葉曉華 陳壇辀 杜 勇 黃智銘 吳金明 吳建勝

重癥急性胰腺炎(severeacutepancreatitis，SAP)是腹部外科常見(jiàn)病之一，常可并發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)和多器官功能衰竭(MOF)，病死率極高［1］。近年來(lái)學(xué)者研究認(rèn)為急性胰腺炎的發(fā)生與胰腺微循環(huán)障礙有密切關(guān)系，它參與了向重癥急性胰腺炎演進(jìn)的復(fù)雜病理生理過(guò)程［2］。fgl2凝血酶原酶又稱(chēng)纖維介素，可直接活化凝血酶原成為凝血酶原酶，從而迅速啟動(dòng)凝血過(guò)程，并參與多種疾病的凝血局部反應(yīng)［3～5］。本實(shí)驗(yàn)旨在牛璜膽酸鈉誘導(dǎo)大鼠重癥急性胰腺炎模型中，觀察fgl2凝血酶原酶在SAP大鼠胰腺中的表達(dá)，探討其在SAP胰腺微血管病變中的作用及機(jī)制，為研究微循環(huán)障礙在重癥急性胰腺炎中的作用及導(dǎo)致胰腺功能障礙和組織損傷的病理機(jī)制提供新的思路。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料:(1)動(dòng)物:健康SD雄性大鼠，質(zhì)量200～250g，由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。(2)主要試劑與儀器:?；悄懰徕c購(gòu)自Sigma公司;Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司;FirststrandcDNAsynthesiskit購(gòu)自MBI公司;PCRmix試劑盒購(gòu)自上海達(dá)為科生物公司;兔抗大鼠fgl2凝血酶原酶多克隆抗體購(gòu)自北京博奧森公司;EnVision試劑購(gòu)自Dako公司;實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀及7500SequenceDetectionSystem為ABI公司產(chǎn)品;顯微鏡為Olympus公司產(chǎn)品;全自動(dòng)生化分析儀為Hitachi公司產(chǎn)品。

2.實(shí)驗(yàn)方法:(1)模型制備及分組:實(shí)驗(yàn)前禁食過(guò)夜，自由飲水。將48只大鼠隨機(jī)分成兩組:假手術(shù)組(SO)、重癥急性胰腺炎(SAP)組，每組各24只。SAP組大鼠采用4%的?；悄懰徕c1ml/kg胰膽管逆行穿刺勻速注射制模。SO組僅翻動(dòng)

胰腺幾次即關(guān)腹。術(shù)后1、4、8h分批處死大鼠(各時(shí)點(diǎn)8只)，留取下腔靜脈血、胰腺標(biāo)本待測(cè)。(2)血清淀粉酶檢測(cè):采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。(3)胰腺組織病理形態(tài)學(xué)觀察:胰腺組織常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，行HE染色及Masson染色。鏡下觀察胰腺病理改變。隨機(jī)觀察100根管壁外徑≤100μm的微血管，并計(jì)算陽(yáng)性血管率。(4)實(shí)時(shí)定量(real－time) PCR檢測(cè)胰腺組織中fgl2表達(dá):采用Trizol法提取總RNA，取4μg總RNA反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，引物由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計(jì)。引物序列:fgl2上游引物:5'－CCTGGAGATTGTGGTTTCGT－3'，下游引物:5'－TACCATGCCTTTCTCCAAGG－3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)153bp;β－actin上游引物: 5'－TGTCACCAACTGGGACGATA－3'，下游引物:5'－GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA－3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)153bp。反應(yīng)條件: 50℃2min;95℃5min，95℃ 15s，循環(huán)40次。反應(yīng)完成后，根據(jù)反應(yīng)曲線計(jì)算thresholdcycle(Ct值)并計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量，目的基因量 =2－△△Ct，△△Ct=(Ct目的基因－Ct管家基因)實(shí)驗(yàn)組－(Ct目的基因－Ct管家基因)對(duì)照組。(5)免疫組化染色:使用Envison法進(jìn)行fgl2免疫組化染色。按Envision試劑盒說(shuō)明操作。兔抗大鼠fgl2凝血酶原酶多克隆抗體(1∶100)為一抗。EnVision試劑(HRP－R/M)37℃孵育30min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。鹽酸乙醇分化，氨水反藍(lán)，最后脫水、透明、封片，鏡檢。PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。各切片在200倍光鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野采用Image－ProPlus6.0圖像分析軟件測(cè)定其平均吸光度值并進(jìn)行半定量分析。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS15.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性分析，采用單因素方差分析進(jìn)行組間、組內(nèi)差異性檢驗(yàn)。兩連續(xù)變量關(guān)聯(lián)強(qiáng)度使用Pearson相關(guān)系數(shù)(r)表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.血清淀粉酶檢測(cè)結(jié)果:SAP組血清淀粉酶較SO組在各時(shí)間點(diǎn)均顯著升高(各時(shí)點(diǎn)P＜0.01)。SO組各時(shí)點(diǎn)間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，表1)。

表1 各組大鼠術(shù)后各時(shí)點(diǎn)血清淀粉酶值(U/L)

