周軍波 許麗敏 楊 曦 徐衛(wèi)峰 陳治奎 姜慶軍 胡萬英 廉姜芳 葛世俊 周建慶

已有大量證據表明血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體(lectin－like oxidized low－density lipoprotein receptor－1，LOX－1)與血管炎癥、動脈粥樣硬化斑塊形成、進展和不穩(wěn)定有關。國內外的多個研究均證實，LOX－1可以被氧化低密度脂蛋白(oxidized lowdensity lipoprotein，oxLDL)、血管緊張素Ⅱ等多種介質所誘導，并且在糖尿病、高血壓、血脂紊亂等疾病狀態(tài)中表達增加。國外已有多個對LOX－1基因多態(tài)性與冠心病發(fā)病風險的研究，但由于種族、病例數等的差別，得到的結果有較大差異，特別是針對國內人群所開展的相關研究，目前還較少，因此開展這方面的深入研究很有必要。本研究旨在研究LOX－1基因外顯子4 G501C單核苷酸多態(tài)性與冠心病發(fā)病的相關性，初步探討遺傳因素對冠心病的影響。

材料與方法

1.對象:選擇2008年5月～2010年4月于寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院心內科住院的患者。其中CAD患者159例為CAD組(男性116例，女性43例，平均年齡64.0±10.1歲)，所有病例均經冠狀動脈造影證實至少一支冠狀動脈狹窄≥50%。選擇經冠狀動脈造影排除冠心病者106例為對照組(男性49例，女性57例，平均年齡≥59.0±10.0歲)。以上受檢者均為浙東地區(qū)漢族人，排除先天性心臟病、心肌病和嚴重肝、腎疾病。

2.方法:(1)提取基因組DNA:取得患者知情同意后，于冠脈造影時抽取動脈血10m l，EDTA抗凝。常規(guī)苯酚－氯仿法抽提白細胞基因組DNA，TE溶解。紫外分光光度儀(Amersham，美國熱電)測定DNA純度與濃度后，－20℃保存。(2) PCR擴增:采用4管 SYBR－PCR結合融解曲線方法，對G501C進行等位基因型的檢測，具體引物序列及樣品設置參見文獻［1］。根據人Lox－l基因(GenBank:DQ314885)序列，利用Primer 5.0對引物進行驗證。引物序列由大連寶生物工程技術服務公司合成。每個樣品設立4個定量PCR檢測管，分別加入不同的上下游引物用于檢測健康和突變的等位基因，同時設立陽性和陰性對照。PCR反應體系為:mix 9ml(已加入SYBR GREEN染料)，上下游引物各0.4μl，DNA模板1μl，加雙蒸水至總體積20μl(熒光定量PCR試劑盒購自天根生化科技有限公司)。在iCycler iQ PCR擴增儀(BIO－RAD，美國)進行PCR擴增。兩個位點PCR反應條件均為:95℃預變性1min，然后按94℃ 30s、58℃ 30s、72℃ 40s進行40個循環(huán)，終末延伸72℃ 5min。擴增循環(huán)結束后，對PCR產物以0.5℃/s做55℃到95℃的融解曲線分析。根據定量PCR儀的分析軟件獲得的Ct值和融解曲線分析結果來判定樣品的SNP類型。反應結束后，取PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析儀(BIO－RAD Quantity one，美國)驗證PCR擴增產物的單一性。(3)樣本測序:隨機選取50例樣本，提供引物及PCR產物，由南京金斯瑞生物科技有限公司測序，以驗證熒光定量PCR檢測結果。G501C位點測序引物為上游: 5'－CACAAACATAACTGACTGATGAG－3'，下游:5'－TAGAGATACTACAGAGCCTGTCC－3'，PCR產物:356bp。

3.統(tǒng)計學方法:數據用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件進行分析，P值用CLUMP22軟件計算。各組基因型及等位基因頻率用χ2檢驗，利用擬合優(yōu)度χ2檢驗的方法檢驗基因頻率是否符合Hardy Weinberg遺傳平衡定律。計量資料組間均數比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1.對兩組冠心病危險因素進行比較:結果顯示，吸煙史和高血壓史在冠心病組顯著高于對照組(P＜0.01)，而糖尿病史和冠心病家族史兩組之間的差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)(表1)。

