摘 要 利用高效液相色譜電感耦合等離子體質(zhì)譜（HPLCICPMS）聯(lián)用技術(shù)對(duì)染砷后Chang肝細(xì)胞中的砷代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析。借助合成標(biāo)準(zhǔn)， 采用標(biāo)準(zhǔn)加入法， 表征出肝細(xì)胞中一種未知砷代謝產(chǎn)物甲基硫代砷酸（MMTA）。定量分析顯示，MMTA含量隨染砷濃度升高呈上升趨勢(shì)。采用質(zhì)量平衡分析法對(duì)雙氧水處理前后的染砷細(xì)胞樣品進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，除小分子砷代謝產(chǎn)物外，細(xì)胞中部分砷代謝產(chǎn)物以大分子形態(tài)存在，推測(cè)其為砷蛋白類物質(zhì)。由于MMTA系首次在人體肝細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，本研究結(jié)合實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象和相關(guān)文獻(xiàn)推測(cè)該物質(zhì)系細(xì)胞代謝產(chǎn)物，并且其代謝途徑與二甲基硫代砷酸相似，是以細(xì)胞內(nèi)與其對(duì)應(yīng)的一甲基亞砷酸為代謝起點(diǎn)。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜； 電感耦合等離子體質(zhì)譜； Chang肝細(xì)胞； 一甲基硫代砷酸； 一甲基亞砷酸

1 引 言

砷是人體中含量最豐富12種元素之一，同時(shí)砷也是確認(rèn)的致癌毒物^[1，2]。長(zhǎng)期接觸砷會(huì)對(duì)人體多種組織及器官造成危害，嚴(yán)重?fù)p害人類健康和勞動(dòng)能力^[3]。無機(jī)砷進(jìn)入機(jī)體后，主要在肝臟中發(fā)生生物甲基化，產(chǎn)生系列甲基化砷代謝產(chǎn)物^[4～6]，而這些產(chǎn)物的種類和毒性決定了砷的各種生物效應(yīng)，因而準(zhǔn)確分析和表征砷代謝產(chǎn)物是砷生物代謝研究的基礎(chǔ)。由于砷代謝產(chǎn)物的含量極低且種類較多，而與之相應(yīng)的商業(yè)化的砷形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)種類較少，這給砷代謝產(chǎn)物的表征帶來了很大的難度。

本研究組曾采用高效液相色譜電感耦合等離子體質(zhì)譜（HPLCICPMS）技術(shù)對(duì)不同染砷濃度條件下Chang肝細(xì)胞中砷總量及砷代謝產(chǎn)物進(jìn)行了研究^[7，8]。研究顯示，隨染砷濃度（三價(jià)無機(jī)砷）的增加，Chang肝細(xì)胞中砷總量和甲基砷含量呈增大趨勢(shì)，但甲基化率呈降低趨勢(shì)。此外，通過對(duì)砷代謝產(chǎn)物的表征，發(fā)現(xiàn)了兩種無法用目前已有的商業(yè)化標(biāo)準(zhǔn)表征的代謝產(chǎn)物，其中一種被證明為一甲基亞砷酸（MMA）。本研究采用HPLCICPMS技術(shù)對(duì)另一種未知代謝產(chǎn)物進(jìn)行表征，并在此基礎(chǔ)上推測(cè)該物質(zhì)的代謝過程。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

7500a型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICPMS，美國(guó)Agilent公司），配Babington高鹽霧化器，雙通路霧化室；1100型高效液相色譜 （HPLC，美國(guó)Agilent公司），配二元泵及手動(dòng)進(jìn)樣器；Hamilton PRPX100（250 mm×4.1 mm I.D. ， 瑞士Hamilton Reno公司）陰離子交換色譜柱；Shodex Asahipak GS220 HQ 凝膠過濾色譜柱（300 mm×7.6 mm i.d.， 日本Showa Denko公司）；G1969A 飛行時(shí)間質(zhì)譜（TOFMS，美國(guó)Agilent公司）；MilliQ超純水處理系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）；AL104型電子天平（瑞士MettlerToledo公司）。

