摘 要 研究了鑭離子（La³＋）-姜黃素（CU）-十六烷基三甲基溴化銨（CTMAB）-核酸熒光增強(qiáng)體系。建立了測定核酸的新方法。體系的最優(yōu)條件為：六次甲基四胺（HMTA） -HCl緩沖溶液（pH 5.80）中，1.00×10－3 mol/L陽離子表面活性劑CTMAB存在下，姜黃素濃度為2.00×10－5 mol/L，La3＋的濃度為1.40×10－4 mol/L時(shí)，核酸能增強(qiáng)La3＋-CU絡(luò)合物的熒光強(qiáng)度，而且體系熒光的增強(qiáng)程度與核酸的加入量在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。fsDNA，ctDNA和yRNA線性范圍分別為7.00×10－4～10.00 mg/L，4.00×10－4～10.00 mg/L和7.00×10－4～10.00 mg/L；檢出限分別為0.17，0.02和0.14 g/L。與已報(bào)道的核酸的分析方法相比，本方法具有較寬的線性范圍和較高的靈敏度。研究表明，核酸對(duì)體系熒光的增強(qiáng)源于DNA主鏈上PO3－4與CU之間的靜電結(jié)合，以及通過氫鍵和疏水力進(jìn)行的溝槽式結(jié)合，為探針分子提供了疏水性的微環(huán)境，降低了體系的非輻射能量損失，使體系的熒光強(qiáng)度增加。

關(guān)鍵詞 姜黃素； 鑭； 核酸；十六烷基三甲基溴化銨； 熒光

1 引 言

核酸是重要的遺傳物質(zhì)，對(duì)其研究是生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等學(xué)科中最活躍的領(lǐng)域之一。核酸的定量測定在核酸生物化學(xué)、藥學(xué)及食品等學(xué)科中有重要意義。探針技術(shù)是研究核酸的重要手段。目前，對(duì)核酸的定量分析方法有分子光譜（吸收光譜^[1]、熒光光譜^[2～4]、化學(xué)發(fā)光^[5，6]和共振光散射^[7]等）探針、電化學(xué)探針^[8，9]等。其中研究最多、應(yīng)用最廣的是分子光譜探針，特別是熒光分析法由于其方法簡單、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)已成為研究生物大分子的重要手段。

姜黃是傳統(tǒng)常用中藥，是姜科植物姜黃的根莖，是一種酚性色素。姜黃素（Curcumin，CU）是其主要成分，也是咖喱、芥末的主要黃色色素，生活中可作為調(diào)料、食品染色劑等。它的藥理作用廣泛，主要特性為抗炎、抗氧化和抗腫瘤，是有效的抗致突變劑和抗致癌劑^[11，12]。其結(jié)構(gòu)式為： 。

采用熒光探針檢測多種核酸已有較多的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在pH＝5.80的六次甲基四胺（HMTA）-HCl溶液中，陽離子表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨（CTMAB）存在下，核酸能明顯增強(qiáng)La3＋-CU絡(luò)合物的熒光強(qiáng)度。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，其熒光增強(qiáng)程度與核酸的濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。本方法簡單易操作，靈敏度高，是一種快速檢測痕量核酸的新方法。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

F-4600熒光分光光度計(jì)（日本日立公司）；UV-2401PC型紫外可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；pHS-3C型酸度計(jì)（上海雷磁公司）。

0.1 g/L酵母核糖核酸儲(chǔ)備液（yRNA，中科院上海生物化學(xué)研究所，UV光譜測定A260/A280＝2.1）：準(zhǔn)確稱取yRNA 0.0100 g于小燒杯中，用0.05 mol/L NaCl溶解，轉(zhuǎn)至100 mL容量瓶中，用0.05 mol/L NaCl定容。使用時(shí)用水逐級(jí)稀釋。

鯡魚精子脫氧核糖核酸（fsDNA），小牛胸腺脫氧核糖核酸（ctDNA），均購自北京華美生物工程公司，濃度0.1 g/L，配制同yRNA。

1.00 mmol/L姜黃素（CU）溶液：準(zhǔn)確稱取姜黃素0.0368 g于小燒杯中，用無水乙醇溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，定容。

1.00×10－2 mol/L La3＋標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取0.1629 g La2O3（含量大于99.99%，中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司），用適量HCl （1∶1）溶解，并小心加熱至近干，再用蒸餾水稀釋，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容。使用時(shí)用水稀釋至所需濃度。以上試劑置于0～4 ℃冰箱中保存。

