摘 要 通過合成具有仿生功能的石墨烯聚多巴胺納米材料，將其與辣根過氧化酶組裝到電極表面，以對苯二酚為電子媒介體制備H2O2傳感器。此修飾電極對H2O2具有良好的電催化活性，檢測的線性范圍為5.0×10－7～3.3×10－4 mol/L；線性回歸方程為Y＝29.69x＋0.04577，相關(guān)系數(shù)為R＝0.9995; 檢出限為3.7×10－7 mol/L （S/N＝3）。

關(guān)鍵詞 聚多巴胺； 石墨烯； 對苯二酚； 辣根過氧化物酶； 過氧化氫

1 引 言

納米材料由于具有良好的導(dǎo)電性及生物相容性， 已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生物傳感器的制備中^[1～4]。2004年，Geim等首次發(fā)現(xiàn)二維晶體石墨烯（GR）的存在。由于其獨特的電學(xué)、光學(xué)及催化性能，被廣泛應(yīng)用于生物傳感器及電催化領(lǐng)域^[5，6]。結(jié)構(gòu)完整的石墨烯是由不含任何不穩(wěn)定鍵的苯六元環(huán)組合而成的二維晶體，表面呈惰性使其具較高的化學(xué)穩(wěn)定性。與其它溶劑的相互作用較弱，同時石墨烯的片與片之間有較強的范德華力，容易聚集，這給石墨烯的研究和應(yīng)用造成了極大的困難。因此，對其進行有效的功能化修飾非常重要^[7～9]。

聚多巴胺是貝殼、蚌等生物分泌的粘性蛋白的主要成分，具有極強的粘附性，能穩(wěn)定地固定在各種基質(zhì)上^{[10，11]}。Lee等^[12]以多巴胺（DA）為單體，通過簡單的自聚合反應(yīng)在各種基質(zhì)表面形成了仿生聚多巴胺膜（PDA），該聚多巴胺膜不僅具有良好的粘附性，同時保持了原有單體良好的生物相容性。聚多巴胺薄膜被廣泛地應(yīng)用于對Au和Pt納米顆粒、碳納米管、石墨烯氧化物的表面修飾^[13～15]。

多巴胺特有的還原性可以作為氧化石墨烯（GO）的還原劑。聚多巴胺良好的粘附性和生物相容性又可以作為石墨烯的保護劑。本研究利用聚多巴胺膜對基底極強的結(jié)合力及其良好的生物活性，通過一步反應(yīng)法合成具有仿生功能的石墨烯聚多巴胺（GRPDA）納米復(fù)合材料，并將其引入過氧化氫傳感器的制備中，實現(xiàn)了對過氧化氫的快速、靈敏檢測。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Chi660a電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司）；Lambda 35紫外光譜儀（PerkinElmer公司）；782雙向磁力加熱攪拌器（金壇市新航儀器廠）；SK1200H超聲波清洗器（上?？茖W(xué)超聲儀器有限公司）；AJⅢa原子力顯微鏡（上海愛建納米科技發(fā)展有限公司）。

鹽酸多巴胺（CP阿拉丁試劑）；辣根過氧化物酶（≥250 U/mg上海三杰生物技術(shù)有限公司）；對苯二酚（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；H2O2（分析純，汕頭西隴化工有限公司）；石墨粉（汕頭西隴化工有限公司）。

2.2 GRPDA仿生材料的制備

通過改進的Hummers方法^[16～18]制備GO。

GRPDA仿生材料的制備^[13]：10 mg GO加入到20 mL， 磷酸鹽緩沖液 （pH＝8.0） 中，攪拌下通N2 10 min，加入5 mg鹽酸多巴胺，冰水浴下超聲10 min，60 ℃下強烈攪拌24 h，反應(yīng)過程用紫外可見光譜監(jiān)測。冷卻后離心，反應(yīng)混合物用蒸餾水洗滌3次，重新分散到20 mL蒸餾水中，得到0.5 g/L黑色懸浮液。

