王素琴 湯玲君 王 艷

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)又稱糖尿病腎小球硬化癥，是糖尿病(diabetesmellitus，DM)最常見且最嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥之一，是糖尿病致死、致殘的主要原因［1］。其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，尚未完全闡明，目前認(rèn)為主要與機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)、AGES通路、PKC通路、氨基己糖通路、PAPP通路、多元醇通路等有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，蘆丁可通過抑制AGEs形成、改善鏈脲霉素誘導(dǎo)糖尿病大鼠氧化應(yīng)激狀態(tài)、改善血糖平衡、部分翻轉(zhuǎn)損壞心肌功能從而發(fā)揮治療糖尿病的作用［2～6］。本實(shí)驗(yàn)選擇卡托普利(CAP)為陽(yáng)性對(duì)照藥，通過觀察蘆丁對(duì)早期DN大鼠24h尿白蛋白、尿素氮、肌酐和腎臟組織形態(tài)學(xué)的影響，以考察蘆丁對(duì)早期DN大鼠的治療作用，并初步探討蘆丁防治DN的可能機(jī)制。

材料與方法

1.材料:(1)動(dòng)物:健康雄性SD大鼠，SPF級(jí)，體重200± 10g，由江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［SYXK(蘇)2011－0024］，實(shí)驗(yàn)前測(cè)大鼠血糖均正常。(2)藥品及試劑:蘆丁(rutin，實(shí)驗(yàn)室自制，純度≥98%)、卡托普利(哈藥集團(tuán)三精北方制藥廠，批號(hào):20110203)、鏈脲霉素(streptozotocin，STZ，深圳晶美公司進(jìn)口分裝)、血糖測(cè)試盒(四川邁克科技股份有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號(hào):1105061)、考馬斯亮藍(lán)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào):20100907)。(3)儀器:752紫外可見分光光度計(jì)(蘇州江東精密儀器有限公司);OneTouch UltraⅡ穩(wěn)豪型血糖儀(美國(guó)強(qiáng)生公司);Olympus－2000全自動(dòng)生化分析儀(日本Olympus);Olympus－DP70圖像采集系統(tǒng)(日本Olympus)。

2.方法:(1)糖尿病腎病大鼠模型的建立:參考文獻(xiàn)［1］中方法，雄性大鼠80只，隨機(jī)取10只作為正常組，其余大鼠禁食24h后，腹腔一次性注射 STZ 60mg/kg(臨用前溶于0.1mmol/L檸檬酸鈉緩沖液，pH4.4)，正常對(duì)照組給予等量0.1mmol/L檸檬酸鈉緩沖液。72h后尾靜脈取血，測(cè)定空腹血糖≥13.88mmol/L者為造模成功。(2)分組及給藥:取造模成功的SD大鼠隨機(jī)分為5組:DN模型組(DN)、蘆丁低劑量治療組(RL，10mg/kg)、蘆丁中劑量治療組(RM，30mg/kg)、蘆丁高劑量治療組(RH，90mg/kg)、卡托普利對(duì)照組(CAP，10mg/ kg)，每組10只。各組成模當(dāng)日作為實(shí)驗(yàn)第1天，均以1%羧甲基纖維素配成不同濃度的混懸液灌胃給藥，每天1次，正常組、DN模型組均給予同體積的1%羧甲基纖維素。(3)24h尿白蛋白測(cè)定:第12周末將各組大鼠分別放入金屬代謝籠，準(zhǔn)確收集24h尿液，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定其24h尿白蛋白量。(4)血糖、尿素氮和肌酐測(cè)定:各組大鼠稱重、麻醉，腹主動(dòng)脈收集血液標(biāo)本，1500r/min離心15min，分離血漿，采用葡萄糖氧化酶法，以752紫外可見分光光度計(jì)讀數(shù)測(cè)量血糖，Olympus－2000全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定尿素氮和肌酐。(5)腎臟指數(shù)測(cè)定:各組大鼠處死后，迅速分離兩側(cè)腎臟，生理鹽水沖洗后稱重。腎臟指數(shù)=1000×腎重/體重。(6)腎組織病理觀察:取腎臟組織，4%甲醛溶液固定，常規(guī)水洗、乙醇脫水、石蠟包埋、切片(5μm厚度)，HE染色(石蠟切片脫蠟、進(jìn)水;蘇木素染色20min;充分水洗;0.5%伊紅染液2～3min;稍快蒸餾水洗;脫水、透明，中性樹膠封片)，光鏡下觀察腎臟組織的病理學(xué)變化。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:數(shù)據(jù)處理采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示，組間比較采用方差分析和t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為有顯著性差異。

