曹慧穎，邵 鵬（綜述），石金升（審校）

（河北省滄州市和平醫(yī)院內三科，河北滄州 061001）

·綜 述·

骨髓間充質干細胞治療肝纖維化研究進展

曹慧穎，邵 鵬（綜述），石金升（審校）

（河北省滄州市和平醫(yī)院內三科，河北滄州 061001）

間質干細胞；肝硬化；綜述文獻

肝纖維化、肝硬化是多種慢性肝臟疾病的終末期病理表現(xiàn)，目前傳統(tǒng)的治療手段難以從根本上修復肝臟的不可逆變化，肝臟原位移植是治療各種終末期肝病的有效方法，但是由于供體來源不足、操作復雜、移植后免疫排斥、治療費用昂貴等問題，限制了臨床肝移植的發(fā)展。隨著細胞移植技術的成熟，肝細胞移植有望從根本上治療肝臟疾病。干細胞方面的研究為解決肝細胞來源問題帶來了希望［1］。間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一類具有自我增殖和分化潛能的多能干細胞，由于骨髓來源的間充質干細胞易于取材，未涉及倫理，而被廣泛應用于實驗研究。現(xiàn)將骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）治療肝纖維化的實驗進展及機制研究作一綜述。

1 BMSCs治療肝纖維化的可行性

BMSCs是具有高度自我更新能力和多向分化潛能的成體干細胞。中胚層的BMSCs可以跨越胚層向內胚層及外胚層的組織、細胞分化。比如分化為肝細胞、膽管上皮細胞、內皮細胞、骨骼肌細胞、心肌細胞、神經(jīng)元細胞、視網(wǎng)膜細胞等。研究者［2］稱之為“可塑性”或“橫向分化”。BMSCs在特定條件下橫向分化為肝細胞的研究為其移植治療肝纖維化提供了理論依據(jù)。

吳玉卓等［3］取肝硬化患者骨髓，體外加入細胞因子（肝細胞生長因子、表皮生長因子單獨或聯(lián)合）誘導BMSCs向肝樣細胞分化，結果顯示誘導組細胞可在2l～28d時，變?yōu)槿切?、多角型或類圓形。誘導組細胞7d檢測到甲胎蛋白的表達，2 l、28d檢測出細胞角蛋白18陽性，并以時間依賴方式產(chǎn)生白蛋白。趙文靜等［4］在體外分離獲得純度較高的人BMSCs，在體外用酒精性肝硬化患者血清誘導，結果示人BMSCs表達甲胎蛋白及白蛋白，且向肝細胞樣細胞分化。總之，骨髓中確實存在能分化為肝細胞的干細胞，直接將其移植到肝臟，在肝臟微環(huán)境調節(jié)下可分化為肝細胞；將BMSCs作為肝細胞移植的細胞來源有重要的臨床意義。

2 BMSCs治療肝纖維化的機制

對于治療肝纖維化來說，最有效的方法莫過于去除病因治療（清除乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒，減少乙醇攝入，控制脂肪攝入等）。在細胞移植治療方面，一些體內、外的研究［5］均提示BMSCs可以有效地減輕肝纖維化的病變，其治療的機制主要集中于下列幾個方面。

2.1 BMSCs促進肝細胞再生：肝硬化的形成過程中是以假小葉形成為主要的病理特點，纖維膠原的沉積會導致大量正常的肝細胞變性甚至死亡。即使肝臟是再生能力很強的器官，但經(jīng)過慢性病因的長期損傷后，最終的趨勢還是會導致肝細胞死亡，肝功能受損。BMSCs在移植后可分化成肝細胞樣細胞，促進內源性肝細胞的再生，有效補充肝細胞的數(shù)量，從而有效地改善肝功能。在BMSCs植入由四氯化碳誘導的纖維化病肝后，BMSCs不但可以在病變肝臟內定植，有效減輕肝纖維化的病變，而且可以有效地促進內源性肝細胞再生［6］。安德偉等［7］利用體外誘導（利用肝細胞生長因子）的BMSCs定向分化為肝細胞，在移植入纖維化病肝后出現(xiàn)更多表達白蛋白的細胞，說明BMSCs在肝纖維化的環(huán)境下可以有效地誘導肝細胞再生。Aziz等［8］通過將BMSCs由尾靜脈注入肝纖維化模型鼠內亦可發(fā)現(xiàn)BMSCs具有向肝細胞方向的轉化及減輕肝纖維化的功能。2.2 BMSCs分泌細胞因子/生長因子而抑制炎癥反應：BMSCs分泌多種細胞因子和生長因子，如肝細胞生長因子、干細胞因子、基質源因子1α、轉化生長因子-β、腫瘤壞死因子-α等。其中肝細胞生長因子不但具有誘導BMSCs自身向肝細胞分化的功能，還抑制轉化生長因子-β1產(chǎn)生，阻止肝臟纖維化，抗肝細胞凋亡，從而提高存活率。白細胞介素-10能破壞腫瘤壞死因子的纖維化信號傳導通路，減少纖維化，轉化生長因子-β卻促進肝星形細胞的纖維化反應，是肝纖維化最主要的致病因子，可以激活轉錄因子核因子-κB，引起一系列靶基因的激活。而Di Nicola等［9］用骨髓細胞與異體樹突狀細胞或外周血淋巴細胞共同培養(yǎng)，結果表達的轉化生長因子-β1和肝細胞生長因子顯著抑制CD4+和CD8+細胞的增殖活性［（65±5）%、（75±15）%］，表明BMSCs具有很強的抑制免疫排斥和炎癥反應作用。

