成文玉，金紅星*

（河北工業(yè)大學 化工學院，天津 300130）

明串珠菌（Leuconostoc）是異型乳酸發(fā)酵的革蘭氏陽性細菌[1]，產(chǎn)生乳酸、乙酸、乙醇、CO2以及雙乙酰、乙偶姻和C4化合物等芳香化合物[2]。明串珠菌也是韓國泡菜（kimchi，即朝鮮民族的傳統(tǒng)食品）、德國泡菜和腌菜等發(fā)酵蔬菜中的優(yōu)勢細菌，保持這些產(chǎn)品的質量中起著重要作用[3-6]。在風味酸奶、發(fā)酵奶油、干酪、Kefir乳（牛奶乳）的生產(chǎn)中均要利用明串珠菌，因此近年來在內(nèi)地對其的研究開始活躍[7]。

在國外明串珠菌的研究熱點主要在于葡聚糖，進入21世紀以來關于明串珠菌基因的研究主要集中在韓國[8-16]。

明串珠菌在食品和醫(yī)藥工業(yè)中具有如下應用：形成干酪孔眼（提高產(chǎn)品質量）、生成風味物質（比如雙乙酰）、益生菌、生成葡聚糖（制造凝膠過濾產(chǎn)品，可以作為血液舒展劑、增稠劑和穩(wěn)定劑）、生成甘露醇（低熱量的甜味劑、理想的賦形劑等食品、醫(yī)藥、輕工和化工上的廣泛應用）、水解α-半乳糖苷（拓寬高營養(yǎng)食品的選擇范圍）、代謝產(chǎn)生細菌素（生物防腐劑）、生成低聚糖（促進腸胃中的益生菌增殖、抑制腸道中的病原菌生長繁殖、促進腸胃蠕動和改善加工食品的特性）等[7]。

在基因工程中明串珠菌可以應用于3個方面：（1）明串珠菌的有用蛋白質基因在大腸桿菌或酵母中進行表達，（2）將明串珠菌作為受體菌，其他生物的蛋白質基因在明串珠菌中進行異源表達，（3）為了獲得高產(chǎn)菌株，對明串珠菌的染色體進行改造。

1 明串珠菌基因的克隆與表達

在國外對明串珠菌基因的克隆與應用較多，涉及到多種基因，大部分以E.coli作為受體菌。HEE KYONG KANG等[17]在畢赤酵母中重組表達了腸膜明串珠菌的果聚糖蔗糖酶基因，而在E.coli中重組表達了腸膜明串珠菌的蔗糖磷酸化酶基因[18]。C?Té GL等[19-20]克隆了明串珠菌的葡聚糖蔗糖酶基因，并在E.coli中進行了表達。LEE JM等[21-22]克隆了腸膜明串珠菌的乙醇/乙醛脫氫酶和磷酸酮醇酶基因，并在E.coli中進行了表達。HAHN G等[23]克隆了甘露醇脫氫酶基因。NIKEL PI等[24]將腸膜明串珠菌的乙醇/乙醛脫氫酶基因導入到E.coli中，并通過E.coli的發(fā)酵把甘油轉化為乙醇了。HEUSER F等[25]在E.coli（同時重組表達甘露醇脫氫酶和甲酸脫氫酶）中表達假腸膜明串珠菌的果糖透性酶基因而提高了甘露醇的產(chǎn)率20%。

在內(nèi)地對明串珠菌基因的研究大部分集中在葡聚糖蔗糖酶基因的應用上。發(fā)酵生產(chǎn)葡聚糖時，菌體與產(chǎn)物分離困難、產(chǎn)物分子大小難以控制、雜質比較多，而固定化酶法生產(chǎn)葡聚糖可以克服這些不足。用腸膜明串珠菌發(fā)酵生產(chǎn)葡聚糖蔗糖酶時，酶的活性較低，使酶的分離純化帶來困難。因此，農(nóng)萬廷等[26-28]克隆了腸膜明串珠菌葡聚糖蔗糖酶基因，并在E.coli中進行了表達；邵彥春等[29]在畢赤酵母中表達了葡聚糖蔗糖酶。隋姍姍等[30]從酶活力高的腸膜明串珠菌中克隆了蔗糖磷酸化酶基因，并在E.coli中構建了原核表達系統(tǒng)，從而獲得了穩(wěn)定好的工程菌株。

一般以總DNA為模板進行PCR擴增而克隆目的基因，因此需要提取明串珠菌的總DNA。提取總DNA的方法是由乳桿菌的方法改進而來的，肽聚糖細胞壁較厚從而破細胞困難，因此溶菌酶與SDS聯(lián)合使用，有時培養(yǎng)菌體的培養(yǎng)基中加入細胞壁弱化劑甘氨酸[31]，還有蛋白難以去除，故使用蛋白酶K。

