雷萬軍，楊建英，崔 磊

基于干細(xì)胞的骨組織工程研究與臨床應(yīng)用

Clinical Research and App lication on Stem Cell-based Bone Tissue Engineering

雷萬軍，楊建英，崔 磊

目的尋找滿足要求和易于操作的種子細(xì)胞。方法 參閱國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，對近年來干細(xì)胞的骨組織工程的應(yīng)用研究作一綜述。結(jié)果干細(xì)胞的研究為解決組織工程種子細(xì)胞來源問題開辟了新的途徑。結(jié)論滿足要求和易于操作的種子細(xì)胞為脂源性干細(xì)胞。

干細(xì)胞；骨組織工程；脂源性干細(xì)胞

組織工程是應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和工程學(xué)的原理和技術(shù)，構(gòu)建有生物活性的組織用于損傷組織或器官的修復(fù)。隨著組織工程研究在世界范圍內(nèi)的迅猛開展，組織工程技術(shù)構(gòu)建組織、器官方法的日趨完善。骨創(chuàng)傷修復(fù)雄厚的理論與研究基礎(chǔ)，各種生物材料在臨床治療骨缺損的廣泛應(yīng)用，為骨組織工程研究提供了雄厚的基礎(chǔ)。在此基礎(chǔ)上，骨組織工程的研究已處于組織工程化組織構(gòu)建與缺損修復(fù)的前沿，是可能率先正式進(jìn)入臨床應(yīng)用的組織工程化組織之一。

尋找滿足要求和易于操作的種子細(xì)胞是組織工程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。對于骨組織工程而言，理想的種子細(xì)胞應(yīng)具有以下幾個特點(diǎn)：取材容易，對機(jī)體的損傷小；在體外培養(yǎng)中有較強(qiáng)的傳代繁殖力且成骨細(xì)胞表型不易丟失；植入機(jī)體后能適應(yīng)受區(qū)生理、病理、應(yīng)力等環(huán)境并保持成骨活性。早期成骨細(xì)胞多從骨膜［1］中獲取，但骨膜來源的成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)易造成表型喪失，無法大量擴(kuò)增；要達(dá)到體內(nèi)構(gòu)建骨組織的細(xì)胞數(shù)，往往需要相當(dāng)面積的骨膜，對機(jī)體造成新的創(chuàng)傷，應(yīng)用受到很大限制。

干細(xì)胞的研究深入為解決組織工程種子細(xì)胞來源問題開辟了新的途徑。胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ES細(xì)胞）由于具有分化全能性與體外無限增殖的能力，將是未來組織工程種子細(xì)胞的重要來源。Buttery等［2］誘導(dǎo)ES細(xì)胞表達(dá)成骨細(xì)胞表型，獲得接近純化的成骨系ES細(xì)胞。但ES細(xì)胞很難獲得完全純化的特定細(xì)胞系，在體內(nèi)易形成畸胎瘤；而且其應(yīng)用的倫理學(xué)問題尚未得到解決，目前離實際應(yīng)用尚有距離。

成體干細(xì)胞中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow stem cells，BMSCs）具有多向分化潛能［3］，獲取時對機(jī)體損傷小，培養(yǎng)擴(kuò)增后數(shù)量充足，且自體細(xì)胞避免了免疫排斥反應(yīng)的特點(diǎn)，已經(jīng)成為骨組織工程最主要的種子細(xì)胞來源［4－5］。研究表明，BMSCs在骨髓中含量極低，成人骨髓平均104～105個有核細(xì)胞中含有1個hMSCs（相當(dāng)于每毫升全骨髓中含有200 個BMSCs）；隨著年齡的增加，細(xì)胞數(shù)量逐漸減少［6］。但是，BMSCs具有非常強(qiáng)的體外擴(kuò)增能力，我們發(fā)現(xiàn)在10%胎牛血清的單層培養(yǎng)體系中，傳至第7代時收獲的細(xì)胞數(shù)為（1～2）×109，較原始接種數(shù)目擴(kuò)增可達(dá)（4～6）×107倍。BMSCs是一種具多向分化潛能的細(xì)胞，因此如何在體外培養(yǎng)過程中使它向成骨方向轉(zhuǎn)化，并在體內(nèi)保持這種特性至關(guān)重要。流式細(xì)胞術(shù)表面標(biāo)志檢測及多向分化能力研究表明，BMSCs的干細(xì)胞特征隨著傳代的增加而減弱，干細(xì)胞表型在P5前維持穩(wěn)定，而原代開始成骨誘導(dǎo)處于第3代的BMSCs成骨活性最佳［7］。

