）最大的鏈B3作為優(yōu)選鏈。同時(shí)，為確保在沒(méi)有Hg2＋存在時(shí)鏈A能夠充分轉(zhuǎn)化為鏈A/鏈B分子間二倍體，鏈B的濃度設(shè)為鏈A的4倍。

3.4 Hg2＋傳感器的靈敏度和選擇性

為了驗(yàn)證設(shè)計(jì)的傳感器用于Hg2＋定量檢測(cè)的可行性，考察了不同Hg2＋濃度下檢測(cè)體系在λ＝418 nm處的吸光度值變化。如圖5所示，在低Hg2＋濃度范圍內(nèi)，檢測(cè)體系的吸光度隨Hg2＋濃度的增加而增大。在1.0～2.0

SymbolmA@ mol/L濃度范圍內(nèi)，吸光度隨Hg2＋濃度的變化減緩。之后，隨著Hg2＋濃度的繼續(xù)增加，檢測(cè)體系的吸光度值迅速增大，并在Hg2＋濃度為7.5

SymbolmA@ mol/L 時(shí)達(dá)到最大。即在50～500 nmol/L及2.0～7.5

SymbolmA@ mol/L兩個(gè)濃度范圍內(nèi)，檢測(cè)體系的吸光度值與Hg2＋濃度呈線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)R分別為0.9909和0.9931。出現(xiàn)兩個(gè)線性濃度范圍的原因可能是由于鏈A與Hg2＋之間的協(xié)同作用[27]。利用上述兩個(gè)線性范圍，可以分別對(duì)低濃度和較高濃度范圍內(nèi)的Hg2＋進(jìn)行定量檢測(cè)。按3倍信噪比（S/N）計(jì)算得出檢出限為47 nmol/L，與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相當(dāng)（表1）[4～8，20]。

考察了幾種常見(jiàn)金屬離子對(duì)Hg2＋檢測(cè)的干擾。從圖6可見(jiàn)，當(dāng)以7.5

SymbolmA@ mol/L的上述金屬離子代替

圖6 Hg2＋傳感器的選擇性，白色柱狀條代表不加Hg2＋時(shí)體系的吸光度值，黑色柱狀條代表7.5

SymbolmA@ mol/L Hg2＋存在時(shí)體系的吸收值，其中各種干擾離子濃度均為7.5

SymbolmA@ mol/L

Fig．6 Selectivity of the Hg2＋-sensing system. White bars represent the absorption signals of the sensing systems in the presence of 7.5

SymbolmA@ mol/L other metal ions. Black bars represent the absorption signals of the sensing systems in the presence of 7.5

SymbolmA@ mol/L Hg2＋ and 7.5

SymbolmA@ mol/L other metal ions

圖5 檢測(cè)體系在λ＝418 nm處的吸光度值隨Hg2＋濃度的變化，插圖為在50～500 nmol/L的濃度范圍內(nèi)，吸光度值隨Hg2＋濃度的變化

Fig．5 Hg2＋ concentration-dependent change in absorption signal at λ＝418 nm. The insert shows the absorption signal change in Hg2＋ concentration range of 50～500 nmol/L

Hg2＋加入到檢測(cè)體系中時(shí)，檢測(cè)體系均沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的信號(hào)變化。而當(dāng)將這些金屬離子與Hg2＋同時(shí)加入到檢測(cè)體系中時(shí)，檢測(cè)體系均獲得了明顯的信號(hào)增長(zhǎng)，且信號(hào)變化的程度與單獨(dú)加入Hg2＋的情況相當(dāng)。上述結(jié)果表明，此Hg2＋傳感器具有良好的選擇性，多種常見(jiàn)金屬離子的存在均不會(huì)對(duì)Hg2＋的檢測(cè)產(chǎn)生干擾。