（NH4）2CO3，NH4NO3，CH3OH，Na2S，Na2SO3，KI，HCl（優(yōu)級(jí)純，德國(guó)SigmaAldrich公司）；AsI3，As2O5（美國(guó)Alfa Aesar公司）；一甲基胂酸（MMA）、二甲基胂酸（DMA）購自美國(guó)Acros Organics公司；所有形態(tài)分析標(biāo)準(zhǔn)溶液均在4 ℃條件下避光保存。所有溶液均由超聲脫氣后的18.2 MΩ·cm超純水（由MilliQ超純水系統(tǒng)制得）配制。

2.2 細(xì)胞染砷及收集

染砷細(xì)胞樣品是本研究組與沈陽中國(guó)醫(yī)科大學(xué)合作培養(yǎng)獲得。以NaAsO2溶液進(jìn)行染砷，染砷濃度為1.0，5.0，10和20 mol/L，培養(yǎng)及收集方法參見文獻(xiàn)\\。

2.3 一甲基亞砷酸（MMA）和一甲基硫代砷酸（MMTA）的制備

一甲基亞砷酸的制備參照文獻(xiàn)\\，通過二氧化硫還原一甲基砷酸制備而成。

一甲基硫代砷酸的制備參照文獻(xiàn)\\。采用SO2還原一甲基砷酸制備而成：在具有雙孔膠塞的錐形瓶?jī)?nèi)加入含有10 mg/L 一甲基砷酸溶液。在室溫條件下，向該溶液中通入由Na2S與HCl反應(yīng)生成的H2S氣體，該過程持續(xù)1 h，至溶液充分飽和。合成過程中通過ICPMS監(jiān)測(cè)MMTA的轉(zhuǎn)化情況，反應(yīng)結(jié)束后利用離子色譜按照色譜方法A（表1）連續(xù)7次分離純化該標(biāo)準(zhǔn)，收集純化后的MMTA組分，于4 ℃避光保存，該標(biāo)準(zhǔn)可保存7 d。

2.4 樣品處理和HPLCICPMS及ESITOFMS分析染砷肝細(xì)胞中砷化學(xué)形態(tài) 

為保證砷在樣品中所存在形態(tài)不發(fā)生變化，細(xì)胞樣品從－70 ℃超低溫冰箱取出后吹入高純氮?dú)?，置? ℃冷藏冰箱解凍，解凍后的樣品經(jīng)超聲混勻，過0.45

mol/L染砷濃度的染砷細(xì)胞液時(shí)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞液中存在6種不同砷化物，通過與商業(yè)化砷形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時(shí)間對(duì)比發(fā)現(xiàn)，其中4種砷化物可以表征出來，分別為As （tr＝188.1s），DMA （tr＝283.8 s），MMA （tr＝555.4 s） 和As （tr＝672.2 s），而對(duì)于保留時(shí)間為233.7 s的砷代謝產(chǎn)物，已證明為一甲基亞砷酸（MMA）^[8]。分析譜圖可知，MMA，MMA以及DMA的存在說明， Chang肝細(xì)胞攝取外源三價(jià)無機(jī)砷后進(jìn)行了至少2次甲基化代謝，而細(xì)胞中As濃度遠(yuǎn)高于As， 可能是培養(yǎng)過程中的外源空氣氧化導(dǎo)致的結(jié)果。

譜圖中保留時(shí)間tr＝840.3 s的砷代謝產(chǎn)物由于含量低，無法進(jìn)行在線富集或直接采用HPLCESITOFMS進(jìn)行分析。在文獻(xiàn)參閱和實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)一些有價(jià)值的線索： Yathavakilla等^[10]采用與本實(shí)驗(yàn)類似的色譜條件（相同的色譜柱和流動(dòng)相）分析胡蘿卜中砷形態(tài)時(shí)發(fā)現(xiàn)了一種名為一甲基硫代砷酸（Monomethylthioarsonic acid，MMTA）的代謝產(chǎn)物。盡管樣品類別差別較大，但該物質(zhì)的保留時(shí)間及峰形與本實(shí)驗(yàn)中的UN峰非常相似；其次， Suzuki等^[11]在鼠體砷代謝研究中發(fā)現(xiàn)大量的甲基硫代砷酸類物質(zhì)，并通過實(shí)驗(yàn)證明甲基硫代砷酸類物質(zhì)系鼠體砷代謝的產(chǎn)物； 第三，H2O2可以使砷化物脫掉巰基，而不影響砷化物上其它官能團(tuán)^[12]。本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)在細(xì)胞樣品中加入適量H2O2反應(yīng)4 h后（圖1b），細(xì)胞樣品中UN峰消失，與此對(duì)應(yīng)的是一甲基砷酸（MMA）的含量成比例增加，這說明UN峰可能為一甲基砷酸的類似物?；谶@些線索，初步推測(cè)UN峰可能為MMTA。