結(jié)果

1.蘆丁對(duì)DN大鼠血糖、尿白蛋白、腎臟指數(shù)、尿素氮和肌酐的影響:DN組大鼠的空腹血糖、24h尿白蛋白總量、腎臟指數(shù)、尿素氮和肌酐與正常對(duì)照組相比明顯升高，且皆有顯著性差異(P＜0.01)，表明造模成功。CAP組的上述各項(xiàng)指標(biāo)較DN對(duì)照組明顯降低，有顯著性差異(P＜0.05，或P＜0.01)。Rutin低劑量治療組與DN組相比空腹血糖、24h尿白蛋白總量、腎臟指數(shù)、BUN和Cr有差異(P＜0.05)。Rutin中高劑量治療組的空腹血糖、24h尿白蛋白總量、腎臟指數(shù)、BUN和Cr較DN組有顯著性降低(P＜0.01)，提示中高劑量Rutin對(duì)DN大鼠的空腹血糖、24h尿白蛋白總量、腎臟指數(shù)、尿素氮和肌酐皆有降低作用，而且Rutin對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)的降低作用皆呈劑量依賴性關(guān)系(表1)。

表1 蘆丁對(duì)DN大鼠血糖的影響(±s，n=10)

表1 蘆丁對(duì)DN大鼠血糖的影響(±s，n=10)

與DN組比較，*P＜0.05，有顯著性差異，＊＊P＜0.01，有極顯著性差異

分組 血糖(mmol/L) 尿白蛋白(mg) 腎臟指數(shù) 尿素氮(mmol/L) 肌酐(μmol/L).90 67.44±9.21 NS 6.16±2.16＊＊ 8.42±2.23＊＊ 7.88±0.70＊＊ 7.53±1.27＊＊ 37.17±5.71＊＊CAP 15.79±1.70* 22.05±4.60＊＊ 11.34±1.32＊＊ 17.44±3.48＊＊ 44.63±4.50＊＊RL 17.66±2.94* 34.27±6.16* 13.73±1.30* 22.72±2.56* 58.50±4.81* RM 13.92±2.64＊＊ 32.80±3.26＊＊ 12.84±1.10＊＊ 18.78±1.97＊＊ 50.13±7.12＊＊RH 14.11±1.71＊＊ 26.04±5.09＊＊ 11.57±1.32＊＊ 16.74±1.79＊＊ 46.14±6.52 DN 25.80±5.54 51.01±8.73 15.18±3.72 26.69±5＊＊

