摘 要 利用羰基咪唑柱上衍生法制得牛血清蛋白（BSA）生物手性柱，并研究它在高效液相色譜中對(duì)3種對(duì)映異構(gòu)體（色氨酸、匹多莫德及4苯基1，3惡唑烷2硫酮（L苯））的手性分離性能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明： 隨著pH值從5.0上升到7.0，由于L色氨酸與BSA有固定的作用位點(diǎn)，使得其保留值隨著pH值的增加而大幅增大。而D色氨酸與BSA無(wú)固定作用位點(diǎn)，其保留值隨pH變化基本不變，分離度由1.15上升到8.91，增加了6.8倍；酸性樣品匹多莫德與BSA主要是靜電作用，與色氨酸相反，其對(duì)映體的保留值隨著pH的增加逐漸減小，分離度逐漸下降，pH 7.0時(shí)為單峰，pH 5.0時(shí)Rs＝1.27；中性樣品L苯的分離度隨著pH值的增加有小幅增大。隨著離子強(qiáng)度的減小，3對(duì)對(duì)映體的保留都增強(qiáng)，分離度增大，增加的幅度依次為色氨酸＞匹多莫德＞L苯。

關(guān)鍵詞 牛血清蛋白（BSA）；高效液相色譜；手性分離；pH值；離子強(qiáng)度

1 引 言

在過(guò)去幾十年里，色譜工作者對(duì)多類(lèi)HPLC手性選擇劑，如環(huán)糊精類(lèi)，大環(huán)抗生素類(lèi)，多糖類(lèi)以及蛋白質(zhì)類(lèi)等^[1～4]開(kāi)展研究。蛋白質(zhì)是由L氨基酸組成的復(fù)雜生物大分子，其特殊的立體選擇結(jié)構(gòu)造就了表面特殊的手性環(huán)境和作用位點(diǎn)，使得蛋白質(zhì)手性固定相（CSP）具有特殊的手性識(shí)別能力^[5，6]，可用于拆分其它CSP所不能拆分的藥物^[7，8]。因此， 受到研究者的極大關(guān)注。目前，已有多種蛋白質(zhì)固定相，如牛血清蛋白（BSA）、人血清蛋白（HSA）、α酸性糖蛋白（AGP）、卵粘蛋白（OVM）、胃蛋白酶和纖維素水解酶等，實(shí)現(xiàn)商品化，應(yīng)用在手性分離研究中。

由于蛋白質(zhì)固定相受外部環(huán)境，如pH值、溫度、離子強(qiáng)度等影響較大，蛋白質(zhì)手性柱的分離能力也受到諸多因素的影響。深入探討影響蛋白質(zhì)手性柱分離能力的因素，有利于進(jìn)一步研究生物手性固定相的拆分機(jī)理，優(yōu)化拆分條件。1982年，Allenmark等首次研究BSACSP^[9～11]。之后，關(guān)于血清蛋白生物手性柱的研究主要集中于拆分色氨酸、安息香、華法令等手性分析物^[12，13]，主要研究色氨酸和華法令等對(duì)映體的拆分條件優(yōu)化，而從HPLC角度探討血清蛋白與手性物質(zhì)間的作用機(jī)理的研究報(bào)道較少。

色氨酸屬于生物活性樣品，是一種芳香族、雜環(huán)、非極性α氨基酸。L色氨酸是組成蛋白質(zhì)的常見(jiàn)20種氨基酸中的一種，是哺乳動(dòng)物的必需氨基酸和生糖氨基酸。在自然界中，某些抗生素中有D色氨酸。匹多莫德是一種常用的酸性藥物，是由人工合成的免疫刺激調(diào)節(jié)劑。通過(guò)刺激非特異性自然免疫，體液免疫和細(xì)胞免疫產(chǎn)生效應(yīng)，目前還沒(méi)有關(guān)于其HPLC手性拆分的報(bào)道。L苯為一種化學(xué)合成的手性物質(zhì)，多作為合成其它手性物質(zhì)的中間體，本身呈中性偏弱堿性。

