周堯東 高國(guó)生 翁彭劍 徐煒峰

GP73是Kladney等［1］在研究成人巨細(xì)胞性肝炎病原學(xué)時(shí)首次被發(fā)現(xiàn)的一種相對(duì)分子質(zhì)量為73kDa的跨膜糖蛋白，又稱為Ⅱ型高爾基體膜蛋白(Golgi phosphoprotein 2，Golph2)和高爾基體膜蛋白Ⅰ(Golgimembrane proteinⅠ，GolmⅠ)。近年來國(guó)內(nèi)外均有文獻(xiàn)報(bào)道GP73很可能成為診斷肝癌的重要標(biāo)志物，但GP73在以乙型肝炎為基礎(chǔ)的HCC患者中的表達(dá)研究少有報(bào)道［2～4］。本研究通過檢測(cè)血清GP73在不同類型HBV感染者中的表達(dá)情況，試圖探明血清GP73在乙型肝炎病毒感染者中的臨床意義?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

對(duì)象與方法

1.對(duì)象:所有病例均為筆者醫(yī)院2010年1～10月的住院患者。男性92例，女性20例，患者年齡50.48±13.78歲。其中慢性乙型肝炎患者29例，男性24例，女性5例，患者年齡37.17±12.68歲;乙肝肝硬化患者28例，男性19例，女性9例，患者年齡56.46±11.14歲;HCC患者55例，男性49例，女性6例，患者年齡54.45±10.73歲。所有患者HBSAg均為陽性，診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)制定的《慢性乙型肝炎防治指南》及第4屆全國(guó)肝癌學(xué)術(shù)大會(huì)討論通過的原發(fā)性肝癌診斷標(biāo)準(zhǔn)，且半年內(nèi)未使用免疫調(diào)節(jié)劑和抗病毒治療［5，6］。另選擇健康獻(xiàn)血員22名作為正常對(duì)照組，男性14例，女性8例，年齡46.59±15.61歲。

2.標(biāo)本采集:受檢者均采集清晨空腹靜脈血3ml，分離后的血清于－20℃冰箱保存待測(cè)，所有標(biāo)本無溶血現(xiàn)象。

3.檢測(cè)方法:GP73測(cè)定采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(定量)檢測(cè)，試劑盒由北京熱景生物技術(shù)有限公司提供;AFP檢測(cè)采用美國(guó)雅培AXSYM免疫化學(xué)發(fā)光儀;肝功能、血常規(guī)、凝血酶原時(shí)間指標(biāo)均采用標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)。透明質(zhì)酸、層黏蛋白、Ⅲ型前膠原、Ⅳ型膠原采用上海海軍醫(yī)學(xué)研究所放射免疫分析試劑盒檢測(cè)。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS 16.0軟件。計(jì)量資料如為正態(tài)性分布采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示，否則采用中位數(shù)(四分位數(shù))表示。正態(tài)分布且方差齊的多組均數(shù)比較采用方差分析和LSD－t檢驗(yàn);非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)換(取平方根)后行方差分析和LSD－t檢驗(yàn)。兩組均數(shù)間比較如為正態(tài)性分布采用t檢驗(yàn)，否則將數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)換(取平方根)后行t檢驗(yàn)。ROC曲線分析參照文獻(xiàn)［7］。雙變量間相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.不同病情患者血清GP73檢測(cè)結(jié)果比較:疾病組(包括慢乙肝、肝硬化、HCC)血清GP73含量均顯著高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均 ＜0.05);慢乙肝組和肝硬化組之間血清GP73含量差異不大(P＞0.05)。HCC組血清GP73含量均顯著高于其他組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜O.05)。按照正常人對(duì)照組單側(cè)95%(x±1.645s)制定參考范圍，超出該范圍為陽性，統(tǒng)計(jì)各組 GP73陽性率。GP73在HCC時(shí)陽性率最高，其次是肝硬化、慢乙肝。各疾病組總體陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=68.57，P＜0.01)，但通過多個(gè)樣本率比較的χ2分割法計(jì)算，疾病組陽性率均顯著高于正常對(duì)照組，但HCC、LC、慢乙肝組之間陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用ROC曲線進(jìn)一步分析GP73對(duì)HCC的診斷價(jià)值，其ROC曲線下面積AUC達(dá)到0.865，95%置信區(qū)間為0.801～0.929，其檢測(cè)HCC的最佳cut－off值為145ng/ ml，此時(shí)敏感性和特異性分別為70.91%和92.41% (表1、圖1)。

表1 各組血清GP73檢測(cè)結(jié)果比較

圖1 GP73鑒別診斷HCC的ROC曲線分析

2.HBV感染者血清GP73與其他血清檢測(cè)指標(biāo)的相關(guān)性分析:對(duì)HBV感染者血清GP73及其他血清檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行Spearman秩相關(guān)分析，結(jié)果表明血清GP73與ALP、GGT、CHE、AFP、LAP、AFU、ADA、RBC、HGB均有一定的相關(guān)性(P均＜0.05)，特別是與ALP、AFP、LAP的相關(guān)性較高(r均＞0.300，P均＜0.01)(表2)。