HMTA緩沖溶液：0.15 mol/L六次甲基四胺溶液與0.50 mol/L HCl按一定比例混合，配成不同pH值的緩沖溶液。

1.00×10－2 mol/L十六烷基三甲基溴化銨（CTMAB）：準(zhǔn)確稱取0.9113 g CTMAB于小燒杯中，用水溶解后轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中，定容。所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

于10 mL比色管中依次加入1.00 mL HMTA-HCl緩沖溶液（pH 5.80）、0.20 mL 1.00 mmol/L姜黃素溶液、適量核酸

3 結(jié)果與討論

3.1 熒光光譜

從圖1可見，姜黃素在530 nm處有微弱的熒光，La3＋和CTMAB的加入可使姜黃素的熒光增強(qiáng)，且發(fā)射波長發(fā)生藍(lán)移。而核酸能使CU-La3＋-CTMAB體系的熒光強(qiáng)度發(fā)生較大的增強(qiáng)，并且最大發(fā)射波長藍(lán)移至499 nm。此現(xiàn)象表明，CU-La3＋，CTMAB和核酸之間發(fā)生了相互作用。本實(shí)驗(yàn)選擇fsDNA為代表，激發(fā)波長為416 nm，發(fā)射波長為499 nm進(jìn)行研究。

3.2 溶液酸度與緩沖溶液的影響?yīng)?/p>

溶液pH值對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響見圖2，當(dāng)溶液pH＝5.80時(shí)，體系的熒光增強(qiáng)程度達(dá)到最大。

固定pH＝5.80，研究了不同種類的緩沖溶液HMTA-HCl， Tris-HCl，BR，Na2HPO4-檸檬酸，KH2PO4-NaOH和檸檬酸-檸檬酸鈉對(duì)體系熒光增強(qiáng)程度的影響分別為100，66.5，80.7，73.9，61.0和84.4。結(jié)果表明，HMTA-HCl緩沖的效果最好。本研究采用1.00 mL HMTA-HCl緩沖溶液。

3.3 金屬離子的選擇

研究了不同金屬離子對(duì)體系熒光增強(qiáng)程度的影響如表1所示。在本體系中分別加入各種金屬離子，發(fā)現(xiàn)La3＋，Sm3＋，Dy3＋，Y3＋和Gd3＋都能促進(jìn)體系熒光的增強(qiáng)，其中La3＋的增強(qiáng)效應(yīng)最大。因而選擇La3＋作為熒光增強(qiáng)離子。

3.4 姜黃素、表面活性劑的影響?yīng)?/p>

姜黃素的濃度對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響如圖4所示，CU的濃度在2.00×10－5 mol/L時(shí)體系的熒光增強(qiáng)程度最大。CTMAB的濃度對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響如圖5所示。當(dāng)CTMAB的濃度在1.00 mmol/L時(shí)，體系的熒光增強(qiáng)程度最大。故實(shí)驗(yàn)中選取1.00 mmol/L CTMAB作進(jìn)一步研究。

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)體系的熒光強(qiáng)度在2 h內(nèi)基本保持不變。結(jié)果表明，本體系不需要孵育，體系具有很好的穩(wěn)定性。

3.5 干擾離子的影響



在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，固定fsDNA的濃度為0.01 mg/L，對(duì)體系可能共存的陽離子、陰離子、氨基酸等多種物質(zhì)的干擾情況進(jìn)行了考察，結(jié)果如表3所示。除了BSA和L-色氨酸外，大部分的氨基酸和常見離子對(duì)體系的熒光強(qiáng)度基本無影響。

3.6 工作曲線與檢出限

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，按照操作步驟測定核酸的工作曲線和檢出限，其結(jié)果如表4所示。與其它大多數(shù)傳統(tǒng)檢測核酸的熒光法相比^[11～17]，本方法具有較高的靈敏度。

3.8 體系反應(yīng)機(jī)理探討?yīng)?/p>

3.8.1 共振光散射光譜 共振光散射是源于等波長入射光束激發(fā)散射粒子而產(chǎn)生的，其強(qiáng)度與顆粒大小成正比。體系的共振光散射光譜（RLS）如圖6所示。當(dāng)La3＋，fsDNA和CTMAB加入到CU體系時(shí)，體系的共振光散射強(qiáng)度明顯增加，并且La3＋-CU-CTMAB-fsDNA體系的共振光散射強(qiáng)度遠(yuǎn)大于其它體系的共振光散射強(qiáng)度，這表明在這4種物質(zhì)之間存在較強(qiáng)的相互作用，可通過靜電引力和疏水作用形成大的La3＋-CU-CTMAB-fsDNA絡(luò)合物。從姜黃素的分子結(jié)構(gòu)可見，其鏈中帶2個(gè)羰基，2個(gè)苯環(huán)上各含有1個(gè)甲氧基和1個(gè)羥基，屬于β-二酮類化合物，因此可與稀土金屬離子La3＋配位形成La3＋-CU配合物。由等摩爾比法測定絡(luò)合物中La3＋-CU的組成為1∶1。因此，本體系中CU與La3＋結(jié)合成了1∶1的締合物，導(dǎo)致熒光增強(qiáng)。

