摘 要 心臟衰竭可能與心臟膠原蛋白交聯(lián)異常有關(guān)，因為交聯(lián)過程對心臟膠原蛋白的機(jī)械強(qiáng)度起決定作用。研究表明，某些交聯(lián)氨基酸的含量可以用作對應(yīng)膠原蛋白交聯(lián)異常的分子標(biāo)記，但心臟膠原蛋白交聯(lián)異常的分子標(biāo)記尚不清楚。本研究建立了串聯(lián)質(zhì)譜的分析方法可以高選擇性的檢測水解膠原蛋白質(zhì)中兩種重要的交聯(lián)氨基酸-吡啶諾林（PYD）和去氧吡啶諾林（DPD）。在小鼠心室膠原蛋白酸性水解產(chǎn)物中檢測到DPD，未檢測到PYD，說明PYD與心臟膠原蛋白的交聯(lián)過程無關(guān)，而DPD在心臟膠原蛋白交聯(lián)中起更重要的作用，有可能成為與心臟衰竭相關(guān)的分子標(biāo)記。本研究提供了一種基于質(zhì)譜的研究心臟膠原蛋白交聯(lián)產(chǎn)物的方法，也可用于其它膠原蛋白的分析。

關(guān)鍵詞 心臟衰竭；膠原蛋白；交聯(lián)氨基酸；質(zhì)譜; 母離子掃描

1 引 言

膠原蛋白是哺乳動物體內(nèi)最主要的蛋白質(zhì)，約占蛋白質(zhì)總量的30%^[1]。膠原蛋白主要分布于細(xì)胞間質(zhì)，常形成纖維結(jié)構(gòu)，為多細(xì)胞生物提供細(xì)胞間的機(jī)械支撐。而膠原蛋白的機(jī)械強(qiáng)度取決于蛋白質(zhì)亞單位之間通過共價鍵形成的交聯(lián)程度。因為交聯(lián)可穩(wěn)定膠原蛋白的纖維結(jié)構(gòu)并提供足夠的強(qiáng)度和粘彈性以實現(xiàn)各種結(jié)構(gòu)功能。交聯(lián)程度和形成纖維的數(shù)量，密度，取向和尺度決定了膠原蛋白的種類和功能^[2]。例如，人體內(nèi)的I型膠原蛋白（如心臟膠原蛋白）由3條α鏈組成，每條α鏈分子量約100 kDa （約1000個氨基酸殘基），3條α鏈相互間通過羥脯氨酸殘基之間的氫鍵作用構(gòu)成緊密穩(wěn)定的左旋三股螺旋結(jié)構(gòu)（γ）^[3，4]。幾乎所有纖維化的膠原蛋白的交聯(lián)都是在賴氨酰氧化酶作用下通過賴氨酸或羥賴氨酸的側(cè)鏈醛基化而實現(xiàn)的^[5]。發(fā)生在兩條側(cè)鏈間的交聯(lián)被稱作二價交聯(lián)；若三條鏈參與，則是三價交聯(lián)或成熟交聯(lián)。多種不同的交聯(lián)方式可能同時存在于一種纖維狀膠原蛋白中^[6]。此外賴氨酰氧化酶的活性可以被β-氨基丙腈，EDTA，D-青霉胺及其它羰基試劑抑制。