3.2 一甲基硫代砷酸（MMTA）的表征

利用ESITOFMS對(duì)合成出MMTA進(jìn)行表征，經(jīng)過色譜柱純化的MMTA溶于50 mmol/L （NH4）2CO3和5%甲醇混合液中，以乙酸調(diào)節(jié)至pH 7.4，以0.4 mL/min的流速直接泵入ESITOFMS中檢測(cè)。圖2a 顯示了MMTA的ESITOFMS表征結(jié)果，在合成的MMTA樣品中，產(chǎn)生了m/z 154.9142 \\－的分子離子峰，該分子量與理論計(jì)算得到的MMTA的理論減氫峰分子量（m/z 154.9148 \\－）的質(zhì)量偏差Δm為－3.8×10－9。滿足定性分析要求。

3.3 加標(biāo)法分析Chang肝細(xì)胞中的MMTA

由于Chang肝細(xì)胞中未知峰的含量非常低，無法用有機(jī)質(zhì)譜直接測(cè)定其準(zhǔn)確分子量，因而本研究采用加標(biāo)法對(duì)未知砷化物進(jìn)行表征。將合成后的MMTA加入細(xì)胞樣品中，采用HPLCICPMS測(cè)定細(xì)胞中加標(biāo)后的砷形態(tài)，通過保留時(shí)間的一致性對(duì)未知化合物進(jìn)行表征，結(jié)果見圖2。

圖2b為了采用色譜條件A，即陰離子色譜與ICPMS聯(lián)用測(cè)定加標(biāo)前后細(xì)胞樣品中砷形態(tài)的譜圖。對(duì)比這兩個(gè)譜圖發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加入MMTA后，未知峰UN的峰面積顯著增大。通過連續(xù)測(cè)定樣品考察其保留時(shí)間發(fā)現(xiàn)，未知峰UN的保留時(shí)間與合成的MMTA標(biāo)準(zhǔn)的保留時(shí)間偏差為2.6%（n＝5）。

考慮到加標(biāo)法表征未知化合物時(shí)，該方法無法區(qū)分一些性質(zhì)相近的物質(zhì)，尤其是在色譜柱上保留時(shí)間一致或相近的物質(zhì)。為了排除這種影響，本研究采用小分子凝膠色譜建立了第二種色譜分離法（色譜條件B，表1）對(duì)該樣品進(jìn)行重復(fù)分析，結(jié)果見圖2c。研究顯示，當(dāng)采用凝膠色譜分析加標(biāo)前后細(xì)胞樣品時(shí)，得到了與離子色譜相似的結(jié)果。加標(biāo)后，未知峰UN的峰面積顯著增大，其保留時(shí)間與MMTA的保留時(shí)間偏差為4.3%（n＝5）。經(jīng)過上述實(shí)驗(yàn)，基本認(rèn)定未知砷化物UN為一甲基硫代砷酸（MMTA）。 圖3 不同染砷濃度下肝細(xì)胞中砷形態(tài)譜圖

Fig．3 HPLCICPMS chromatograms obtained from arsenic species in different incubation hepatocytes