2.3 BMSCs抑制肝星形細胞活化、阻止細胞外基質的生成：肝星形細胞是正常肝和纖維化時合成細胞外基質的主要細胞。肝星形細胞的過度激活導致肝纖維化的發(fā)生。研究［10］發(fā)現(xiàn)，肝星形細胞與BMSCs體外共培養(yǎng)后，肝星形細胞增殖活性明顯受抑制，說明BMSCs具有分泌細胞因子抑制肝星形細胞增殖活性的潛能，這在治療肝纖維化中發(fā)揮作用。Kim等［11］認為其機制是BMSCs可能通過肝細胞生長因子阻斷細胞外信號調節(jié)激酶的磷酸化作用，抑制α-平滑肌蛋白陽性細胞的增殖，使門脈區(qū)成纖維細胞的生長抑制、凋亡增加，從而緩解肝纖維化進展。

2.4 MSCs激活卵圓細胞，促進肝細胞再生：卵圓細胞被認為是肝細胞的前體細胞。轉化生長因子-β/腫瘤壞死因子-α無論體內外都阻止肝細胞增殖，而對于卵圓細胞增殖影響不大?？赡苻D化生長因子-β/腫瘤壞死因子-α作用于兩種細胞的信號轉導機制不同?；|源因子1α可以激活卵圓細胞，在肝細胞再生過程中發(fā)揮作用。因而BMSCs在分泌上述細胞因子時起到激活卵圓細胞、促進肝細胞再生的作用。

2.5 MSCs降解肝內過量的膠原：有研究［12］將MSCs與肝纖維化的病理模型一起共培養(yǎng)，結果顯示MSCs可以有效地減少膠原的沉積及降解已沉積的膠原，從而明顯減輕肝纖維化的病變程度。

3 基礎研究

基礎研究通過不同方法構建肝硬化動物模型，將各種類型的干細胞通過不同途徑應用于動物模型，觀察移植細胞的轉歸、肝臟組織學改變、各種蛋白表達及血清因子水平的變化，來評價細胞移植的安全性及有效性，并初步闡明了細胞移植治療肝硬化的可能機制。

段峰等［13］應用介入技術將兔BMSCs超選擇性移植入肝硬化兔門靜脈分支內，移植后3周，熒光免疫組織化學顯示移植的BMSCs可以在病理性肝臟組織內存活；血清丙氨酸氨基轉移酶下降，與移植前相比差異有統(tǒng)計學意義。Chang等［14］將人BMSCs通過門靜脈輸入肝硬化模型鼠體內，移植后1d發(fā)現(xiàn)綠色熒光蛋白標記的移植細胞遷移到肝小葉周邊及血管周圍，生化及組織病理學顯示肝損傷明顯減輕，且移植的細胞表達基質金屬蛋白酶，肝纖維化亦明顯改善。劉彥等［15］將BMSCs誘導分化的肝樣細胞移植到同種大鼠已纖維化的肝臟，結果顯示肝樣移植細胞逐漸從血管進入肝臟實質，最終散布于肝細胞間，移植后第2周，肝組織中的假小葉逐漸吸收或消散，纖維化程度明顯輕于模型對照組，膠原染色變淺。移植后第4周肝細胞排列接近正常，偶見點狀壞死，無纖維間隔。