近年來，交聯(lián)過程在臨床醫(yī)學(xué)上的重要性引起了廣泛關(guān)注。例如，當(dāng)細(xì)胞間質(zhì)的成分因血壓升高而發(fā)生變化時，細(xì)胞間質(zhì)纖維膠原蛋白的合成，降解，以及交聯(lián)均可能引發(fā)心臟衰竭^[7，8]。研究還發(fā)現(xiàn)血壓升高會引起心臟纖維膠原蛋白總量，膠原蛋白交聯(lián)的比例，及賴氨酰氧化酶活性的顯著變化。而且基因表達(dá)，酶活性及交聯(lián)過程還與心室剛度相關(guān)聯(lián)^[9]。統(tǒng)計表明， 高血壓每年造成全球500萬人早亡，占世界總死亡人數(shù)的13%，其中美國約2萬人^[10]。所以，研究心臟膠原蛋白的交聯(lián)，心室剛度，賴氨酰氧化酶活性及基因調(diào)控之間的關(guān)系有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用前景。本研究將著重闡述如何建立串聯(lián)質(zhì)譜法來鑒定存在于膠原蛋白中兩種常見的結(jié)構(gòu)近似的交聯(lián)氨基酸--吡啶諾林（PYD）和去氧吡啶諾林（DPD），為進(jìn)一步研究交聯(lián)作用與心臟疾病間的關(guān)系提供分析支持。吡啶諾林（PYD）和去氧吡啶諾林（DPD）是軟骨和骨骼中常見的三價交聯(lián)產(chǎn)物^[11]。文獻(xiàn)多關(guān)注于它們作為生物分子標(biāo)記在膠原蛋白代謝中的作用^[12，13]。例如，高于正常的吡啶諾林及羥賴氨酸被視作成骨不全癥的標(biāo)志^[14]，以及通過檢測尿中的PYD和DPD含量來監(jiān)測骨病^[15]。而由于心臟膠原蛋白的復(fù)雜性及方法的限制，目前關(guān)于PYD和DPD在心臟膠原蛋白中的作用尚不清楚。本研究將通過串聯(lián)質(zhì)譜法檢測膠原蛋白水解產(chǎn)物中的PYD和DPD，并揭示PYD和DPD與心臟膠原蛋白交聯(lián)的關(guān)系。

2 實驗部分

2.1 實驗試劑

吡啶諾林（PYD）和去氧吡啶諾林（DPD），購自Quidel （San Diego， CA， USA）。HPLC級甲醇，水，乙腈，乙酸，三氟乙酸（TFA）均購自Sigma-Aldrich （St. Louis， MO， USA）。

2.2 樣品準(zhǔn)備

2.2.1 小鼠心臟膠原蛋白的分離 用異氟醚將小鼠麻醉，再將其頸椎脫位。取出心臟并除去前室，活瓣，右心室及乳頭肌等。立即稱重并將左心室放入1.5 mL 0.1 mol/L NaOH溶液中。用剪刀將左心室剪碎?；旌衔镌俦晦D(zhuǎn)移到較大試管中，加入10倍體積的NaOH溶液。4 ℃下靜置24 h后高速離心20 min （10000 r/min）。除去上層清液，膠原蛋白沉淀放入10倍體積的0.1 mol/L NaOH溶液中。再次在4 ℃下靜置24 h后離心分離，膠原蛋白轉(zhuǎn)移至2 mL試管中，加入1 mL 水振蕩清洗再離心分離。用水清洗3次后，純化的膠原蛋白儲存在－20 ℃。

2.2.2 硼氫化還原膠原蛋白 將1%樣品重量的NaBH4溶解于0.1 mmol/L NaOH溶液中，再加入樣品，室溫放置3 h并不時振蕩， 加入冰醋酸至pH＝2。在4 ℃下離心分離，除去上層清液。加入1 mL水清洗。重復(fù)2次用水清洗。樣品用真空離心蒸發(fā)濃縮器蒸干。

2.2.3 酸水解膠原蛋白 將1 mL 6 mol/L HCl加入5 mg樣品中。將混合物放入110 ℃烤箱內(nèi)20 h。然后將樣品蒸干儲存在－20 ℃冰箱中。

2.2.4 低能碰撞誘導(dǎo)解離（CID） 實驗使用Applied Biosystem Q-trap 4000型質(zhì)譜儀 （Foster City， CA），裝配納流噴霧電離源，使用正離子模式。PYD和DPD標(biāo)準(zhǔn)樣用甲醇-水混合物（70∶30， V/V）稀釋10倍。在膠原蛋白水解產(chǎn)物中加入200 L甲醇-水混合物（70∶30， V/V），充分振蕩后，離心分離，取上層清液用作分析。質(zhì)譜儀優(yōu)化后的參數(shù)為： 進(jìn)樣流速為2.0 L/min。碰撞氣體為氮氣，碰撞能量為25～45 eV。碰撞室的壓力維持在1 Pa左右。裂解實驗中選擇單一同位素前體離子以去除其它同位素峰的干擾。