本研究在已有研究^{[14，15]}基礎(chǔ)上，參照文獻(xiàn)\\制備了以硅膠為基質(zhì)鍵合的牛血清蛋白手性HPLC柱，采用BSACSP拆分匹多莫德和L苯，優(yōu)化了拆分色氨酸的色譜條件， 考察了它們對(duì)3對(duì)對(duì)映異構(gòu)體在BSA手性柱分離效果的影響，并初步探討了BSA手性固定相的拆分機(jī)理。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

pH 211精密酸度計(jì)（上海日島科學(xué)儀器有限公司）；液相色譜裝柱機(jī)（美國(guó)Alltech公司）；高效液相色譜儀（美國(guó)，Liballiance Serial Ⅲ， SSI 23201）。

由于牛血清蛋白為生物活性物質(zhì)，一般在pH 5.0～7.0范圍，

才能保持其生物活性。本研究將pH值固定在5.0～7.0范圍內(nèi)。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，在相同條件下進(jìn)樣3次。對(duì)色氨酸、匹多莫德和L苯的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 流動(dòng)相緩沖溶液pH值對(duì)色氨酸、匹多莫德和L苯容量因子及分離度分離的影響?yīng)?/p>

Fig．3 Effect of pH of mobile phase on capacity factor （k′） and resolution （Rs） of Trp， pidotimod and Lben

3.1.1 流動(dòng)相的pH值對(duì)色氨酸的保留和拆分的影響

在室溫下，考察流動(dòng)相pH值對(duì)LTrp和DTrp的k＇和Rs的影響。由圖3a可見(jiàn)，在pH 5.0 ～7.0范圍內(nèi)，流動(dòng)相的pH值對(duì)色氨酸的保留和拆分有很大影響。在pH 5.0到pH 7.0的過(guò)程中，Ltrp的保留值由1.93上升到8.44，增加了3.37倍；而DTrp的保留值基本不受pH值影響，由1.64升至1.91。正是由于兩者保留值受pH值影響差異如此之大，使得分離度隨著pH的增加而顯著增大，由最初的1.15上升到8.91，增加了6.8倍。這是由于LTrp與BSA有固定的結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)結(jié)合位點(diǎn)有很強(qiáng)的專(zhuān)一性^[18]。隨著流動(dòng)相pH的增加，BSA中與LTrp結(jié)合的位點(diǎn)暴露出來(lái)，且BSA所帶負(fù)電荷增加，兩者同時(shí)作用，使得LTrp與結(jié)合位點(diǎn)的作用變強(qiáng)；而DTrp沒(méi)有固定的作用位點(diǎn)，pH值變化所引起的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化對(duì)其保留基本無(wú)影響^[18～20]。

3.1.2 pH值對(duì)匹多莫德分離的影響 固定離子強(qiáng)度為50 mmol/L，改變流動(dòng)相pH值，得出BSA生物手性柱對(duì)匹多莫德對(duì)映體拆分的色譜數(shù)據(jù)如圖3b。緩沖液的pH值對(duì)匹多莫德的拆分有較大影響。隨著pH值的增加，RS匹多莫德的保留值從2.69降至1.46，下降了46%；而SR匹多莫德的保留值從3.05降至1.46，下降了52%。由于RS和SR匹多莫德本身在BSA上保留值的差別不大， pH＝7.0時(shí)都為1.46，使得Rs＝0；且兩者隨著pH值變化保留值變化的趨勢(shì)一致，使得pH 5.0時(shí)的分離度也不大，僅達(dá)到1.27。

在相同離子強(qiáng)度下，pH值變化對(duì)分離匹多莫德的影響與分離色氨酸正好相反。隨著pH值從5.0增加到7.0，色氨酸的保留值逐漸上升，而匹多莫德對(duì)映體的保留值逐漸下降。流動(dòng)相pH值大于或小于BSA的等電點(diǎn)pI（4.7）時(shí)，蛋白質(zhì)分別帶負(fù)電荷或正電荷^[13]。隨著流動(dòng)相pH值由5.0上升到7.0，BSA所帶的負(fù)電荷將大量增加；而匹多莫德為弱酸，在溶液中主要以弱酸根形式存在，導(dǎo)致BSA與匹多莫德之間的相互排斥作用增強(qiáng)，匹多莫德在色譜柱上的保留值顯著下降，與BSA作用的時(shí)間減少，降低了對(duì)映體與BSA的手性作用點(diǎn)發(fā)生相互作用的幾率，導(dǎo)致色譜柱的手性選擇性減弱^[19]，分離度最終降為0。

