摘 要 利用過氧化苯甲酰能夠在氯化血紅素的催化下將底物對(duì)羥基苯乙酸氧化成具有熒光的二聚體的性質(zhì)，建立了柱后衍生-高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定面粉中過氧化苯甲酰的方法。優(yōu)化了色譜分離條件和柱后衍生條件，結(jié)果表明： 催化劑氯化血紅素的濃度為8

SymbolmA@ mol/L，底物對(duì)羥基苯乙酸的濃度為80

SymbolmA@ mol/L，衍生化試劑的pH 10.5，衍生溫度為35 ℃時(shí)衍生效率最高。在優(yōu)化條件下，過氧化苯甲酰的線性范圍為0.5～100 mg/L；樣品的檢出限為1 mg/kg，樣品的加標(biāo)回收率為98.5%～99.5%。本方法與現(xiàn)有的高效液相色譜法相比，檢測(cè)面粉中過氧化苯甲酰具有抗干擾能力強(qiáng)，靈敏度高。

關(guān)鍵詞 柱后衍生；高效液相色譜；熒光檢測(cè)法；過氧化苯甲酰

2011-07-28收稿；2011-09-30接受

本文系國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局科研計(jì)劃項(xiàng)目（No. 2011IK217）資助

* E-mail: mam@nbciq.gov.cn

1 引 言

過氧化苯甲酰（Benzoyl peroxide，BPO）是一種重要的有機(jī)過氧化物。由于BPO對(duì)小麥面粉具有后熟、增白等作用，長(zhǎng)時(shí)間被用作面粉改良劑。然而，過氧化苯甲酰不僅能破壞面粉中的維生素A、E等營(yíng)養(yǎng)成分，而且還會(huì)產(chǎn)生對(duì)人體有害的苯甲酸和苯酚等有害物質(zhì)。2011年2月11日，衛(wèi)生部聯(lián)合六部委下發(fā)了《關(guān)于撤銷食品添加劑過氧化苯甲酰、過氧化鈣的公告（2011年 第4號(hào)）》，要求自2011年5月1日起，禁止在面粉中添加過氧化苯甲酰。

目前，過氧化苯甲酰的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[1～3]、毛細(xì)管電泳法[4]、氣相色譜法[5]、間接碘量法[6]、紫外分光光度法[7，8]及靜態(tài)注射化學(xué)發(fā)光法[9]等。高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定某些有機(jī)過氧化物的方法已有報(bào)道，一般是采用辣根過氧化酶（HRP）[10，11]或氯化血紅素（Hemin）[12，13]作為催化劑，以對(duì)羥基苯乙酸為底物測(cè)定有機(jī)過氧化物。然而，目前報(bào)道的這此類方法僅限于測(cè)定過氧化氫、過氧酸類的有機(jī)過氧化物等水溶性有機(jī)過氧化物，對(duì)過氧化苯甲酰的研究未見報(bào)道。本研究以氯化血紅素為催化劑，對(duì)羥基苯乙酸為反應(yīng)底物，采用柱后衍生-高效液相色譜-熒光檢測(cè)法檢測(cè)面粉中過氧化苯甲酰。由于該衍生反應(yīng)具有一定的專屬性，因此本方法與現(xiàn)有的高效液相色譜法相比，檢測(cè)面粉中過氧化苯甲酰具有抗干擾能力強(qiáng)，前處理簡(jiǎn)單，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Alliance e2695型高效液相色譜儀，配有2475型熒光檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司）； PINNACLE PCX型柱后衍生器（美國(guó)PICKERING公司）；S40K型pH計(jì)（瑞士Mettler公司）；甲醇和乙醇（色譜純，迪馬科技公司）；氯化血紅素（分析純，Sigma公司）；對(duì)羥基苯乙酸（98%，Acros公司）；過氧化苯甲酰、85% H₃PO₄、氨水（25%）、NH₄Cl、冰乙酸（分析純，國(guó)藥集團(tuán)）。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 衍生試劑的配制 2.68 g NH₄Cl溶于200 mL水，加入30 mL 氨水，定容至500 mL；將2.6 mg氯化血紅素和6.6 mg對(duì)羥基苯乙酸溶于500 mL上述緩沖溶液中，即得柱后衍生試劑。