3 結(jié)果與討論

3.1 PYD和DPD的子離子掃描譜（Product Ion Spectra）

PYD和DPD具有類似的化學(xué)結(jié)構(gòu) （圖1），它們的分子離子峰分別出現(xiàn)在m/z 429和413。圖2a是PYD的MS/MS譜。分子離子峰位于m/z 429。分子離子活化后，可觀察到幾條裂解途徑。首先， 圖1 吡啶諾林（PYD）和去氧吡啶諾林（DPD）的化學(xué)結(jié)構(gòu)，自然狀態(tài)以陽離子形式存在。唯一區(qū)別是R3支鏈上的OH和H

Fig．1 Chemical structures of pyridinoline （PYD） and deoxypyridinoline （DPD）， which naturally exist as cations. The only difference is between OH and H in R3

通過中性丟失氨（17 Da）產(chǎn)生m/z 412的碎片離子。分裂掉N-烷基化的R3側(cè)鏈形成m/z 267的碎片離子，進(jìn)一步失水產(chǎn)生m/z 249的離子。位于m/z 146的碎片峰是R3＋離子，而m/z 128的離子是R3＋失水的產(chǎn)物，m/z 100是R3＋中性丟失HCOOH（46 Da）的結(jié)果，同理m/z 82是R3＋中性丟失\\產(chǎn)生的。

DPD的MS/MS譜如圖2b所示，分子離子峰位于m/z 413。DPD經(jīng)歷類似于PYD的裂解途徑。中性丟失氨產(chǎn)生m/z 396的碎片離子。這里同樣產(chǎn)生了R3＋離子（m/z 130），再丟失HCOOH產(chǎn)生m/z 84的產(chǎn)物離子。特別值得注意的是，DPD同樣分裂掉N-烷基化的R3側(cè)鏈并失水，分別產(chǎn)生了m/z 267和249離子，這一特征與PYD相同。比較PYD和DPD的子離子掃描譜，不難看出它們具有類似的裂解途徑。DPD的裂解途徑相對簡單，因為DPD的R3側(cè)鏈比PYD的R3側(cè)鏈少一個羥基（圖1），因而DPD的失水途徑大大減少。

圖2 （a） 吡啶諾林（PYD）和（b）去氧吡啶諾林（DPD）的子離子掃描譜。碰撞氣體為氮氣，碰撞能量為45 eV

Fig．2 Product ion spectra of （a） PYD and （b） DPD. N2 was used as collision gas， and the collision energy was 45 eV

3.2 PYD和DPD的母離子掃描譜 （Precursor ion scanning）

三重四極桿質(zhì)譜儀（QqQ）（或Q-trap）的前體離子掃描模式是從復(fù)雜混合物中識別目標(biāo)分子的有力工具。前體離子掃描模式固定Q3的DC和RF，使得只有某一特定m/z值的離子被檢測到。通過掃描Q1使一定范圍的m/z離子得以通過Q1，到達(dá)碰撞室（q），發(fā)生裂解。最終只有能夠產(chǎn)生某一特定碎片離子的前體離子會出現(xiàn)在譜圖上。本實驗中膠原蛋白的水解產(chǎn)物是包含各種氨基酸和交聯(lián)氨基酸及其它雜質(zhì)的混合物。要通過色譜或其他技術(shù)提純PYD或DPD幾乎是不可能的或非常困難。所以，前體離子掃描非常適合用于檢測該復(fù)雜體系中的PYD或DPD。 圖3 PYD和DPD混合標(biāo)準(zhǔn)樣的母離子掃描譜。掃描Q1使全部離子（m/z 200～500）通過，Q3固定在m/z 267。碰撞氣體為氮氣，碰撞能量為45 eV

Fig．3 Precursor ion scan MS/MS spectrum of PYD and DPD standard mixture. Q1 was scanning to transmit all the ions （m/z 200－500） formed at the Nanospray source， and Q3 was fixed at m/z 267. N2 was used as the collision gas， and the collision energy was 45 eV

