陳余朋，王行富，王 密，王鵬程

福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科(福建 福州 350005)

10%中性緩沖福爾馬林溶液(pH值7.2～7.4)是臨床診斷及實(shí)驗(yàn)病理學(xué)中最常用的固定劑，具有較強(qiáng)的組織穿透能力，組織收縮小，固定均勻、穩(wěn)定，能使組織硬化，保證HE制片的高質(zhì)量；能更好的保持組織的抗原性[1,2]，有利于免疫組織化學(xué)標(biāo)記物的檢測(cè)。研究[3]表明用10%中性緩沖性福爾馬林固定劑的石蠟組織提取的DNA在質(zhì)量上明顯優(yōu)于普通的非緩沖型福爾馬林固定劑。ASCO /CAP HER-2檢測(cè)指南和我國(guó)2009年HER2基因檢測(cè)指南指出，組織處理的標(biāo)準(zhǔn)化固定劑為10%中性緩沖福爾馬林, 以獲得最佳的原位免疫熒光檢測(cè)[4,5]。目前很多醫(yī)院尤其基層單位在10%中性緩沖福爾馬林配制上并不規(guī)范，主要有以下問題應(yīng)引起同行重視。

試劑稱重的準(zhǔn)確性按照臨床病理技術(shù)操作規(guī)范[1]，10%中性福爾馬林固定液的配制方法(1000 ml)：甲醛(40%)100 ml，無水磷酸氫二鈉6.5 g，磷酸二氫鈉4 g，蒸餾水900 ml。該配制方法并不能直接準(zhǔn)確地配制10%的中性緩沖福爾馬林，因?yàn)槠渲辛姿岫溻c并沒注明是無水還是含一水化合物(NaH2PO4·H2O)或二水化合物(NaH2PO4·2H2O)，使用不同磷酸二氫鈉的量將直接影響最終的pH值。按照《組織學(xué)技術(shù)的理論與實(shí)踐》介紹的10%中性福爾馬林的配制方法[2]:福爾馬林(37%-40%的甲醛溶液) 100 ml，Na2HPO46·5 g，NaH2PO4·H2O 4 g，蒸餾水900 ml,pH值應(yīng)為7.2-7.4, 該配方明確磷酸二氫鈉是一水化合物，只要這樣準(zhǔn)確稱量，準(zhǔn)確配制，pH值即為7.2～7.4。用于配制10%中性緩沖福爾馬林的最常用的Na2HPO4有兩種形式即無水Na2HPO4和Na2HPO4·12H2O；最常用NaH2PO4也有兩種形式即NaH2PO4·H2O和NaH2PO4·2H2O。在選擇試劑的時(shí)候應(yīng)該注意所購(gòu)買的試劑Na2HPO4和NaH2PO4是否含有或含有幾個(gè)水分子化合物，應(yīng)根據(jù)M=m/n進(jìn)行換算，準(zhǔn)確稱量，嚴(yán)格配制并監(jiān)測(cè)緩沖液的pH值，避免發(fā)生不必要的錯(cuò)誤。當(dāng)選擇Na2HPO4·12H2O和NaH2PO4·2H2O時(shí)，根據(jù)M=m/n，換算Na2HPO4·12H2O和NaH2PO4·2H2O量分別為16.38 g和4.52 g，準(zhǔn)確稱量，準(zhǔn)確配制，pH值應(yīng)為7.2～7.4。

試劑的保存Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·H2O、NaH2PO4·2H2O等，其水化含量在自然狀態(tài)下并非一成不變，如果試劑密封不好，可能在干燥空氣中風(fēng)化，失去結(jié)晶水，例如Na2HPO4·12H2O在空氣中風(fēng)化后，極易失去五分子結(jié)晶水而形成七水化合物Na2HPO4·7H2O，分子量發(fā)生變化，影響試劑的準(zhǔn)確稱量。無水磷酸氫二鈉略有吸濕性，在濕空氣中易水化結(jié)塊。因此試劑要求密封保存。

pH值檢測(cè)準(zhǔn)確測(cè)pH值一般選用pH計(jì)進(jìn)行，pH計(jì)可以精確到0.1～0.01。pH試紙只能精確到1～0.1。造成這種差異的原因是，pH計(jì)測(cè)量pH是靠感應(yīng)器感應(yīng)、滲透壓或別的參數(shù)測(cè)量，因此科學(xué)精確；pH試紙靠特殊顏色反應(yīng)，不僅人眼對(duì)色覺的鑒定會(huì)造成誤差，另外，比色卡的印刷也會(huì)造成一定誤差，都會(huì)導(dǎo)致判讀不夠精準(zhǔn)。在質(zhì)控檢查的時(shí)候，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)用pH值試紙檢測(cè)的10%中性緩沖福爾馬林實(shí)際偏酸性。