3.1.3 流動(dòng)相的pH值對(duì)L苯分離的影響

在室溫下，以不同pH值磷酸鹽緩沖溶液為流動(dòng)相，考察了流動(dòng)相pH對(duì)L苯的k′和Rs的影響（圖3c）。在pH 5.5～7.0的范圍內(nèi)，k′1和k′2都只有小幅波動(dòng)。R和SL苯在BSA手性柱上的保留值差異較大，使得兩者的Rs較大；而兩者保留值隨著pH值變化的差異較小，使得Rs的變化較小，遠(yuǎn)不如pH值改變對(duì)色氨酸和匹多莫德的分離度影響明顯。

L苯屬于弱堿性偏中性的物質(zhì)，根據(jù)蛋白質(zhì)拆分手性物質(zhì)的作用原理可推測(cè)，L苯與BSA的作用不是靜電作用，其分離分離主要靠?jī)烧唛g的疏水作用和氫鍵等弱相互作用主導(dǎo)。對(duì)映體進(jìn)入蛋白質(zhì)的微環(huán)境時(shí)，兩者競(jìng)爭(zhēng)，其中之一能夠很好地與蛋白質(zhì)發(fā)生弱相互作用能力，較另外一個(gè)強(qiáng)，從而達(dá)到分離。

3.2 離子強(qiáng)度對(duì)分離的影響?yīng)?/p>

由于牛血清蛋白為生物活性物質(zhì)，在pH 5.0～7.0的范圍內(nèi)，離子強(qiáng)度保持在10～100 mmol/L，才能保持其生物活性。本研究將pH值固定后，離子強(qiáng)度保持在5～50 mmol/L范圍內(nèi)。另外，為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，相同條件下，進(jìn)樣3次。所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。

3.2.1 離子強(qiáng)度對(duì)色氨酸分離的影響 以不同濃度的H2NaPO4和HNa2PO4溶液調(diào)配至pH 5.5， 考察流動(dòng)相中鹽濃度對(duì)L和DTrp的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5a。隨著流動(dòng)相中離子強(qiáng)度由10 mmol/L增加至50 mmol/L，LTrp的保留值受流動(dòng)相離子強(qiáng)度的影響較大，幾乎直線下降；而DTrp的保留值基本不受離子強(qiáng)度變化的影響。正是由于離子強(qiáng)度的減小使得兩者保留值之間的差異變大，分離度隨著離子強(qiáng)度的減小而變大。這主要是由于LTrp與BSA有專(zhuān)門(mén)的作用位點(diǎn)，隨著溶液中離子強(qiáng)度的增加，水化作用減弱，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變緊密，隱藏了LTrp與BSA作用的結(jié)合區(qū)域，使得LTrp保留因子顯著減低；而DTrp與BSA沒(méi)有固定的作用位點(diǎn)，離子強(qiáng)度增加對(duì)其留因子影響不大。由于離子強(qiáng)度對(duì)L色氨酸和D色氨酸的保留因子的影響不同，隨著離子強(qiáng)度的增大，兩者保留值之間的差異變小，使得分離度顯著減小，由最初的5.19下降到2.50。

3.2.2 離子強(qiáng)度對(duì)匹多莫德分離的影響 以不同濃度的H2NaPO4和HNa2PO4溶液調(diào)配至pH 5.0，考察流動(dòng)相中鹽濃度對(duì)匹多莫德分離的影響，結(jié)見(jiàn)圖5b。隨著流動(dòng)相中離子強(qiáng)度由50 mmol/L降低到5 mmol/L，RS匹多莫德的保留值由2.68上升到8.18，增加了2.05倍；SR匹多莫德的保留值由3.04上升到9.26，增加了2.05倍。由于兩者保留值的差異不大，兩者的分離度較小，最大為1.91；隨著離子強(qiáng)度的降低，兩者保留值隨著pH變化的趨勢(shì)相同，使得分離度的變化不大，最低為1.23，最高為1.91，僅增加了35%。

這是由于匹多莫德與BSA色譜柱間作用以靜電作用為主。隨著溶液中離子強(qiáng)度的增加，蛋白質(zhì)不同帶電區(qū)域的庫(kù)侖斥力增加，削弱了BSA與匹多莫德間的相互作用，使得兩者的作用時(shí)間變短；同時(shí)，離子強(qiáng)度的增加破壞了蛋白質(zhì)周?chē)乃瘜?，使得兩者的靜電作用減弱。因此，匹多莫德的保留因子會(huì)受到這兩方面的共同影響。