PYD和DPD的裂解行為近似，更重要的是它們都產(chǎn)生m/z 267的碎片離子。該離子峰可用作指紋特征峰，同時由于該碎片是通過開環(huán)反應(yīng)產(chǎn)生的，因而比脫水或脫氨的中性丟失更具獨特性。此外，選擇該峰的另一優(yōu)勢在于可以同時檢測PYD和DPD。PYD和DPD標(biāo)準(zhǔn)樣品的母離子掃描譜如圖3所示，只有兩個主峰出現(xiàn)，m/z 429和413，分別對應(yīng)PYD和DPD，顯示了m/z 267的前體掃描具備高選擇性，其它雜質(zhì)的干擾很少。但是，譜圖上仍然可見一些低強(qiáng)度前體離子，如m/z 438和388，這說明當(dāng)該掃描應(yīng)用到膠原蛋白水解產(chǎn)物時，雜質(zhì)影響不可避免，因為PYD和DPD的濃度不會很高且樣品組分非常復(fù)雜。

為了找到PYD和DPD最佳的指紋特征片段，選擇PYD和DPD最小的裂解片段，分別為m/z 82和84 （圖2）。選擇這兩個峰的原因是由于它們是賴氨酸或羥賴氨酸殘基的一部分（圖1），因而除PYD和DPD外，其它交聯(lián)氨基酸也有可能產(chǎn)生m/z 82或84的殘片，所以它們有可能成為識別其他交聯(lián)氨基酸的特征峰。圖4是PYD和DPD標(biāo)準(zhǔn)樣混合物的m/z 84和82的母離子掃描譜。在m/z 84的母離子掃描譜（圖4a）中可看到很強(qiáng)的m/z 413峰，說明m/z 84的主要貢獻(xiàn)來自于DPD；還出現(xiàn)一組低質(zhì)量峰及m/z 429弱峰，這說明其選擇性不高。同樣，m/z 82的前體掃描也有類似問題（圖4b），除了最強(qiáng)的m/z 429（PYD）外，還有其它信號出現(xiàn)。至此說明選擇m/z 267作前體掃描的選擇性要大大高于選擇m/z 84或82，原因可能是小質(zhì)量離子有更多途徑生成，而且產(chǎn)生小質(zhì)量離子的概率也高于大質(zhì)量離子。綜合圖3和圖4的結(jié)果，表明m/z 267是識別DPD和PYD的最佳選擇。

圖4 PYD和DPD混合標(biāo)準(zhǔn)樣的母離子掃描譜

Fig．4 The precursor ion scan MS/MS spectra of PYD and DPD standard mixture

a. Q3固定在m/z 84； b. Q3固定在m/z 82。碰撞氣體為氮氣，碰撞能量為45 eV。 a. Q3 was fixed at m/z 84; b. Q3 was fixed at m/z 82. N2 was used as the collision gas， and the collision energy was 45 eV

3.3 小鼠心室膠原蛋白水解產(chǎn)物的全掃描和母離子掃描譜

水解的膠原蛋白含有自由氨基酸和交聯(lián)氨基酸以及可能的其它雜質(zhì)，其全掃描質(zhì)譜如圖5a所示。由于成分非常復(fù)雜，圖譜背景信號很強(qiáng)，因而期待的m/z 413和429的峰難以從中辨認(rèn)。m/z 175峰符合精氨酸分子離子的質(zhì)量，對比文獻(xiàn)\\，m/z 175的MS/MS譜符合精氨酸的特征（圖5b），這可證明所測樣品確是水解的蛋白質(zhì)，說明蛋白質(zhì)的提取這一精細(xì)操作是成功的。

圖5 （a） 小鼠心室膠原蛋白水解產(chǎn)物的全掃描質(zhì)譜。（b） 圖5a中m/z 175離子的子離子掃描譜。碰撞氣體為氮氣，碰撞能量為25 eV

Fig．5 （a） Full scan MS spectrum of hydrolyzed mouse ventricle collagen; （b） product ion spectrum of the peak at m/z 175 in Fig.5a. N2 was used as the collision gas， and the collision energy was 25 eV