質(zhì)量控制對(duì)所配制的10%中性緩沖福爾馬林，要制定嚴(yán)格的質(zhì)量控制制度，定期測(cè)量pH值。中性緩沖福爾馬林的試劑要徹底溶解，并且攪拌均勻，配好的中性緩沖福爾馬林溶液要用密閉的塑料桶存放，以防福爾馬林揮發(fā)。日常配制中性混合磷酸鹽緩沖液時(shí)，其pH值往往因化學(xué)試劑質(zhì)量、技術(shù)質(zhì)量等因素稍有誤差，可酌加少量1M Na2HPO4或1M NaH2PO4溶液校正后使用[6]。

試劑質(zhì)量 建議購(gòu)買分析純(AR)試劑，分析純主成分含量很高、純度較高，干擾雜質(zhì)很低，適用于工業(yè)分析及化學(xué)實(shí)驗(yàn)。試劑要符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，選擇外包裝完好無損，試劑瓶口密封，生產(chǎn)日期越新越好，在有效日期范圍內(nèi)，選擇質(zhì)量可靠的廠家。當(dāng)選擇有破損、不夠密封、過期的含水化合物試劑，可能會(huì)出現(xiàn)含水化合物試劑在空氣中風(fēng)化，失去結(jié)晶水；有吸濕性的試劑在濕空氣中易水化結(jié)塊，從而影響試劑的質(zhì)量和配制稱量的準(zhǔn)確性。

配制人員職業(yè)責(zé)任感目前基層病理工作存在一些問題，病理工作單調(diào)，不受重視，導(dǎo)致少數(shù)人員工作積極性不高，責(zé)任感不強(qiáng)等，從而影響試劑的配制質(zhì)量。每個(gè)科室或研究單位應(yīng)該形成質(zhì)量檢測(cè)和質(zhì)量控制制度，由專人配制，專人管理，對(duì)每批次的試劑配制做好記錄，并實(shí)行每天監(jiān)測(cè)pH值。質(zhì)控小組隨機(jī)抽查，對(duì)于不合格的試劑誤差不大時(shí)，進(jìn)行必要調(diào)整，明顯誤差者直接按照廢液處理，確保配制試劑的質(zhì)量。

10%中性緩沖福爾馬林配制的好壞直接影響組織的固定，組織固定的好壞直接影響制片質(zhì)量、HE染色效果、特殊染色、免疫組化染色以及分子生物學(xué)方面的檢測(cè)。因此正確配制10%中性緩沖福爾馬林至關(guān)重要，同時(shí)作為一個(gè)合格的病理技術(shù)人員，除了要有過硬的專業(yè)技術(shù)，還要有高度的職業(yè)責(zé)任感，認(rèn)真對(duì)待、科學(xué)處理組織固定的每一步驟，為病理診斷、免疫組化及分子生物學(xué)的檢測(cè)打好堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

[1] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)編著.臨床技術(shù)操作規(guī)范 病理學(xué)分冊(cè)[M].北京：人民軍醫(yī)出版社，2004：28.

[2] John D.Bancroft,Mariln Ganmble主編，周小鴿，劉勇主譯.組織學(xué)技術(shù)的理論和實(shí)踐[M].北京：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2010：45-57.

[3] Zsikla M，Baumann G.Effect of buffered formalin on amplification of DNA from paraffin wax embedded small biopsies using real-time PCR[J].Journal of clinical pathlogy,2004,57:654-656.

[4] Wolff AC,Hammond ME,Schwartz JN,et al.American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendation for human epidermal growth factor 2 testing in breast cancer[J].Arch pathol Lab Med,2007,131(1):18-43.

[5] 《乳腺癌HER-2檢測(cè)指南》編寫組.乳腺癌HER-2檢測(cè)指南(2009版)[J].中華病理學(xué)雜志，2009，38(12)：836-840.

[6] 趙寶忠，孫智才，劉增輝，等.對(duì)福爾馬林固定劑相關(guān)理論的再認(rèn)識(shí)[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2007，25(3)：337-338.