3.2.3 離子強(qiáng)度對(duì)L苯分離的影響

以不同濃度的NaH2PO4和Na2HPO4溶液調(diào)配至pH 5.5，考察流動(dòng)相中鹽濃度對(duì)L苯的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5c。隨著流動(dòng)相中離子強(qiáng)度由10 mmol/L增加至50 mmol/L，RL苯和SL苯的保留值基本保持不變。兩者保留值本身的差異較大，使得分離度較大，保持在2.73以上；而兩者保留值隨離子強(qiáng)度的增加都略有下降，但變化都不明顯，使得分離度隨離子強(qiáng)度的增減變化不大。

這主要是因?yàn)殡x子強(qiáng)度的增加改變了蛋白質(zhì)周?chē)乃瘜樱瑴p弱了L苯與蛋白質(zhì)之間的弱相互作用力，使得物質(zhì)與蛋白質(zhì)作用的時(shí)間減少，從而使得分離度略有下降。

圖5 離子強(qiáng)度對(duì)對(duì)映體拆分手性的影響?yīng)?/p>

Fig．5 Effect of buffer concentration on capacity factor （k′） and resolution （Rs） of （tryptophan） Trp， pidotimod and （4phenyl1，3oxazolidine2thione） Lben

3.3 流動(dòng)相pH值對(duì)目標(biāo)物手性分離的影響?yīng)?/p>

通過(guò)羰基咪唑柱上衍生化制備了BSA生物手性柱，考察了流動(dòng)相pH值和離子強(qiáng)度變化對(duì)色氨酸、匹多莫德和L苯的分離影響。隨著pH值從5.0上升到7.0，生物活性物質(zhì)LTrp保留值大幅增加，而DTrp保留值基本保持不變；對(duì)于酸性化合物匹多莫德而言，pH值增加，RS匹多莫德和SR匹多莫德的保留值下降，分離度顯著下降，pH 7.0時(shí)Rs＝0，pH 5.0時(shí)Rs＝1.27；而化學(xué)合成的手性物質(zhì)L苯相對(duì)于前兩者來(lái)說(shuō)，受pH值的影響相對(duì)較小。在5～50 mmol/L的離子強(qiáng)度范圍內(nèi)，隨著離子強(qiáng)度的減小，3種對(duì)映體的保留都增強(qiáng)，分離度增大。增加的幅度依次為色氨酸＞匹多莫德＞L苯。三者的最佳分離效果如圖6所示。

圖6 色氨酸、匹多莫德和L苯三者在各自流動(dòng)相最佳離子強(qiáng)度時(shí)的色譜圖

Fig．6 Chromatograms of Trp， pidotimod and Lben in their moble phase with optimum ionic strength

Trp: 10 mmol/L phosphate buffer （pH 5.5）; flow rate，0.5 mL/min; UV detection， 280 nm；

pidotimod: 5 mmol/L phosphate buffer （pH 5.0）; flow rate，0.5 mL/min; UV detection， 210 nm； Lben: 10 mmol/L phosphate buffer （pH 5.5）; flow rate，0.5 mL/min; UV detection， 254 nm。

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Effect of IonicStrength and pH Value in Mobile Phase on Enantio

Separation of BSA High Performance Liquid Chromatography Column

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XIONG YaJin， SU WenCui， ZHANG WeiGuang*， FAN Jun， ZHEN ShengRun， LIN Chun

（School of Chemistry Environment/Institute of Special Material，

South China Normal University， Guangzhou 510006）

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Abstract BSA chiral columns were prepared based on column modification method with carbonyl imidazole as crosslinker. Enantioseparation of tryptophan， pidotimod and 4phenyl1，3oxazolidine2thione （Lben） was obtained on the BSA chiral column by HPLC. The effects of pH values and ionic strength of mobile phase on enantioseparation performance were investigated. For Ltryptophan， the retention factor （k′） increased significantly as the pH value increased from 5.0 to 7.0. While for Dtryptophan k′ rarely changed and the resolution factor （Rs） increased from1.15 to 8.91. In contrast， the retention factor （k′） for RS and SRpidotimod decreased as the pH value increased from 5.0 to 7.0. For Lben， k′ was only a slight increase when the pH value increased. The retention factors of three enantiomers fluctuated as ionic strength increased. However， Rs decreased when a buffer concentration increased.

Keywords Bovine serum albumin; High performance liquid chromatography; Chiral separation; pH value; Ionic strength

（Received 11 March 2011; accepted 21 July 2011）