在應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行骨組織構(gòu)建的過程中，生物材料作為細(xì)胞載體，為誘導(dǎo)分化的BMSCs提供了生長空間與骨組織形成的“模板”，因此我們研究了BMSCs在多種生物材料上的生長規(guī)律與體內(nèi)成骨能力。研究證實，成骨誘導(dǎo)的BMSCs與藻酸鈣（calcium alginate）［8］、珊瑚羥基磷灰石［9］、珊瑚［10］、脫鈣骨（dem ineralized bonematrix，DBM）［11］等生物材料均具有良好的相容性。例如，單位重量脫鈣骨上存在人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的最大黏附細(xì)胞數(shù)為3.5×107／g，黏附率可達(dá)（99.1±1）%［11］。BMSCs接種于上述生物材料并植入體內(nèi)后，均能夠形成組織工程化骨組織。

在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與生物材料的體內(nèi)外研究基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步開展了應(yīng)用BMSCs進(jìn)行骨組織構(gòu)建與骨組織缺損修復(fù)的大動物實驗研究。首先我們進(jìn)行了應(yīng)用BMSCs修復(fù)山羊非負(fù)重顱骨缺損的研究［12］，在2 cm×2 cm的顱骨標(biāo)準(zhǔn)缺損（critical size）中單純植入藻酸鈣凝膠，18周后骨缺損未得到任何修復(fù)；而在實驗組，體外成骨誘導(dǎo)的BMSCs擴(kuò)增后與藻酸鈣凝膠復(fù)合，植入顱骨缺損部位，大體、X線、3D－CT及組織學(xué)檢測均證實組織工程化骨組織形成，骨缺損得到完全修復(fù)。研究結(jié)果證實了應(yīng)用組織工程技術(shù)可以修復(fù)非負(fù)重的顱骨缺損，但是骨組織工程技術(shù)能否修復(fù)具有較高力學(xué)強(qiáng)度要求的負(fù)重骨缺損呢？下頜骨具有一定的負(fù)重能力，下頜骨缺損是顱頜面部缺損中最常見的骨缺損。本實驗室應(yīng)用BMSCs復(fù)合生物材料珊瑚羥基磷灰石，修復(fù)了犬的下頜骨3 cm的節(jié)段缺損，32周組織學(xué)顯示形成較好的骨性連接，力學(xué)強(qiáng)度則達(dá)到自體對側(cè)下頜骨的77.01%［13］。股骨是負(fù)重能力最強(qiáng)的骨組織，我們應(yīng)用自體BMSCs復(fù)合天然珊瑚，修復(fù)了2.5 cm的山羊股骨標(biāo)準(zhǔn)缺損，修復(fù)后32周X線顯示骨密度接近正常，組織學(xué)證實骨組織形成良好，基本達(dá)到正常對側(cè)的生物力學(xué)強(qiáng)度［14］。

在人體內(nèi)進(jìn)行骨組織構(gòu)建并修復(fù)骨組織缺損，是骨組織工程研究的最主要的目標(biāo)。在前述大量實驗研究的基礎(chǔ)上，我們開展了應(yīng)用病人自體BMSCs構(gòu)建組織工程化骨，臨床修復(fù)骨組織缺損的研究工作［15］。1999～2002年，共選擇顱頜面骨缺損病11例（外傷性顱骨缺損4例，先天性梨狀孔周圍骨凹陷畸形7例），將誘導(dǎo)的自體BMSCs，復(fù)合部分脫鈣骨（partly demineralized bonematrix，pDBM）體外培養(yǎng)1周后，手術(shù)回植骨缺損區(qū)?；颊呷SCT檢查結(jié)果示術(shù)后3～6個月能形成組織工程化骨，并修復(fù)骨組織缺損。術(shù)后1～2.5 a的隨訪表明組織工程骨穩(wěn)定存在，無明顯骨吸收現(xiàn)象，臨床治療效果穩(wěn)定。組織工程骨活檢標(biāo)本HE染色顯示其組織學(xué)結(jié)構(gòu)和正常松質(zhì)骨相同。研究結(jié)果證明以自體hBMSCs為種子細(xì)胞，利用組織工程技術(shù)可在人體內(nèi)形成穩(wěn)定的工程化骨組織，并臨床修復(fù)顱頜面骨組織缺損。這項研究的結(jié)果為組織工程骨的臨床大規(guī)模應(yīng)用奠定了一定的基礎(chǔ)。