圖6a為小鼠心室膠原蛋白水解產(chǎn)物的母離子掃描（m/z 267）。雖然背景信號比PYD和DPD的標(biāo)

圖6 （a） 小鼠心室膠原蛋白水解產(chǎn)物 （b） 溶劑的母離子掃描譜。Q3固定在m/z 167。碰撞氣體為氮氣，碰撞能量為45 eV

Fig．6 The precursor ion scan MS/MS spectrum of hydrolyzed mouse ventricle collagen（a） ; solvent（b）. Q3 was fixed at m/z 267. N2 was used as the collision gas， and the collision energy was 45 eV

準(zhǔn)樣（圖3）強(qiáng)很多，但對應(yīng)于DPD的m/z 413信號依然可見。同時PYD的信號未檢測到。文獻(xiàn)\\表

明，PYD幾乎只在骨膠原蛋白中存在，此結(jié)果與本研究一致。譜圖中除m/z 413外，還有許多其它峰，但m/z 413的信號是最強(qiáng)的。盡管如此，由于信號絕對強(qiáng)度不高（～3200 cps），因而可能懷疑該信號為噪音。本實驗在不同時間（天）重復(fù)多次，均獲得相同結(jié)果。此外，測試了甲醇-水（70∶30，V/V）溶劑的前體掃描（m/z 267）作為空白實驗（圖6b），未發(fā)現(xiàn)m/z 413的信號，更重要的是信號強(qiáng)度最大約300 cps，遠(yuǎn)小于實際樣品。對比圖6a和圖6b，可以確認(rèn)DPD存在于心臟膠原蛋白，并且是其交聯(lián)的方式之一。

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4 結(jié) 論

研究了兩種重要的交聯(lián)氨基酸吡啶諾林（PYD）和去氧吡啶諾林（DPD）的質(zhì)譜裂解特征?；赑YD和DPD的裂解途徑，m/z 267被選作識別PYD和DPD指紋特征峰。m/z 267前體掃描具有對PYD和DPD的高度選擇性。從小鼠心室膠原蛋白水解產(chǎn)物中檢測到了DPD，未檢測到PYD，說明PYD與心臟膠原蛋白的交聯(lián)過程無關(guān)。而DPD在心臟膠原蛋白交聯(lián)中起更重要的作用， 因此，有可能成為心臟衰竭相關(guān)的分子標(biāo)記。本研究采用的質(zhì)譜研究心臟膠原蛋白交聯(lián)產(chǎn)物的方法，也可用于分析其它膠原蛋白的交聯(lián)產(chǎn)物。

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Mass Spectrometric Analysis of Cross-linked Amino Acids in Collagen

JIANG Wei*1， YU Gang2

（1Novartis Institutes for Biomedical Research， Cambridge， MA 02139 USA， 2Department of Earth and

Planetary Sciences， Harvard University， Cambridge， MA 02138 USA）

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Abstract Cross-linking plays a critical role in determining the mechanical strength of heart collagen， and its malfunction is probably related to the occurrence of heart failure. Studies show that the content of some cross-linked amino acids can be used as biomarkers for the abnormal cross-linking of their corresponding collagens. However， it is still unclear about the biomarkers for the unusual cross-linking in heart collagen. Hence we present a tandem mass spectrometry method that enables highly selective identification of two important crosslink， amino acids-pyridinoline （PYD） and deoxypyridi-noline （DPD） in hydrolyzed collagen. DPD is detected in acid hydrolyzed mouse ventricle collagen， while PYD not， indicating that PYD is not related to the cross-linking processes in heart collagen， but DPD plays a more significant role， so DPD might become a biomarker for heart failure. Overall， this study provides a mass spectrometry based method to investigate the cross-linking products in mouse heart collagen， which can be also applied to other collagens

Keywords Heart failure; Collagen; Cross-linked amino acid; Mass spectrometry; Precursor ion scan

（Received 28 June 2011; accepted 2 September 2011）