2 明串珠菌作為受體菌

在食品生物技術中明串珠菌是表達不同蛋白的很好的候選菌，因為其具有下列4個特性[32]：（1）是美國FDA認可的GRAS（generally recognized as safe，一般認為安全）；（2）不產(chǎn)生內(nèi)毒素；（3）在好氧還是厭氧條件下都生長很好；（4）能分泌特異性胞外蛋白（如葡聚糖蔗糖酶）且沒有降解蛋白活性。明串珠菌具有很好的分泌功能，是因為在基因組中存在信號肽（signal peptide）基因序列。

載體和轉化方法是明串珠菌的基因工程研究中非常關鍵的2個因子。

2.1 載體

載體為外源基因提供復制能力或整合能力。明串珠菌的基因研究中使用的載體有穿梭載體和轉座子2種。

（1）穿梭載體：明串珠菌的轉基因研究中，一般以質粒為基礎構建明串珠菌和E.coli之間穿梭的載體，屬于復制型載體。為了構建適用于明串珠菌遺傳轉化的食品級載體，JI YOON CHANG等[33-34]對明串珠菌的隱蔽質粒進行了特性研究。質粒的復制類型（復制起點，ori）主要有RCR（滾環(huán)復制）型和θ型，質粒pCC3[33]、pFMBL1[34]和pTXL1[35]屬于θ型，質粒pCB18[36]、pIH01[37]、pFR18[38]和pCI411[39]屬于RCR型。攝取過多的D-乳酸對人體健康有不利的影響，為了降低韓國泡菜中的D-乳酸含量，QIN JIN等[40]以穿梭載體pLeuCM為基礎構建成重組質粒，將L-乳酸脫氫酶基因導入到明串珠菌中使之產(chǎn)生L-乳酸，結果表明產(chǎn)生了大量的L-乳酸，但乳酸的總量沒有發(fā)生變化。

（2）轉座子：HYUN-JU EOM等[41]利用病毒的轉座子（屬于整合型載體）和轉座酶，將氯霉素抗性基因（cat，氯霉素乙酰轉移酶）隨機地整合插入到L.mesenteroidesDRC染色體DNA上，避開了重組質粒的分離不穩(wěn)定性，從而建立了遺傳上穩(wěn)定的腸膜明串珠菌。

2.2 轉化方法

將外源DNA導入到完整明串珠菌受體細胞的方法是基于物理學和生物學原理建立起來的，是細菌接合轉移和電擊轉化。

（1）細菌接合轉移：接合（Conjugation）是指通過細菌細胞之間的直接接觸導致DNA從一個細胞轉移至另一個細胞的過程。這個過程是由接合型質粒完成的，其通常具有促進供體細胞與受體細胞有效接觸的接合功能以及誘導DNA分子傳遞的轉移功能，兩者均由接合型質粒上的有關基因編碼。在DNA重組中常用的絕大多數(shù)載體質粒缺少接合功能區(qū)，因此不能直接通過細胞接合方法轉化受體細胞，然而如果在同一個細胞中存在著一個含有接合功能區(qū)域的輔助質粒，則有些克隆載體質粒便能有效地接合轉化受體細胞。因此，首先將具有接合功能的輔助質粒轉移至含有重組質粒的細胞中，然后將這種供體細胞與難以用上述轉化方法轉化的受體細胞進行混合，促使兩者發(fā)生接合作用，最終導致重組質粒進入受體細胞。

明串珠菌的轉基因研究早期利用接合質粒[42-45]進行的。TASI HJ等[44-45]利用接合質粒把產(chǎn)nisin和發(fā)酵乳糖的基因分別從乳酸鏈球菌轉移到明串珠菌中，并進行了成功表達。

（2）電擊轉化：絕大多數(shù)乳酸細菌的原生質體難以再生，因此外源DNA的轉化大都采用電擊法。把DNA引入細菌的電擊技術[46]的發(fā)展極大地便利了重組DNA分子的轉化，尤其是在乳酸細菌中如此。電擊轉化法（Electroporation）有稱電穿孔法，細胞膜的基本成分是磷脂雙分子層，高壓放電產(chǎn)生的脈沖使細胞膜產(chǎn)生可逆的“微孔”，外源DNA大分子通過這個瞬間的“通道”進入細胞。移去外加電壓后，膜孔在一定時間內(nèi)可以自動修復，這為外源基因的導入創(chuàng)造了條件。利用這一原理，將細菌細胞與外源基因組合置于電擊轉化儀的樣品小室中，然后在一定的電壓條件下進行短時間（數(shù)μs）直流電脈沖，電擊后的細胞被轉至培養(yǎng)基中培養(yǎng)，篩選并誘導細胞的分化。目前使用的電擊儀器種類雖然較多，但按輸出電脈沖的方式大致可分為2類：一類以指數(shù)波形式輸出，一類以方波形式輸出。