3.8.2 離子強(qiáng)度的影響

小分子探針與核酸的非共價(jià)結(jié)合主要包括靜電式、插入式和溝槽式3種結(jié)合方式。靜電式結(jié)合會(huì)隨著鹽濃度的增大而靜電作用被屏蔽，作用力減??；在插入式結(jié)合中，小分子插入到DNA相鄰堿基對(duì)之間；

而在溝槽式結(jié)合中，小分子探針結(jié)合在DNA雙螺旋的溝槽內(nèi)。由于堿基的屏蔽作用，插入式結(jié)合的小分子探針相對(duì)溝槽式結(jié)合來說，對(duì)環(huán)境條件的變化不敏感^[18]。本實(shí)驗(yàn)測定了溶液的鹽濃度對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響，如圖7所示。結(jié)果表明，隨著NaCl濃度的增大，體系的熒光強(qiáng)度逐漸升高；當(dāng)NaCl的濃度為0.5 mol/L時(shí)，熒光最強(qiáng)；隨后濃度增加反而下降。由于鹽濃度的變化對(duì)本體系的熒光強(qiáng)度有明顯影響，故La3＋-CU與fsDNA之間可能存在著溝槽式結(jié)合。NaCl中的Na＋能與DNA主鏈上的PO3－4通過靜電作用形成陽離子氛，從而使La3＋-CU分子遠(yuǎn)離fsDNA雙螺旋的溝槽，并導(dǎo)致體系熒光強(qiáng)度的降低。此外，鹽濃度的升高將會(huì)引起DNA結(jié)構(gòu)緊縮，使DNA雙螺旋溝槽的疏水性增加，導(dǎo)致La3＋-CU-fsDNA體系的熒光強(qiáng)度升高^[19]。從圖7可知，NaCl濃度在0.01～0.5 mol/L之間時(shí)，后者的影響大于前者，因而體系的熒光強(qiáng)度隨鹽濃度的升高而增大。而高濃度的NaCl（＞0.5 mol/L）則對(duì)La3＋CU-fsDNA體系的熒光有猝滅作用，因而體系的熒光反而降低。

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Fluorescence Enhancement of Lanthenum-Curcumin-

Cetyltrimethylammonium Bromide-Nucleic Acid

System for Determination of Nucleic Acids

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WANG Feng*1， HUANG Wei1， TANG Bo2



1（Department of Chemistry， Zaozhuang University， Zaozhuang 277160）

2（College of Chemistry， Chemical Engineering and Materials Science，

Shandong Normal University， Ji′nan 250014）



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Abstract Curcumin （CU） is an extremely rare natural diketones antioxidant used as anti-inflammatory and anticarcinogenic agents. A new fluorimetric method for the determination of nucleic acid was developed based on the enhanced fluorescence system La3＋-curcumin（CU）- cetyltrimethylammonium bromide （CTMAB）- nucleic acid. In this system， in hexamethylene-tetramine-HCl buffer （pH＝5.80）， 1.00×10－3 mol/L CTMAB， 2.00×10－5mol/L CU， 1.40×10－4 mol/L La3＋， nucleic acids can enhanced the fluorescence intensity of La3＋- CU- CTMAB and the enhanced intensities are quantitatively in proportion to the concentrations of nucleic acids in the range of 7.00×10－4－10.00 mg/L for fsDNA， 4.00×10－4－10.00 mg/L for ctDNA and 7.00×10－4－10.00 mg/L for yRNA， with corresponding detection limits （S/N＝3） of 0.17， 0.02， 0.14 g/L. A comparison between the proposed method and other analysis methods for nucleic acids was made. The results show that this method has a relatively wide linear range and high sensitivity. Study on reaction mechanism reveals that the phosphate group of nucleic acid can bind with CU through electrostatic attraction and meanwhile CU can interact with nucleic acid in the mode of groove binding. Such binding force changes the hydrophobic microenvironment of fluorescence probe， decrease the nonradioactive energy loses of the system and enhance its fluorescence intensity. 

Keywords Curcumin; Lanthanum; Nucleic acid; Cetyltrimethylammonium bromide; Fluorescence

（Received 29 June 2011; accepted 24 August 2011）