3.4 不同染砷濃度下Chang肝細(xì)胞中砷形態(tài)的質(zhì)量平衡分析

不同染砷濃度下Chang肝細(xì)胞中砷形態(tài)譜圖見圖3。本研究采用質(zhì)量平衡法對(duì)形態(tài)分析的準(zhǔn)確性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果見表2。質(zhì)量平衡法是對(duì)形態(tài)分析結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)的常用方法，它是根據(jù)采用形態(tài)分析方法分析出的某元素各個(gè)化學(xué)形態(tài)含量的總和應(yīng)與該元素總量測(cè)定值相一致的原則來評(píng)價(jià)分析方法準(zhǔn)確性的。細(xì)胞中砷元素的總量通過微波消解法測(cè)得。隨著染砷濃度的增加，Chang肝細(xì)胞中砷總量由18.1 g/L。說明隨著染砷濃度的提高，細(xì)胞對(duì)砷的吸收能力增強(qiáng)。在色譜分離的基礎(chǔ)上，本研究采用外標(biāo)法對(duì)6種砷形態(tài)進(jìn)行定量分析。通過對(duì)不同染砷濃度的Chang肝細(xì)胞中砷形態(tài)的定量分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6種砷形態(tài)的變化趨勢(shì)與圖3得出的結(jié)論相符，證明了定量分析的準(zhǔn)確性。對(duì)比酸消解得到的細(xì)胞中的砷總量數(shù)值與6種砷形態(tài)總和數(shù)值發(fā)現(xiàn)，砷形態(tài)總和的數(shù)值低于酸消解總量，這可能是由于部分砷已與蛋白結(jié)合，未在色譜分析時(shí)顯現(xiàn)出來。為了驗(yàn)證這個(gè)假設(shè)，本研究對(duì)細(xì)胞樣品進(jìn)行了H2O2氧化處理，并對(duì)處理后的樣品進(jìn)行形態(tài)分析。結(jié)果顯示，雙氧水處理后的細(xì)胞樣品中砷形態(tài)的總和與酸消解總量的數(shù)值非常接近。這說明了細(xì)胞中的砷除了以小分子形式存在外，還有一部分與蛋白類物質(zhì)結(jié)合。

3.5 MMTA來源的探討?yīng)?/p>

盡管有報(bào)道在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的組織和尿液中發(fā)現(xiàn)過MMTA^[13，14]，但這種物質(zhì)在人體肝細(xì)胞內(nèi)被發(fā)現(xiàn)尚屬首次。因而有必要對(duì)其來源進(jìn)行探討。目前， 關(guān)于含硫砷化物的報(bào)道多集中于二甲基硫代砷化物^[11，15]，近期的報(bào)道證明，二甲基硫代砷化物（主要是二甲基一硫代砷酸（DMMTA）和二甲基二硫代砷酸（DMDTA））是哺乳動(dòng)物代謝外源無機(jī)砷的產(chǎn)物。而且研究顯示只有在二甲基亞砷酸（DMA）存在的情況下哺乳動(dòng)物體內(nèi)才可能生成DMMTA和DMDTA，二甲基砷酸（DMA）不能在生物體內(nèi)生成這類含硫砷化物^[16]。此外，有研究者通過體外實(shí)驗(yàn)證明，細(xì)胞中不同化學(xué)形態(tài)的DMA（包括自由態(tài)的

4 結(jié) 論

本研究利用HPLCICPMS聯(lián)用技術(shù)對(duì)Chang肝細(xì)胞中的砷代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，并對(duì)其中兩種無法用已有商業(yè)化的砷形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)確定的砷形態(tài)進(jìn)行表征。結(jié)合文獻(xiàn)及本實(shí)驗(yàn)所觀察到的現(xiàn)象，推測(cè)這兩種物質(zhì)分別為一甲基亞砷酸（MMA）和一甲基硫代砷酸（MMTA），并通過合成標(biāo)準(zhǔn)加入法證明了該推測(cè)。此外，研究發(fā)現(xiàn)Chang肝細(xì)胞中砷除了以小分子形態(tài)存在外，還有一部分以大分子形態(tài)存在，推測(cè)其為砷蛋白類物質(zhì)。由于MMTA系首次在人體肝細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，本研究推測(cè)該物質(zhì)為細(xì)胞砷代謝的產(chǎn)物，并且其代謝途徑與二甲基硫代砷酸相似，以細(xì)胞內(nèi)與其對(duì)應(yīng)的一甲基亞砷酸為代謝起點(diǎn)。

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References

1 NRC: National Research Council Report: Arsenic in the Drinking Water. Washington， DC: National Academy Press， 1999

2 Germolec D R， Spalding J， Yu H S， Chen G S， Simeonova P P， Humble M C， Bruccoleri A， Boorman G A， Foley J F， Yoshida T， Luster M I. American Journal of Pathology.， 1998， 153（6）: 1775～1785