2.蘆丁對(duì)DN大鼠光鏡下腎臟組織形態(tài)學(xué)的影響:正常組:腎皮、髓質(zhì)分界清晰，腎小球結(jié)構(gòu)正常，系膜細(xì)胞、系膜基質(zhì)未見增生，毛細(xì)血管無擠壓現(xiàn)象。模型組:腎皮、髓質(zhì)分界不甚清晰，腎小球彌漫性增大，腎小球毛細(xì)血管充血，腎小囊變窄，腎小球毛細(xì)血管基膜增厚，系膜增寬，系膜細(xì)胞增生，足細(xì)胞明顯腫脹，部分腎小管出現(xiàn)上皮細(xì)胞水腫，管腔變窄，腎間質(zhì)輕度增生，部分出現(xiàn)水腫，偶見間質(zhì)纖維化，未見明顯的腎小球硬化。CAP組:腎皮、髓質(zhì)分界清晰，腎小球結(jié)構(gòu)多正常，部分腎小球輕度增大、毛細(xì)血管稍充血，腎小囊未見明顯變窄，病變腎小球毛細(xì)血管基膜輕度增厚，系膜稍有增寬，系膜細(xì)胞和足細(xì)胞無明顯增生，腎小管偶見上皮細(xì)胞水腫，未見腎間質(zhì)增生、炎癥反應(yīng)和纖維化。蘆丁大劑量組:腎皮、髓質(zhì)分界較為清晰，腎小球局灶狀增生、腎小球毛細(xì)血管輕度充血、腎小球毛細(xì)血管基膜增厚、系膜增寬、系膜細(xì)胞增生、足細(xì)胞無明顯腫脹，部分腎小管出現(xiàn)上皮細(xì)胞水腫，管腔變窄，未見腎間質(zhì)增生、炎癥反應(yīng)和纖維化。蘆丁中劑量組:腎皮、髓質(zhì)分界清晰，腎小球結(jié)構(gòu)多正常，部分腎小球輕度增大，毛細(xì)血管稍充血，腎小囊未見明顯變窄，病變腎小球毛細(xì)血管基膜輕度增厚，系膜稍有增寬，系膜細(xì)胞和足細(xì)胞無明顯增生，腎小管偶見上皮細(xì)胞水腫，未見腎間質(zhì)增生、炎癥反應(yīng)和纖維化。蘆丁小劑量組:腎皮、髓質(zhì)分界較為清晰，腎小球局灶狀增生，腎小球毛細(xì)血管輕度充血、腎小球毛細(xì)血管基膜增厚、系膜增寬、系膜細(xì)胞增生、足細(xì)胞無明顯腫脹，部分腎小管出現(xiàn)上皮細(xì)胞水腫，管腔變窄，未見腎間質(zhì)增生、炎癥反應(yīng)和纖維化(圖1)。

4.蘆丁糖尿病腎病大鼠保護(hù)作用的可能機(jī)制: DN的發(fā)生和發(fā)展，高血糖是其始動(dòng)因素，因而調(diào)節(jié)糖代謝紊亂對(duì)于防治DN至關(guān)重要，脂代謝紊亂亦是其發(fā)生中一項(xiàng)獨(dú)立的損傷因素［7］。糖代謝障礙必定伴隨脂質(zhì)代謝紊亂，脂質(zhì)代謝紊亂也影響糖代謝過程，兩者常常互為因果。血脂成分的變化可能通過改變腎小球基膜的磷脂成分或通過糖基化影響基膜，增加腎小球基膜的通透性，引起白蛋白的排出。另一方面血脂可使腎小球壓力升高，并影響血液流變學(xué)指標(biāo)，改變血管阻力，使腎小球呈高濾狀態(tài)，致白蛋白的排出增多［8］。此外DN患者腎小球?yàn)V過膜上帶負(fù)電荷的硫酸乙酰肝素合成減少，致使腎小球?yàn)V過膜電荷選擇性屏障受損及濾過膜孔徑增大，構(gòu)成形成蛋白尿的病理基礎(chǔ)，隨著病程延長(zhǎng)，尿白蛋白增加。尿白蛋白排泄的多少在一定程度上反映了腎小球?yàn)V過屏障對(duì)血漿蛋白通透能力的高低。蘆丁能抑制 Fenton (芬頓)反應(yīng)和脂質(zhì)過氧化的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，具有明顯的抗脂質(zhì)過氧化作用，可降低體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂的現(xiàn)象，使尿白蛋白降低，防治糖尿病腎病［9］。

圖1 大鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)的電鏡圖片(×400)

腎臟肥大與腎小球?yàn)V過率(GFR)、腎臟血流量(RPF)的升高有密切關(guān)系，腎臟肥大意味著腎小管腫大以及腎臟承受著豐富的血流量［10，11］。腎小球高濾過、腎臟肥大和基膜增厚是早期糖尿病腎病的特點(diǎn)，進(jìn)一步發(fā)展則細(xì)胞外基質(zhì)積聚、腎小球硬化和小管間質(zhì)纖維化，最終致終末期腎功能衰竭。與正常組比較，模型組腎臟肥大指數(shù)明顯升高;與模型組比較，各治療組腎臟肥大指數(shù)均明顯降低。造模各組大鼠腎臟肥大指數(shù)的增加，說明DN腎損傷腎臟肥大的存在。各治療組能在一定程度上抑制DN大鼠腎臟肥大，對(duì)大鼠腎臟的肉眼觀察也證實(shí)了這一點(diǎn)。蘆丁因具有改善微循環(huán)的作用，從而對(duì)DN腎臟肥大有逆轉(zhuǎn)和恢復(fù)的作用，這在DN防治中具有十分重要的意義。