值得注意的是，即使是對(duì)G-四鏈體具有超強(qiáng)穩(wěn)定能力的Pb2＋也未對(duì)該Hg2＋傳感器產(chǎn)生干擾。推測(cè)原因：當(dāng)使用裂分G-四鏈體DNA酶時(shí)，形成G-四鏈體的富G序列被分割成了兩段。在鏈A/鏈B分子間二倍體中，兩段富G序列處于相互遠(yuǎn)離的狀態(tài)，各自都不具備形成G-四鏈體的條件。即使是Pb2＋對(duì)G-四鏈體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定能力再?gòu)?qiáng)，對(duì)這種情況也是無(wú)能為力的。 因?yàn)镻b2＋并不能使兩部分富G序列相互接近，這一點(diǎn)只有在Hg2＋存在下才能完成。若不使用裂分G-四鏈體，即只在Hg2＋探測(cè)序列的一端存在一段富G序列，且這段富G序列自身即可滿足G-四鏈體的形成條件。那么，在Pb2＋的存在下，這段富G序列具有強(qiáng)烈的形成G-四鏈體的趨勢(shì)。就某一條鏈B而言，它在無(wú)Pb2＋時(shí)可以抑制G-四鏈體的形成，而在Pb2＋存在下則無(wú)法完全抑制。這樣就會(huì)導(dǎo)致背景信號(hào)的提升，對(duì)檢測(cè)產(chǎn)生正干擾?？偠灾?，相比于非裂分的情況而言，裂分G-四鏈體DNA酶的使用增加了對(duì)兩段富G序列相互接近的需求，

3.5 回收率測(cè)定

采用在空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法，對(duì)純凈水、礦泉水及自來(lái)水樣品進(jìn)行了加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。各樣品的平均回收率為97.5%～104.5%，可以滿足實(shí)際水樣中痕量Hg2＋的分析要求。

4 結(jié) 論

利用G-四鏈體DNA酶進(jìn)行了Hg2＋傳感器的設(shè)計(jì)。該傳感器設(shè)計(jì)方法簡(jiǎn)便，不需要對(duì)使用的寡核苷酸鏈進(jìn)行任何標(biāo)記，也不需要依賴任何昂貴的儀器。通過(guò)采取分子內(nèi)裂分G-四鏈體的設(shè)計(jì)模式，極大地提高了傳感器的抗干擾能力，一些常見(jiàn)的金屬離子的存在都不會(huì)對(duì)Hg2＋的檢測(cè)產(chǎn)生干擾。利用該Hg2＋傳感器，可在50～500 nmol/L及2.0～7.5

SymbolmA@ mol/L兩個(gè)濃度范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)Hg2＋的定量檢測(cè)，檢出限為47 nmol/L。對(duì)實(shí)際水樣的加標(biāo)回收結(jié)果顯示，設(shè)計(jì)的傳感器可以滿足實(shí)際水樣中痕量Hg2＋的分析要求?？紤]到一些金屬離子或小分子物質(zhì)的存在可以對(duì)G-四鏈體結(jié)構(gòu)的形成及穩(wěn)定性產(chǎn)生較大的影響[28]，本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明：使用裂分G-四鏈體進(jìn)行某些傳感器的設(shè)計(jì)，可望在一定程度上提高傳感器的選擇性。