2.3 HRP酶的固定

取上述0.5 g/L GRPDA懸浮液120L 2 g/L HRP混合， 超聲10 min，在冰箱4 ℃里放置12 h，使其達到平衡狀態(tài)。

2.4 修飾電極的制備

電極預(yù)處理：玻碳電極分別用0.3和0.05

3 結(jié)果與討論

3.1 紫外可見光譜

采用紫外可見吸收光譜對多巴胺還原氧化石墨烯過程進行監(jiān)測，結(jié)果如圖1所示：氧化石墨烯的吸收峰位于230和300 nm處。隨著還原反應(yīng)的進行，氧化石墨烯的吸收峰消失，在263 nm處出現(xiàn)了一個新的吸收峰，可歸為石墨烯的吸收峰^[6，13]。隨著反應(yīng)時間的延長，吸光度值逐漸增大，且溶液逐漸由渾濁變得澄清，說明多巴胺與氧化石墨烯發(fā)生反應(yīng)；在將氧化石墨烯還原成石墨烯的同時，氧化石墨烯作為氧化劑又將多巴胺氧化聚合生成聚多巴胺，得到了GRPDA納米復(fù)合材料。在石墨烯表面沉積的聚多巴胺由于其表面大量的親水基團又極大地提高了石墨烯的水溶性。

3.2 原子力顯微鏡表征

對合成的GRPDA納米復(fù)合材料進行了AFM表征。如圖2所示，GO片層厚度為0.60 nm；GO被多巴胺還原生成GR，

3.3 交流阻抗圖

圖3是幾種修飾電極在0.5 mol/L KCl＋2 mmol/L K4Fe（CN）6/K3Fe（CN）6 溶液中的交流阻抗圖，根據(jù)Nyquist圖中的半圓直徑可以求出電極的電子傳遞電阻^[19]。由圖3可知，裸玻碳電極阻抗為40 Ω；當(dāng)在玻碳電極表面修飾一層HRP/Nafion膜后，電極的阻抗增大到2700 Ω；當(dāng)用GO/HRP/Nafion膜修飾電極時，電極的阻抗減小到1200 Ω；當(dāng)用GRPDA/HRP/Nafion膜修飾電極時，電極的阻抗減小到300 Ω。說明聚多巴胺仿生功能化的石墨烯具有良好的導(dǎo)電性，能提高電子的傳遞速率，可應(yīng)用于傳感器的構(gòu)建中。

圖3 不同修飾電極在0.5 mol/L KCl＋2 mmol/L K4Fe（CN）6/K3Fe（CN）6 溶液中的交流阻抗圖

Fig．3 Nyquist plots of bare GCE （a）， GCE/GRPDA/HRP/Nafion （b）， GCE/GO/HRP/Nafion （c）， GCE/HRP/Nafion （d） electrodes in 0.5 mol/L KCl＋2 mmol/L K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6 aqueous solution

進一步考察GCE/GRPDA/HRP/Nafion電極在不同掃速下的電化學(xué)行為，研究了其峰電流與掃速關(guān)系，發(fā)現(xiàn)電流與掃速的平方根呈線性關(guān)系，表明修飾電極反應(yīng)受表面擴散控制。

3.4 循環(huán)伏安法表征

圖4A比較了H2O2在GCE/GRPDA/HRP/Nafion和GCE/HRP/Nafion電極上的循環(huán)伏安曲線，發(fā)現(xiàn)使用石墨烯修飾的電極對H2O2的電催化還原峰電流明顯大于未使用石墨烯修飾的電極，且還原峰電位正移了85 mV，表明該石墨烯修飾電極對H2O2有很強的電催化活性，并且可以有效減圖4 （A） GCE/HRP/Nafion電極（線1和線2）與GCE/GRPDA/HRP/Nafion電極（線3和線4）在不含H2O2 （線1和線3）和含有1.0 mmol/L H2O2的PBS溶液 （線2和線4）中的CV曲線; （B） GCE/GRPDA/HRP/Nafion電極在含有0（a）， 0.2（b）， 0.4（c）， 0.6（d）， 0.8（e）， 1.0 （f） mmol/L H2O2的PBS溶液中的CV曲線