3 Sun G. Toxicology and Applied Pharmacology， 2004， 198（3）: 268～271

4 Challenger F. Chemical Review， 1945， 36: 315～361

5 Thomas D J， Styblo M， Lin S. Toxicology and Applied Pharmacology. 2001， 176（2）: 127～144

6 Schwerdtle T， Walter I， Mackiw I， Hartwig A. Carcinogenesis. 2003， 24（5）: 967～974

7 CAO Xuan， YU JingJing， WANG Geng， YU ZhenHua，YANG HuangHao，XU YuanYuan，SUN GuiFan，WANG XiaoRu. Chinese. J. Anal. Chem.， 2009， 37（1）: 19～24

曹 煊，余晶晶，王 庚， 于振花，楊黃浩，徐苑苑，孫貴范，王小如. 分析化學(xué)， 2009， 37（1）: 19～24

8 CAO Xuan， YU JingJing， GAO Yang ， SUN JiChang，LIU Yan， XU YuanYuan，SUN GuiFan，WANG XiaoRu. Chinese J. Anal. Chem.， 2011， 39（1）: 7～11

曹 煊， 余晶晶， 高 楊， 孫繼昌，劉 巖， 徐苑苑， 孫貴范， 王小如. 分析化學(xué)， 2011， 39（1）: 7～11

9 Cullen W R， McBride B C. Applied Organometallic Chemistry， 1989， 3（1）: 71～78

10 Yathavakilla S K V， Fricke M. Anal. Chem.， 2008， 80（3）: 775～782

11 Suzuki K T， Mandal B K， Katagiri A， Sakuma Y， Kawakami A， Ogra Y， Yamaguchi K， Sei Y， Yamanaka K， Anzai K， Ohmichi M， Takayama H， Aimi N. Chemical Research and Toxicology， 2004， 17（7）: 914～921

12 Schmeisser E， Raml R， Francesconi K. A， Kuehnelt D， Lindberg A， Srs C， Goessler W． Chemical Commun.， 2004， 16: 1824～1825

13 Naranmandura H， Suzuki N， Iwata K， Suzuki K T. Chemical Research and Toxicology. 2007， 20（4）: 616～624

14 Raml R， Rumpler A， Goessler W， Li L， Ochi T， Francesconi K A. Toxicology and Applied Pharmacology. 2007， 222（3）: 374～380

15 Suzuki K T， Iwata K， Naranmandura H， Suzuki N. Toxicology and Applied Pharmacology. 2007， 218（2）: 166～173

16 Naranmandura H， Suzuki N， Suzuki K T. Chemical Research and Toxicology. 2006， 19（8）: 1010～1018

17 Suzuki K T. Anal. Chim. Acta， 2005， 540（1）: 71～76

18 Hayakawa T， Kobayashi Y， Cui X， Hirano S. Archives of Toxicology. 2005， 79（4）: 183～191

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Characteristics of Arsenic Metabolites in Human Liver Hepatocytes

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CAO Xuan*1， YU JingJing2， GAO Yang1， SUN JiChang1， LIU Yan1，

XU YuanYuan3， SUN GuiFan3， WANG XiaoRu2

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1（Institute of Oceanographic Instrumentation， Shandong Academy of Sciences，

Shandong Ocean Environment Monitoring Technology Key Lab， Qingdao 266001）

2（First Institute Oceanography of State Oceanic Administration， Qingdao 266061）

3（College of Public Health， China Medical University， Shenyang 110001）

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Abstract The hyphenated technique of high performance liquid chromatography coupled with inductively coupled plasma mass spectrometry （HPLCICPMS） was applied to the determination of arsenic metabolites in Chang liver cells after arsenic incubation. Monomethylthioarsonic acid （MMTA） was characterized by standard addition method using synthesized MMTA standard. Quantitative analysis showed that MMTA was increasing when initial incubated arsenic concentration increased. The results of mass balance approach suggested that some arsenicals were found as arsenicprotein bonded forms beside low molecular arsenical forms in hepatocytes. Furthermore， MMTA， which was first found in human hepatocytes， was speculated as a kind of metabolite after arsenic incubation. Like dimethylthioarsenicals， it derived from the metabolism of MMA in human hepatocytes.

Keywords High performance liquid chromatography; Inductively coupled plasma mass spectrometry; Chang liver cells; Arsenic metabolites; Methylarsonous acid; Monomethylthioarsonic acid 

（Received 8 June 2011; accepted 8 October 2011）