2.每個樣品進行4個平行的定量PCR反應:分別獲得陽性、陰性對照及兩種等位基因擴增產物的Ct值和融解曲線分析結果。圖1A顯示，檢測突變型和陽性對照的PCR產物的Ct值一致，而檢測野生型和陰性對照的PCR產物的Ct值接近，融解曲線分析結果一致，DNA測序結果顯示該樣品DNA等位基因是501CC。圖1B顯示檢測野生型、突變型和陽性對照的PCR產物的Ct值一致，融解曲線分析結果一致，DNA測序結果顯示該樣品DNA等位基因是501GC。圖1C顯示，檢測野生型和陽性對照的PCR產物的Ct值接近，大約是23.7;而檢測突變型和陰性對照的PCR產物的Ct值接近，大約是28.2。融解曲線分析結果與Ct值一致。DNA測序結果顯示該樣品等位基因是501GG。定量PCR的基因分型結果與DNA測序結果均相符。

3.研究對象的G501C位點的基因型分布:經擬合優(yōu)度χ2檢驗符合Hardy－Weinberg平衡，表明患者來自同一群體。

4.G501C基因多態(tài)性在CAD組及對照組中均存在G/G、G/C、C/C 3種基因型:其中G/G、G/C、C/C 3種基因型在CAD組與對照組分別占62.3%、35.8%、 1.9%和64.2%、33.0%、2.8%，進行χ2檢驗。CAD組 與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)(表2)。

圖1 SYBR－GREEN熒光定量PCR對LOX－1外顯子4501G＞C的基因分型及對應的DNA測序熒光定量PCR結果和DNA測序結果相對應，A、B、C圖依次對應的是CC、GC、GG型

表2 CAD組與對照組G501C基因多態(tài)性基因型及等位基因頻率分布

討論

人LOX－1由273個氨基酸組成，包括胞質內N端，跨膜區(qū)，胞外的頸區(qū)和C型血凝素樣結構域。多個證據支持LOX－1對動脈粥樣硬化形成起作用。Aoyama等研究了人的LOX－1基因(oxidized lowdensity lipoprotein receptor 1，OLR－1)，發(fā)現它是一個單拷貝基因，位于12號染色體短臂的p12.3～p13.2區(qū)域，由6個外顯子和5個內含子組成，共7000個堿基對。外顯子4 G501C的基因變化導致了K167N的錯義突變。167位氨基酸殘基位于LOX－1胞外的C－血凝素樣區(qū)域，已經有實驗表明血凝素樣區(qū)域對配體的識別和結合很重要［2］。Ohmori等人檢測了586名進行冠脈造影的患者G501C的基因多態(tài)性發(fā)現，病例組CC+CG基因型頻率明顯低于正常/輕微狹窄組(36%vs 49%，P＜0.01)。按照冠心病嚴重程度分級，CC+CG基因型頻率分別為:正常/輕微狹窄(狹窄＜25%)組49%，輕度狹窄(狹窄26%～50%之間)組41%，狹窄＞50%的3個亞組中單支病變組39%，2支病變組35%，3支病變組32%，多因素分析顯示CC+CG基因型頻率與狹窄嚴重度呈負相關(OR=0.61;95%CI:0.41～0.92)［3］。但在本研究中，G501C基因位點基因型頻率和等位基因頻率在冠心病組和對照組之間差異均無統(tǒng)計學意義，這與Elisabetta Trabetti、Sentinelli等人的研究結果相符［4，5］。不同的研究得出的結果不同，可能與種族差異、病例數不同有關。

CAD的發(fā)病存在著遺傳異質性并且受環(huán)境因素的影響，不同的基因突變均可能導致CAD，但不同的基因突變引起的臨床表型可能不同，如性別差異、CAD中存在的某些特殊的病理或生物學特征即中間表型(這些中間表型能反映其發(fā)展早期或中期病理變化的一系列生化或生理性狀)、發(fā)病年齡和疾病的嚴重程度等，從而可導致易感基因研究結果的不一致。在多基因疾病中，僅僅一個易感基因并不意味著高風險。事實上，大多數的攜帶者雖然存在著某些生物學缺陷即中間表型，但并不表現任何的臨床癥狀。