2.2.2 色譜條件 色譜柱為SunFireTMC18柱（250 mm×4.6 mm×5

SymbolmA@ m），流動(dòng)相為含有0.1%乙酸的甲醇-水（85∶15， V/V）體系，流動(dòng)相在使用前用0.45

SymbolmA@ m濾膜過濾，流速為0.6 mL/min，柱溫為20 ℃，樣品盤溫度為4 ℃。

2.2.3 衍生條件 衍生化試劑為含有8

SymbolmA@ mol/L氯化血紅素和80

SymbolmA@ mol/L對(duì)羥基苯乙酸的NH₄Cl-NH₃#8226;H2O緩沖溶液（pH 10.5）。流速為0.2 mL/min，反應(yīng)管溫度為35 ℃；熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)315 nm，發(fā)射波長(zhǎng)400 nm。

2.2.4 樣品處理 取1.0 g面粉于10 mL比色管中，加入2 mL乙腈，充分搖勻以沉淀面粉中的蛋白質(zhì)，再用乙醇定容至10 mL， 充分振蕩混勻，用0.45

SymbolmA@ m濾膜過濾后進(jìn)樣。

3 結(jié)果與討論

3.1 衍生反應(yīng)

本方法基于的柱后衍生反應(yīng)如下式：

對(duì)羥基苯乙酸在Hemin的催化下被過氧化苯甲酰氧化成能夠產(chǎn)生熒光的二聚體2，2′-二羥基-聯(lián)苯-5，5′-二乙酸，而過氧化苯甲酰則被還原成苯甲酸。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

3.2.1 流動(dòng)相的選擇 實(shí)驗(yàn)表明，甲醇-水體系作為流動(dòng)相，過氧化苯甲酰的響應(yīng)峰峰形拖尾較為嚴(yán)重，加入少量乙酸后， 峰形可以獲得明顯改善。研究了添加乙酸對(duì)BPO響應(yīng)峰的影響，結(jié)果表明，隨加入0.1% HAc（V/V）時(shí)，BPO響應(yīng)峰峰形對(duì)稱，檢測(cè)速度較快。

考察了不同比例甲醇對(duì)過氧化苯甲酰響應(yīng)峰的影響，結(jié)果表明，流動(dòng)相為甲醇-水（85∶15， V/V）時(shí)，過氧化苯甲酰的峰形較好，出峰時(shí)間較短，分析速度較快。

3.2.2 柱溫的選擇 有機(jī)過氧化物穩(wěn)定性一般較差，因此，在分析過程中可能存在分解的現(xiàn)象，因此，在高效液相色譜檢測(cè)有機(jī)過氧化物時(shí)往往采用較低的柱溫和樣品盤溫度[12]，但也有采用較高柱溫進(jìn)行分離檢測(cè)的方法[1]。由于過氧化苯甲酰的半衰期溫度為72 ℃/10 h，在20 ℃下，可以忽略過氧化苯甲酰分解造成的影響。因此，柱溫選擇20 ℃。

3.3 柱后衍生條件的優(yōu)化

3.3.1 氯化血紅素濃度的影響 研究了不同催化劑濃度下對(duì)BPO響應(yīng)峰峰面積的影響，結(jié)果見圖1a。由該圖可知，在其它條件不變的情況下，過氧化苯甲酰的響應(yīng)峰峰面積在氯化血紅素的濃度為8

SymbolmA@ mol/L時(shí)達(dá)到最大值，表明在此濃度下衍生效率最高。

3.3.2 反應(yīng)底物的濃度的影響 研究了不同反應(yīng)底物濃度下對(duì)BPO響應(yīng)峰峰面積的影響，結(jié)果見圖1b。由該圖1b可知，當(dāng)對(duì)羥基苯乙酸的濃度為1

SymbolmA@ mol/L時(shí)，無法獲得有效的BPO響應(yīng)峰; 當(dāng)對(duì)羥基苯乙酸濃度達(dá)到10

SymbolmA@ mol/L時(shí)，隨著對(duì)羥基苯乙酸濃度的增大，BPO響應(yīng)峰的峰面積逐漸增大; 當(dāng)達(dá)到80

SymbolmA@ mol/L時(shí)，BPO響應(yīng)峰的峰面積是對(duì)羥基苯乙酸濃度為10

SymbolmA@ mol/L時(shí)的5～6倍。此后，BPO響應(yīng)峰的峰面積趨于穩(wěn)定。因此，對(duì)羥基苯乙酸濃度選擇為80

SymbolmA@ mol/L。

3.3.3 衍生溫度的選擇 研究了衍生溫度對(duì)BPO響應(yīng)峰峰面積的影響，結(jié)果見圖1c。由圖1c可知，衍生溫度為35 ℃時(shí)，BPO峰面積最大。因此，選擇35 ℃作為最佳衍生溫度。

Fig．1 Effect of hemin concentration （a） ， p-hydroxyphenylacetic acid concentration （b） and temperature （c） on derivatization efficiency