4 臨床應用

在國內外大量動物實驗結果的理論支持下，干細胞治療肝硬化的臨床應用逐步開展，并已取得可喜成果，為眾多肝硬化患者帶來新希望。

Zhong等［16］發(fā)現(xiàn)感染的肝硬化患者與健康供者BMSCs相比，增殖能力差，生長因子受體的表達水平及分泌生長因子的能力降低，初步認為患者自身BMSCs不適合用于疾病的治療。郭曉鐘等［17］體外分離純化BMSCs，通過肝動脈置管移植入肝臟，在移植后2、4、8周復查肝臟功能，觀察實驗室指標改善，Child-Turcotte-Pugh分數(shù)變化及不良反應情況。結果移植后第4周，患者血漿白蛋白由（32.91±5.58）g/L升至（38.32±6.45）g/L，丙氨酸氨基轉移酶由術前（96.92±83.91）U/L降至（73.48±18.46）U/L（P＜0.01）。凝血酶原時間從移植前的（16.66±3.91）s逐漸下降至移植后的（15.52±3.35）s，纖維蛋白原從（2.22±0.88）g/L逐漸升高至（2.58±0.88）g/L。移植術后患者臨床癥狀明顯改善，其中食欲改善、體力好轉72例（92.3%），腹水減少或消失及下肢浮腫減輕70例（89.7%），腹脹減輕68例（87.2%）。陳薇等［18］對11例失代償期肝硬化患者經(jīng)肝動脈行外周血干細胞移植治療，移植后2、4、8、12周，總膽紅素逐漸下降有9例（81.82%），白蛋白逐漸升高8例（72.73%），凝血酶原活動度逐漸升高10例（90.91%）；移植后12周內，腹水減輕7例（63.64%），食欲改善8例（72.73%），體力好轉7例（63.64%），腹脹減輕7例（63.64%）。除1例出現(xiàn)輕微骨痛以外，未發(fā)現(xiàn)其他明顯不良反應及并發(fā)癥。王迪等［19］經(jīng)肝動脈移植自體BMSCs治療肝硬化失代償期患者40例，移植后第2、4、8周復查肝功能，觀察實驗室指標，臨床癥狀及不良反應情況。結果顯示移植后第4周，血漿白蛋白明顯升高，丙氨酸氨基轉移酶和天門冬氨酸氨基轉移酶與移植前相比顯著下降；干細胞移植后4周，凝血機制明顯改善，凝血酶原時間逐漸下降，纖維蛋白原逐漸升高；患者生存質量顯著提高：食欲改善、體力好轉37例（92.5%），腹脹減輕33例（82.5%），腹水減少、下肢水腫減輕35例（87.5%）。全部患者術中未發(fā)生嚴重并發(fā)癥，術后近期無不良反應出現(xiàn)。Pai等［20］對9例酒精性肝硬化患者用粒細胞集落刺激因子進行外周血干細胞動員后，采集干細胞，對CD34+細胞進行體外擴增后經(jīng)肝動脈回輸給患者，結果顯示細胞擴增后可達2.3×108個，所有患者均耐受，未出現(xiàn)治療相關不良反應，移植后4、8、12周時，血清膽紅素水平均顯著下降，1周后丙氨酸氨基轉移酶及天門冬氨酸氨基轉移酶亦顯著改善；9例患者中Child-Pugh評分改善7例，腹水減輕5例。此實驗結果促進臨床研究的進一步發(fā)展。Kharaziha等［21］將自體（3～5）×107個BMSCs通過門靜脈或外周輸注給8例不同原因導致的肝硬化患者，結果顯示所有患者均耐受，肝功能明顯改善：終末期肝病評分和凝血酶原復合物比率顯著下降，血清肌酸酐和膽紅素下降，白蛋白升高，未發(fā)現(xiàn)不良反應。

但亦有研究并不支持BMSCs對肝纖維化的治療作用。Dalakas等［22］將BMSCs應用于酒精性肝損傷的患者，結果顯示移植后患者肝組織中和血液中CD34+細胞數(shù)［（1.834±0.605）%和（0.195%± 0.063）%］較對照組［（0.299±0.208）%和（0.067%±0.010）%］顯著增加（P＜0.05）。認為這些數(shù)量增多的CD34+可能是肝損傷后造成的內源性干細胞釋放入外周血和肝臟中，這些細胞促進了成纖維細胞的生成，但并未發(fā)現(xiàn)與移植相關的肝細胞再生與修復。

5 問題及展望

細胞治療作為生物治療主要手段之一，正逐漸為更多的患者所接受。我院與中國軍事醫(yī)學科學院協(xié)作開展的肝硬化之干細胞治療項目，應用自體BMSCs轉染肝細胞生長因子基因，通過靜脈或肝動脈介入的方式回輸給肝硬化患者，亦已取得初步成功。雖然干細胞治療肝硬化是一種新生療法，還需長期和大量臨床數(shù)據(jù)來證實其有效性、安全性及其治療機制。但鑒于目前肝硬化有效手段缺乏的情況下，權衡利弊，選擇干細胞治療亦是對生命的挑戰(zhàn)，期望更多患者能早日從中受益，最大程度地擺脫疾苦。

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（本文編輯：趙麗潔）

R575.2

A

1007-3205（2012）02-0240-04

2011-03-21；

2011-06-23

曹慧穎（1975-），女，河北滄州人，河北省滄州市和平醫(yī)院主治醫(yī)師，從事內科疾病診治研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.02.052