經過搜索PUBMED，EMbase，SpringLink等數據庫，以及參考一些研究的文獻，將一些研究成果與本研究的結果進行比較，表3列舉了G501C基因多態(tài)性與CAD相關性的部分研究。從2003年至今選取了10份病例－對照組的研究與本研究的結果進行分析比較，總共分析了5679個病例和15511個對照的情況。

表3和表4分別呈現了顯性模式和隱性模式下G501C基因多態(tài)性和CAD的關聯性。在顯性模式下，7個研究(1，3，6，8～11)顯示突變降低了CAD的風險，3個已有研究(4，7，9)和本研究顯示突變能增加CAD的風險。在隱性模式下，7個已有研究(3，4，6，8～10)和本研究顯示突變降低了CAD的風險，而3個研究(1，7，11)顯示突變能增加CAD的風險。經過薈萃分析，不管是在顯性模式還是隱性模式中，G501C與CAD都沒有顯著的關聯性。

表3 在薈萃分析(顯性模式)中G501C和CAD的關系

表4 在薈萃分析(隱性模式)中G501C和CAD的關系

可以發(fā)現，不同時期和不同國家的研究結果差異很大，這可能跟病例數較少以及種族之間的差異有很大的關聯性，因此開展這方面的深入研究非常必要。本研究的總病例數僅265例，如能開展更大規(guī)模的研究，應可以得到更加準確的結果?？傊?，本研究顯示LOX－1基因G501C位點的基因多態(tài)性與冠心病發(fā)病無顯著關聯。

1 單志新，符永恒，周志凌，等.Lox－1基因501G＞C和3'UTR188C＞T多態(tài)性與急性心肌梗死發(fā)病的相關性［J］.熱帶醫(yī)學雜志，2007，7(11):1048－1051

2 Chen M，Narumiya S，Masaki T，et al.Conserved C－terminal residues within the lectin－like domain of LOX－1 are essential for oxidized low－density－lipoprotein binding［J］.Biochem J，2001，355: 289－296

3 Ohmori R，Momiyama Y，Nagano M，et al.An oxidized lowdensity lipoprotein receptor gene variant is inversely associated with the severity of coronary artery disease［J］.Clin Cardiol，2004，27:641－644

4 Elisabetta T，Michele B，Ugo C，et al.On the association of the oxidised LDL receptor 1(OLR1)gene in patients with acute myocardial infarction or coronary artery disease［J］.European Journal of Human Genetics，2006，14:127－130

5 Sentinelli F，Filippi E，Fallarino M，et al.The 3'UTR C＞T polymorphism of the oxidized LDL－receptor1(OLR1)gene does notassociate with coronary artery disease in Italian CAD patientsorwith the severity of coronary disease［J］.Nutr Metab Cardiovasc Dis，2006，16:345－352

6 Mango R，Clementi F，Borgiani P.Association of single nucleotide polymorphisms in the oxidised LDL receptor 1(OLR1)gene in patients with acute myocardial infarction［J］.JMed Genet，2003，40: 933－936

7 TatsuguchiM，Furutani M，Hinagata J，et al.Oxidized LDL receptor gene(OLR1)is associated with the risk ofmyocardial infarction［J］.Biochem Biophys Res Commun，2003，303:247－250

8 Morgan TM，Krumholz HM，Lifton RP，et al.Nonvalidation of reported genetic risk factors for acute coronary syndrome in a largescale replication study［J］.JAMA，2007，297:1551－1561

9 Knowles JW，Assimes TL，Boerwinkle E，et al.Failure to replicate an association of SNPs in the oxidized LDL receptor gene(OLR1)with CAD［J］.BMCMed Genet，2008，9:23

10 Kurnaz O，Aydogan HY，Isbir CS，et al.Is LOX－1.K167N polymorphism protective for coronary artery disease?［J］.In Vivo，2009，23: 969－973

11 Predazzi IM，Martinez－Labarga C，Vecchione L，et al.Population differences in allele frequencies at the OLR1 locus may suggest geographic disparities in cardiovascular risk events［J］.Ann Hum Biol，2010，37:136－148