References

1 Huppert J L. FEBS J.， 2010， 277（17）: 3452～3458

2 Travascio P， Li Y， Sen D. Chem. Biol.， 1998， 5（9）: 505～517

3 Travascio P， Bennet A J， Wang D Y， Sen D. Chem. Biol.， 1999， 6（11）: 779～787

4 Li T， Dong S J， Wang E K. Anal. Chem.， 2009， 81（6）: 2144～2149

5 Li T， Li B， Wang E K， Dong S J. Chem. Commun.， 2009， 45（24）: 3551～3553

6 Kong D M， Wu J， Wang N， Yang W， Shen H X. Talanta， 2009，80（2）: 459～465

7 Zhang D， Deng M G， Xu L， Zhou Y， Yuwen J， Zhou X. Chem. Eur. J.， 2009， 15（33）: 8117～8120

8 Kong D M， Wang N， Guo X X， Shen H X. Analyst， 2010， 135（3）: 545～549

9 Li W， Liu Z L， Lin H， Nie Z， Chen J， Xu X， Yao S. Anal. Chem.， 2010， 82（5）: 1935～1941

10 Li T， Wang E K， Dong S J. Anal. Chem.， 2010， 82（4）: 1515～1520

11 Pelossof G， Tel-Vered R， Elbaz J， Willner I. Anal. Chem.， 2010， 82（11）: 4396～4402

12 Bi S， Li L， Zhang S. Anal. Chem.， 2010， 82（22）: 9447～9454

13 Yin B C， Ye B C， Tan W. J. Am. Chem. Soc.， 2009， 131（41）: 14624～14625

14 Li T， Shi L， Wang E K， Dong S J. Chem. Eur. J.， 2009， 15（14）: 3347～3350

15 Deng M G， Zhang D， Zhou Y Y， Zhou X. J. Am. Chem. Soc.， 2008， 130（39）: 13095～13102

16 Li D， Shlyahovsky B， Elbaz J， Willner I. J. Am. Chem. Soc.， 2007， 129（18）: 5804～5805

17 Wang N， Kong D M， Shen H X. Chem. Commun.， 2011， 47（6）: 1728～1730

18 Zhou X H， Kong D M， Shen H X. Anal. Chem.， 2010， 82（3）: 789～793

19 Kong D-M， Xu J， Shen H X. Anal. Chem.， 2010， 82（14）: 6148～6153

20 Xu J， Cai L L， Kong D M， Shen H X. Anal. Lett.， 2011， 44（16）: 2582～２５９２

21 Kotch F W， Fettinger J C， Davis J T. Org. Lett.， 2000， 2（21）: 3277～3280

22 Gray D M， Hung S-H， Johnson K H. Methods Enzymol.， 1995， 246: 19～34

23 Katz S. Biochim. Biophys. Acta， 1963， 68: 240～253

24 Kuklenyik Z， Marzilli L G. Inorg. Chem.， 1996， 35（19）: 5654～5662

25 Paramasivan S， Rujan I， Bolton P H. Methods， 2007， 43（4）: 324～331

26 Kypr J， Kejnovsk I， Rencˇiuk D， Vorlícˇkov M. Nucleic Acids Res.， 2009， 37（6）: 1713～1725

27 Wang Z， Lee J H， Lu Y. Chem. Commun.， 2008， 44（45）: 6005～6007

28 Wong H M， Payet L， Huppert J L. Curr. Opin. Mol. Ther.， 2009， 11（2）: 146～155

Specific Hg2＋ Quantitation Using Intramolecular

Split G-Quadruplex DNAzyme

XU Jing， KONG De-Ming.

（State Key Laboratory of Medicinal Chemical Biology， Nankai University， Tianjin 300071， China）

Abstract G-quadruplex DNAzymes are peroxidase-like complexes formed by Hemin and some nucleic acid G-quadruplexes. Based on this kind of DNAzymes， several chemical sensors and biosensors have been developed. To improve the selectivity of G-quadruplex DNAzyme-based Hg2＋ sensors， intramolecular split G-quadruplex DNAzyme was introduced in the design of Hg2＋ sensor. For this new Hg2＋ sensor， G-quadruplex-forming G-rich sequence was divided into two parts that were linked to the two ends of a Hg2＋-sensing sequence. In the absence of Hg2＋， G-quadruplex structure could not be formed because G-rich sequence was partly caged into an intermolecular duplex. In the presence of Hg2＋， however， the stabilization of the T-T mismatch by Hg2＋ could promote the folding of the Hg2＋-sensing sequence into an intramolecular duplex， accompanied by the destruction of the intermolecular duplex and the formation of an intramolecular split G-quadruplex， which can form catalytically active G-quadruplex DNAzyme upon hemin binding. Utilizing the increase of peroxidase activity of the sensing system， a Hg2＋ detection method has been developed. Using this method， Hg2＋ quantitation can be achieved in the concentration ranges of 50－500 nmol/L and 2.0－7.5

SymbolmA@ mol/L， with a detection limit of 47 nmol/L. The use of split G-quadruplex DNAzyme can increase the dependence of the sensor on Hg2＋， thus， increase the selectivity of the sensor. The method was applied to the determination of Hg2＋ in different water samples with the average recovery of 97.５%－104.5%.

Keywords DNAzyme; Split G-quadruplex; Sensor; Mercury

（Received 27 July 2011; accepted 27 October 2011）