3.HCC患者臨床及病理因素與血清GP73濃度的關(guān)系:對(duì)55例HCC患者血清GP73濃度，按HBV－DNA載量(＜1000與≥1000copy/ml)、腫瘤直徑大小(＜5cm與≥5cm)、占位結(jié)節(jié)數(shù)(1個(gè)與2個(gè)及以上)等情況進(jìn)行比較。結(jié)果顯示雖然血清GP73濃度在病毒載量高組、肝癌直徑大組及占位結(jié)節(jié)數(shù)多組均高于對(duì)應(yīng)組，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05) (表3)。

表2 HBV感染者血清GP73與其他血清檢測(cè)指標(biāo)的相關(guān)性分析

表3 HCC患者臨床及病理因素與血清GP73濃度的關(guān)系

討論

2002年，Kladney等應(yīng)用Western blotting技術(shù)發(fā)現(xiàn)肝炎、肝硬化患者肝組織中GP73表達(dá)高于正常肝臟70倍以上;同時(shí)發(fā)現(xiàn)用HBV轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞形成的HepG2.2.15強(qiáng)烈表達(dá)GP73蛋白，提示HBV感染與GP73蛋白表達(dá)之間存在某種關(guān)聯(lián)。至2005年，Schwegler等應(yīng)用糖蛋白組學(xué)手段發(fā)現(xiàn)了GP73與原發(fā)性肝癌之間的密切相關(guān)性，原發(fā)性肝癌患者血清中GP73蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)。

本研究結(jié)果表明，疾病組(包括慢乙肝、肝硬化、HCC)血清GP73含量均顯著高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05);HCC組血清GP73含量均顯著高于其他組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均 ＜0.05)。這提示感染HBV的患者血清GP73表達(dá)水平普遍上調(diào)，發(fā)展為HCC后血清GP73水平顯著升高，這與Kladney和Block的觀點(diǎn)較為一致。而且血清GP73陽性率有隨疾病進(jìn)展而逐漸升高的趨勢(shì)(HCC陽性率＞肝硬化陽性率＞慢乙肝陽性率)，雖然差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05)，但這可能與樣本量較小有關(guān)，血清GP73是否與HBV感染者疾病進(jìn)展密切相關(guān)有待進(jìn)一步驗(yàn)證。通過ROC曲線分析GP73對(duì)HCC的診斷價(jià)值，其ROC曲線下面積AUC達(dá)到0.865，這說明血清GP73蛋白對(duì)HCC的診斷價(jià)值較高。

為揭示GP73含量的升高與其他肝功能指標(biāo)的關(guān)系，我們對(duì)血清GP73與其他血清檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行了Spearman秩相關(guān)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清GP73與多項(xiàng)指標(biāo)相關(guān)，特別是與ALP、AFP、LAP的相關(guān)性較高(r均＞0.300，P均＜0.01)。ALP、AFP、LAP與HCC的相關(guān)性已早有共識(shí)，這從側(cè)面進(jìn)一步證明了GP73對(duì)HCC診斷的重要性。

為此，我們進(jìn)一步分析了55例HCC患者臨床及病理因素與血清GP73濃度的關(guān)系，研究結(jié)果表明GP73濃度不受HBV－DNA載量、HCC的病理因素(大小、結(jié)節(jié)數(shù))、介入治療(1周內(nèi))的影響，這與梁冠林等［8］觀點(diǎn)并不完全一致。但值得注意的是，血清GP73濃度在病毒載量高組、肝癌直徑大組及占位結(jié)節(jié)數(shù)多組均高于對(duì)應(yīng)組，其差異雖未表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.05＜P＜0.20)，但這可能是樣本量不夠大引起的，更確切的結(jié)論需要大樣本量、多中心的研究來證實(shí)。

總之，HBV感染者血清GP73普遍升高，特別是HCC時(shí)升高顯著，可作為一項(xiàng)較好的診斷HCC的血清標(biāo)志物，但在臨床中的實(shí)際應(yīng)用還需要大宗的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)其進(jìn)行支持。

1 Kladney RD，Bulla GA，Guo L，et al.GP73，a novel Golgi－localized protein upregulated by viral infection［J］.Gene，2000，249(1－2):53－65

2 Marrem JA，Romano PR，Nikoheva O，et al.GP73，a resident Golgi glycoprotein，is a novel serum marker for hepatocellular carcinoma［J］.JHepatol.2005，43(6):1007－1012

3 Giannelli G，Antonaci S.New frontiers in biomarkers for hepatocellular carcinoma［J］.Dig Liver Dis，2006，38(11):854－859

4 毛一雷，楊華瑜，徐海峰，等.新的肝癌血清標(biāo)記物GP73在肝癌診斷中的初步研究［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2008，88(14):948－951

5 中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)、感染病學(xué)分會(huì).慢性乙型肝炎防治指南［J］.中華肝臟病雜志，2005，13(12):881－891

6 中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)肝癌專業(yè)委員會(huì).原發(fā)性肝癌診斷標(biāo)準(zhǔn)［J］.中華肝臟病雜志，2000，8(3):135

7 趙發(fā)林，候艷，李康.臨床試驗(yàn)評(píng)價(jià)的ROC分析方法［J］.中國(guó)衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)，2007，24(4):349－351

8 梁冠林，廖志學(xué)，冉順，等.血清GP73在肝臟腫瘤中的表達(dá)及意義［J］.中華普通外科雜志，2010，25(4):339－340