3.5 電極過程的機理

以HQ為媒介體的過氧化氫生物傳感器的催化過程原理如下：

H2O2＋HRP→HRPⅠ＋H2O（1）

HRPⅠ＋HQ （Red） →HRPⅡ＋HQ （Ox）*→HRP＋HQ （Ox） （2）

HQ （Ox）＋2H＋＋2e →HQ （Red） （3）

HQ （Ox）被還原為HQ （Red），從而形成還原電流。

石墨烯表面存在大量類似于斷層的結(jié)構(gòu)缺陷，能提供較多的反應(yīng)活性位點，同時由于其優(yōu)良的導(dǎo)電性能，又能促進酶活性中心與電極間的電子轉(zhuǎn)移過程。因此聚多巴胺石墨烯復(fù)合材料既具有石墨烯的優(yōu)良的電催化性能， 又表現(xiàn)出良好的生物相容性。其對過氧化氫表現(xiàn)出良好的電催化活性，使過氧化氫能夠在較正的電位下發(fā)生電催化還原反應(yīng)。 圖5 GCE/HRP/Nafion （a）， GCE/GO/HRP/Nafion （b）， GCE/GRPDA/HRP/Nafion （c）對H2O2的it響應(yīng)曲線，工作電位: 0 V

Fig．5 Chronoamperometric responses for GCE/HRP/Nafion （a）， GCE/GO/HRP/Nafion （b）， GCE/GRPDA/HRP/Nafion （c） upon subsequent additions of H2O2 in PBS solution. Potential applied: 0 V

3.6 不同修飾電極的電化學(xué)性質(zhì)比較

圖5比較了3種不同修飾電極對H2O2的it響應(yīng)曲線，發(fā)現(xiàn)聚多巴胺仿生功能化的石墨烯修飾電極對H2O2的響應(yīng)電流明顯增大。石墨烯由于其巨大的比表面積及優(yōu)良的導(dǎo)電性能能夠為HRP活性中心與電極表面的電子傳遞提供快速通道，同時由于聚多巴胺膜的生物相容性能有效保護HRP的生物活性。因此， GRPDA復(fù)合材料能極大地促進酶活性中心與電極間的電子傳遞速率，對H2O2有很強的電催化活性，提高檢測的靈敏度。

3.7 it曲線法檢測H2O2的濃度

在0 V恒定電位下，連續(xù)加入不同濃度的H2O2，考察GCE/GRPDA/HRP/Nafion修飾電極對H2O2的電流響應(yīng)。如圖6所示，傳感器對H2O2有快速靈敏的響應(yīng)，響應(yīng)電流在5 s內(nèi)達到穩(wěn)態(tài)電流的95%。 圖6 GCE/GRPDA/HRP/Nafion修飾電極對H2O

mol/L時，加入4倍濃度的抗壞血酸，L半胱氨酸、甘氨酸、L組氨酸對實驗結(jié)果均不產(chǎn)生明顯干擾，說明此傳感器對H2O2具有良好的選擇性。

3.9 傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

采用此電極平行測定1.0 mmol/L H2O2 10次，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.8%。將修飾電極置于4 ℃的冰箱中考察其穩(wěn)定性，每隔7 d測定一次，28 d后仍保留響應(yīng)電流的70%左右，表明此電極具有較好的穩(wěn)定性。

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Preparation of H2O2 Biosensor Based on

Graphenepolydopamine Nanomaterials

ZHENG LongZhen*， LI YinDi， XIONG LeYan， LIU Wen， LIU Qiang， HAN Kui， YANG ShaoMing， XIA Jian

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（Department of Chemistry and Chemical Engineering， East China Jiao Tong University， Nanchang 330013）

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Abstract A novel graphenepolydopamine nanomaterial with biomimetic functions was synthesized. The graphenepolydopamine nanomaterial was applied in the fabrication of H2O2 biosensors by using hydroquinone as electron mediator. The modified electrode exhibited good electrocatalytical activity to H2O2. The linear range was from 5.0×10－7 to 3.3×10－4 mol/L with a detection limit of 3.7×10－7 mol/L （S/N＝3） and the linear correlation coefficient was 0.9995.

Keywords Polydopamine; Graphene; Hydroquinone; Horseradish peroxidase; Hydrogen peroxide

（Received 31 March 2011; accepted 21 June 2011）