明串珠菌的電擊轉化一般都是基于乳桿菌和乳球菌的電轉化方法而改良的。JB LUCHANSK等[47]最早以電擊法轉化了明串珠菌。荷蘭乳品研究所的SILKE DAVID等[48]利用電擊轉化法將乳酸乳球菌的磷酸-β-半乳糖苷酶基因導入明串珠菌中，首次獲得了成功表達。電轉化的流程：過夜培養(yǎng)（穩(wěn)定生長前期）→轉接后培養(yǎng)3h～4h（對數(shù)生長前期）→洗滌細胞→用電轉緩沖液懸浮菌體→電擊轉化→加入培養(yǎng)基后于30℃孵育→涂布在平板上培養(yǎng)而篩選重組子。電擊轉化所用的溶液、離心機轉子、離心管和電擊杯都要預冷，在所有的步驟中細胞都維持冷藏溫度。電擊轉化的影響因子見表1，從表1可知，電擊緩沖液中都含有滲透穩(wěn)定劑—蔗糖，而且還含有除去細胞壁外多聚糖的MgCl2（除了金正煥和Jensen外），一般在對數(shù)生長前期收集菌體并進行濃縮。

2.3 篩選標記

無論何種類型的載體都必須帶有一個有效的篩選標記確保轉化子的檢出。明串珠菌的基因工程中已經(jīng)使用過的篩選標記有氯霉素[40-41，53，55]、紅霉素[51，53，56]和四環(huán)素[53]等抗生素抗性。如果將抗生素抗性基因投放到環(huán)境中或人和動物體內(nèi)，由于抗性因子的轉移，將帶來生物安全性的嚴重后果。為了防止使用抗生素抗性標記所引起的危害，最有效的辦法是用安全的食品級標記替代抗生素抗性標記以建立食品級選擇性標記的載體。

表1 明串珠菌電擊轉化的影響因素[47-54]Table 1.Factors affecting the electroporation of Leuconostoc species

SEON-JU JEONG等[51，55]將α-淀粉酶基因導入到檸檬明串珠菌中，重組質粒以附加體的形式存在于胞質中，并獲得了成功表達。因此，可以將α-淀粉酶基因的表達盒連接到相關的質粒上，構建出攜帶糖類利用標記的表達載體，從而開發(fā)出載體、受體及誘導物均為食品級的表達系統(tǒng)，食品級的明串珠菌工程菌可直接應用于食品工業(yè)和醫(yī)藥保健等領域，有著巨大的應用前景和潛在的商業(yè)價值。

另外、綠色熒光蛋白也可以作為篩選標記。KWANHOONLEE等[57]由p32強啟動子、假植物乳桿菌質粒pC7復制子和綠色熒光蛋白（GFP）構建了pCW5載體，并轉化明串珠菌，成功表達了綠色熒光蛋白，且由Western雜交和共聚焦顯微鏡檢查而得到證實。

3 明串珠菌染色體的改造

培養(yǎng)基含有蔗糖時明串珠菌發(fā)酵產(chǎn)生葡聚糖，從而降低韓國泡菜的品質。為了改善韓國泡菜的風味，HYUN-JU EOM等[58]構建了有效的基因敲除系統(tǒng)，并獲得了鈍化葡聚糖蔗糖酶（蔗糖-6-葡糖基轉移酶）活性的菌株。

4 基因組研究

明串珠菌屬中已經(jīng)完成全基因組測序的有9個物種、L.kimchii的2個菌株、腸膜明串珠菌的2個亞種，見表2。從表2可以看出，基因組大小大部分為2Mb左右，蛋白質基因的數(shù)量為大約2000個，具有1個或幾個rRNA操縱子。測序工作大部分由韓國人完成的，因為明串珠菌是韓國泡菜的發(fā)酵中起重要作用的乳酸細菌，所以國家非常重視。

5 展望

（1）如今很多基因的功能注釋是通過生物信息學軟件的比對結果而產(chǎn)生的。明串珠菌屬的每個物種中還有不少基因的功能未知，有待于由實驗手段來完成，比如采用基因敲除方法、細菌雙雜交系統(tǒng)。通過基因敲除使某基因失活而產(chǎn)生突變菌株，并與野生菌株的性狀相比較，從而揭示基因的作用。但經(jīng)內(nèi)源性同源重組而產(chǎn)生基因敲除的幾率偏低，因此工作量很大。由于外源性同源重組而基因被敲除的概率較高，有利于研究進程的加速，但必須構建相關的系統(tǒng)才能進行基因操作。

表2 明串珠菌屬中已完成全基因組測序的物種[8-16,59]Table 2.Completed genomes of Leuconostoc species

（2）將明串珠菌作為受體菌進行了一些轉基因方面的探索，但不像E.coli、乳桿菌和乳球菌等細菌那樣，受體-載體系統(tǒng)還很不完善，還處于研究的起步階段，有待于深入研究。構建以非抗生素抗性為標記和選擇壓力的“可食性”明串珠菌表達系統(tǒng)就顯得十分必要。

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