成體干細(xì)胞中另一重要的種子細(xì)胞來源是脂肪干細(xì)胞（adipose derived stem cell，ADSCs）。研究表明，脂肪干細(xì)胞具有體外向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等方向分化的多向分化潛能［16］。與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比，ADSCs具有來源更加廣泛、細(xì)胞在組織中含量多、培養(yǎng)條件簡單且擴(kuò)增能力強(qiáng)等特點(diǎn)，因此ADSCs在骨組織工程中的應(yīng)用已經(jīng)得到普遍重視。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，成骨誘導(dǎo)的ADSCs與生物材料（羥基磷灰石－TCP）復(fù)合后，能夠在免疫缺陷的裸鼠皮下形成骨樣組織，提示ADSCs在骨組織工程應(yīng)用中具有較大的潛能［17］。但是，應(yīng)用ADSCs修復(fù)大動物骨組織缺損的研究目前尚未見報道。

以自體成體干細(xì)胞作為種子細(xì)胞進(jìn)行組織工程化骨組織的構(gòu)建研究，已經(jīng)取得了較大的進(jìn)展，并已在臨床應(yīng)用中得到初步證實。但是，由于自體干細(xì)胞的體外培養(yǎng)與擴(kuò)增需要較長的一段時間，往往不能滿足大多急性骨損傷的臨床實際需要，能否應(yīng)用同種異體干細(xì)胞進(jìn)行骨組織的構(gòu)建與缺損的修復(fù)，已經(jīng)成為骨組織工程研究的一個新的領(lǐng)域。免疫學(xué)研究表明，正常狀態(tài)下BMSCs不表達(dá)HLAII類抗原、B7-1、B7-2、CD40、CD40L等免疫調(diào)節(jié)分子［18］；BMSCs在體外可抑制混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，體內(nèi)系統(tǒng)性應(yīng)用BMSCs可明顯延長異體皮片移植的成活時間［19］，在造血干細(xì)胞移植時同時移植BMSCs可明顯降低移植物抗宿主反應(yīng)［20］。這些研究結(jié)果提示成體組織干細(xì)胞具有較為特殊的免疫學(xué)特性與免疫調(diào)節(jié)功能，同種異體的成體干細(xì)胞具有作為骨組織工程種子細(xì)胞來源的重要潛能。最近的研究［21］表明同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合HA／TCP能修復(fù)犬股骨2.1 mm的節(jié)段缺損，而不需要進(jìn)行免疫抑制治療。同種異體BMSCs也已在臨床中用于先天性骨發(fā)育不良的治療。而針對ADSCs的免疫學(xué)研究表明，骨髓經(jīng)放射線照射滅活的小鼠體內(nèi)輸注ADSCs后，其造血與淋巴細(xì)胞可在體內(nèi)重新生成，表明ADSCs在特定體內(nèi)環(huán)境下可促進(jìn)淋巴細(xì)胞的發(fā)生［22］。我們實驗室的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)［23］，ADSCs具有與BMSCs相近的低免疫原性，同時具有一定的調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的能力，可抑制混合淋巴細(xì)胞的體外增殖反應(yīng)。因此，在未來的骨組織工程應(yīng)用中，可通過建立成體干細(xì)胞（骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞）庫，即能更及時方便地應(yīng)用組織工程方法來修復(fù)骨缺損。

組織工程是一門多學(xué)科交叉的新興學(xué)科，各學(xué)科的研究進(jìn)展通過與組織工程的學(xué)科特點(diǎn)相互融合，為組織工程學(xué)的發(fā)展提供了不斷的動力，推動了組織工程學(xué)科的整體進(jìn)步。干細(xì)胞的研究大大拓展了組織工程種子細(xì)胞的來源，為組織工程的臨床應(yīng)用奠定了切實可行的基礎(chǔ)。骨組織工程即在干細(xì)胞研究飛速發(fā)展的背景下，在組織構(gòu)建與臨床應(yīng)用等方面取得重大突破。在骨組織工程的干細(xì)胞研究中，一方面需要建立干細(xì)胞的體外標(biāo)準(zhǔn)化培養(yǎng)與質(zhì)量控制體系，以適應(yīng)骨組織工程產(chǎn)業(yè)化的需要；另一方面，應(yīng)該結(jié)合組織工程化組織形成的生物學(xué)特點(diǎn)，深入研究干細(xì)胞在體外三維生長條件下及體內(nèi)不同微環(huán)境中，成骨能力的變化與骨組織形成的特點(diǎn)，從而為組織工程化骨組織的構(gòu)建提供更加優(yōu)良的干細(xì)胞來源與成骨環(huán)境。

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1672－688X（2012）04－0318－03

2012－07－10

河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院，河南洛陽471003

雷萬軍（1954－），男，河南鞏義人，教授，從事生物醫(yī)學(xué)工程教學(xué)及科研工作。

崔磊，男，教授，E-mail：cuileite＠yahoo.com.cn