3.3.4 pH值的影響 對(duì)羥基苯乙酸在Hemin的催化下，被過氧化苯甲酰氧化成具有熒光的二聚體2，2′-二羥基-聯(lián)苯-5，5′-二乙酸，2，2′-二羥基-聯(lián)苯-5，5′-二乙酸， 在堿性條件下的熒光強(qiáng)度比酸性條件下大得多。分別研究了pH 8～13范圍內(nèi)的衍生條件，結(jié)果表明，用NH₄Cl-NH₃#8226;H2O為緩沖體系，pH為10～11時(shí)，衍生效率最佳，靈敏度最好，故選擇pH 10.5為優(yōu)化條件。

3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和重現(xiàn)性

在優(yōu)化的色譜條件和柱后衍生條件下，選擇一系列過氧化苯甲酰標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果表明，在0.5～100 mg/L濃度范圍內(nèi)，BPO響應(yīng)峰峰面積與其濃度成良好線性關(guān)系，線性回歸系數(shù)R.2＝0.9997，線性方程為A＝

Symbolm@@ 1.05×10.7＋3.34×10.7c， 其中A為峰面積，c為BPO濃度（mg/L）。

本方法對(duì)過氧化苯甲酰的檢出限為0.1 mg/L（信噪比為3），換算成樣品的檢出限為1 mg/kg。方法的檢出限明顯低于目前大多數(shù)面粉中過氧化苯甲酰的方法的檢出限[1～5，7，8]，說明本方法靈敏度較高。

連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算BPO響應(yīng)峰峰面積的RSD為2.7%，BPO響應(yīng)峰保留時(shí)間的RSD為0.7%，說明方法的重現(xiàn)性良好。

3.5 樣品分析及回收率

隨機(jī)選擇兩種市售面粉為分析對(duì)象，按照2.2.4節(jié)進(jìn)行樣品處理，在優(yōu)化的色譜條件和衍生條件下進(jìn)行分析，其標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖和樣品的色譜圖為圖2。樣品檢測(cè)和標(biāo)準(zhǔn)加入實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。由表1可

知，被分析的市售面粉中含有一定量的BPO，樣品的加標(biāo)回收率在98.5%～99.5%之間，結(jié)果令人滿意。 圖2 過氧化苯甲酰標(biāo)準(zhǔn)色譜圖（A）和樣品色譜圖（B，C）

Fig．2 Chromatograms of benzoyl peroxide （BPO） standards solution （A） and samples（B， C）本方法利用氯化血紅素作為催化劑，由于有機(jī)過氧化物在Hemin的催化下能夠使底物對(duì)羥基苯乙酸迅速生成具有較強(qiáng)熒光的二聚體的，實(shí)現(xiàn)了面粉中BPO的柱后衍生-高效液相色譜-熒光檢測(cè)。本方法靈敏度高，線性范圍寬，回收率好，具有較好的實(shí)用性。

（mg/kg）加標(biāo)測(cè)定結(jié)果Found（mg/kg）回收率Recoveries（%）

143.72063.699.5231.62051.398.5

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Determination of Benzoyl Peroxide in Wheat Flour by Post-column

Derivatization-High PerformanceLiquid Chromatography

with Fluorescence Detection

MA Ming1， XIAO Ling-Yan.2， SHENG Ya-Hong.1， HUANG Jiao.1， YU Xiong-Fei.1

.1（Ningbo Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau Technical Center of China， Ningbo 315012， China）

.2（Societe Generale de Surveillance S.A.-China Standard Technology Development Corp.

Standards Technical Services Co.， Ltd. Ningbo Branch， Ningbo 315040， China）

Abstract A method for the determination of benzoyl peroxide in wheat flour by post-column derivatization-high performance liquid chromatography with fluorescence detection was developed based on the reaction that the p-hydroxyphenylacetic acid can be oxidized to the fluorescent dimer by benzoyl peroxide with hemin as catalyzer. The optimum derivatization efficiency was obtained with the hemin and p-hydroxyphenylacetic acid concentration at 8

SymbolmA@ mol/L and 80

SymbolmA@ mol/L， respectively， with the derivatization reagent pH at 10.5 and the derivatization temperature at 35 ℃. The linear range between 0.5 mg/L to 100 mg/L was observed for the established method. The sample detection limit was 1 mg/kg and standard spike recoveries were 98.5%－99.5% under the optimized conditions. The obvious advantages of excellent anti-jamming capability and high-sensitivity were observed comparing with other HPLC methods for determination of benzoyl peroxide.

Keywords Post-column derivatization; High performance chromatography; Fluorescence detection; Benzoyl peroxide

（Received 28 July 2011; accepted 30 September 2011）