Mogesen建議將DN分為5期［11］。Ⅰ期腎小球?yàn)V過率(GFR)增高和腎體積增大，腎血流量(RPF)和腎小球毛細(xì)血管灌注及內(nèi)壓增高，此期無明顯組織病理學(xué)損害;Ⅱ期腎小球結(jié)構(gòu)出現(xiàn)改變，基膜增厚和系膜基質(zhì)增多，但尿白蛋白排泄率(UAER)正常，運(yùn)動(dòng)后可出現(xiàn)間歇性蛋白尿;Ⅲ期出現(xiàn)持續(xù)微量白蛋白尿，GFR逐漸下降至正常或接近正常，但基膜增厚和系膜基質(zhì)增加更加明顯，可有小球結(jié)節(jié)型和彌漫型病變以及小動(dòng)脈玻璃樣變，開始出現(xiàn)小球荒廢;Ⅳ期出現(xiàn)大量白蛋白尿，GFR開始下降，基膜增厚和系膜基質(zhì)增加較前更加明顯，荒廢小球約占1/3，臨床出現(xiàn)進(jìn)行性增加的非選擇性蛋白尿，可伴雙下肢水腫和高血壓，腎功能逐漸減退;Ⅴ期為尿毒癥期，多數(shù)腎單位閉鎖，血尿素氮、肌酐升高，血壓升高。肌酐是肌酸的代謝產(chǎn)物，它在體內(nèi)的生成量是相對(duì)恒定的，且絕大部分由腎小球?yàn)V過排出體外。尿素氮是體內(nèi)蛋白質(zhì)的代謝產(chǎn)物，主要由腎臟排泄。當(dāng)腎小球?yàn)V過功能受損時(shí)，血中尿素氮和肌酐含量必將上升。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與正常組比較，模型組大鼠尿素氮和肌酐水平明顯升高，說明通過腹腔注射STZ，可造成大鼠腎功能顯著下降。與模型組比較，各治療組尿素氮和肌酐水平明顯下降，說明蘆丁可使尿素氮和肌酐的生化指標(biāo)降低，從而保護(hù)受損的腎功能，延緩DN的進(jìn)程。

病理結(jié)果顯示模型組腎皮、髓質(zhì)分界不甚清晰，腎小球彌漫性增大，腎小球毛細(xì)血管充血，腎小囊變窄，腎小球毛細(xì)血管基膜增厚，系膜增寬，系膜細(xì)胞增生，足細(xì)胞明顯腫脹，部分腎小管出現(xiàn)上皮細(xì)胞水腫，管腔變窄，腎間質(zhì)輕度增生，部分出現(xiàn)水腫，提示模型出現(xiàn)DN早期病變。蘆丁對(duì)上述病理改變具有明顯改善作用，提示蘆丁對(duì)DN大鼠模型具有保護(hù)作用。其保護(hù)作用可能與降低DN大鼠模型血糖、減少尿微量白蛋白、降低血尿素氮、肌酐等方面有關(guān)。

結(jié)論

在本實(shí)驗(yàn)中，高劑量(90mg/kg)的蘆丁能有效抑制腎臟肥大，改善腎小球組織形態(tài)，對(duì)DN大鼠的血糖、尿白蛋白、尿素氮和肌酐有非常顯著的降低作用，提示蘆丁可以明顯改善DN大鼠的高血糖以及腎臟病變。因此，蘆丁可以減緩DN的進(jìn)程，改善DN的生理、生化指標(biāo)，對(duì)糖尿病腎病大鼠具有保護(hù)作用。綜上所述，蘆丁在DN大鼠的防治方面有著較好的應(yīng)用和開發(fā)前景。

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