2.形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果:鏡下，SO組1、4、8h各時(shí)點(diǎn)胰腺組織形態(tài)未見(jiàn)異常，胰腺小葉清晰;SAP組1h時(shí)胰腺間質(zhì)水腫，伴少量炎細(xì)胞浸潤(rùn);4h后胰腺間質(zhì)水腫，出血，炎細(xì)胞浸潤(rùn)顯著增加;8h時(shí)嚴(yán)重出血壞死，見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1)。

圖1 各組大鼠術(shù)后HE染色(×200)

Masson染色用于觀察微血栓形成，光鏡下顯示為高亮紅色區(qū)。Masson染色顯示血栓于胰腺微血管內(nèi)皮，說(shuō)明是由纖維蛋白形成的原位血栓。Masson染色陽(yáng)性血管率在SAP組中的各時(shí)點(diǎn)顯著高于正常組(P＜0.01)且具有增加的趨勢(shì)(P＜0.01，表2、圖2)。

表2 各組大鼠術(shù)后各時(shí)點(diǎn)胰腺陽(yáng)性血管率

圖2 各組大鼠術(shù)后Masson染色(×200)

3.fgl2mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá):SAP組大鼠胰腺的fgl2mRNA和胰腺fgl2蛋白質(zhì)表達(dá)相比SO組均明顯升高，且隨病程延長(zhǎng)逐漸增多(表3)。免疫組化染色顯示，fgl2主要表達(dá)在SAP組大鼠胰腺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(圖3)。

表3 各組大鼠術(shù)后各時(shí)點(diǎn)胰腺fgl2mRNA和蛋白表達(dá)量

圖3 各組大鼠術(shù)后各時(shí)點(diǎn)fgl2免疫組化染色(×200)

4.胰腺fgl2表達(dá)與陽(yáng)性血管率相關(guān)性分析:將SAP組大鼠胰腺組織fgl2凝血酶原酶表達(dá)水平與每100根微血管中陽(yáng)性血管率進(jìn)行Pearson相關(guān)分析。結(jié)果顯示SAP組大鼠胰腺內(nèi)fgl2凝血酶原酶表達(dá)的平均吸光度值與陽(yáng)性血管率存在顯著相關(guān)(r= 0.878，P＜0.01)。

討論

急性胰腺炎可引起一系列免疫反應(yīng)，影響病程發(fā)展及預(yù)后。在此進(jìn)程中，凝血系統(tǒng)的功能也隨之發(fā)生重大變化，其中主要有胰腺的微循環(huán)功能障礙［2］。目前主要認(rèn)為巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞激活，引起促炎細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)過(guò)度釋放是胰腺微循環(huán)障礙發(fā)生的主要機(jī)制［6］。微循環(huán)障礙時(shí)的低血容量可導(dǎo)致血液的高凝狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示SAP大鼠胰腺內(nèi)原位微血栓形成，提示SAP大鼠胰腺功能障礙及組織損傷與其微循環(huán)功能障礙密切相關(guān)。fgl2凝血酶原酶的促凝途徑與經(jīng)典的內(nèi)外源凝血途徑不同，它可直接激活凝血酶原轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘哪付龠M(jìn)凝血，同時(shí)fgl2凝血酶原酶接受細(xì)胞因子調(diào)控，具有促凝血和炎癥的雙重作用，Levy將fgl2凝血酶原酶的促凝途徑，稱(chēng)為“免疫凝血”［3，7，8］。有研究報(bào)道，fgl2凝血酶原酶高表達(dá)于小鼠MHV－3爆發(fā)性肝炎、自發(fā)性流產(chǎn)、器官移植排斥反應(yīng)等疾病的生理病理過(guò)程中［9，10］。它可通過(guò)觸發(fā)急性炎癥細(xì)胞聚集，在局部組織高表達(dá)，啟動(dòng)局部凝血過(guò)程，導(dǎo)致纖維蛋白沉積、微血栓形成、微循環(huán)障礙，最終導(dǎo)致臟器形態(tài)學(xué)變化和功能障礙。

本研究結(jié)果顯示SAP大鼠胰腺本研究結(jié)果顯示SAP大鼠胰腺中fgl2mRNA相比SO組顯著升高(P＜0.01)，且隨病程延長(zhǎng)而逐漸增加(P＜0.01)。推測(cè)在胰腺炎病程中，炎癥因子協(xié)同刺激大鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞中fgl2凝血酶原酶基因，首先在轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)增高，再進(jìn)一步增加凝血酶原酶合成，然后通過(guò)激活凝血系統(tǒng)導(dǎo)致胰腺組織微血管內(nèi)血栓形成，從而促使胰腺壞死發(fā)生。免疫組化結(jié)果顯示SAP大鼠胰腺微血管內(nèi)皮細(xì)胞中可見(jiàn)fgl2凝血酶原酶蛋白高表達(dá)，且表達(dá)水平與微血栓陽(yáng)性血管率正相關(guān)(r=0.878，P＜0.01)。該結(jié)果提示fgl2凝血酶原酶可能通過(guò)介導(dǎo)胰腺內(nèi)微血栓的形成而促進(jìn)重癥急性胰腺炎的發(fā)生與發(fā)展。

1 陳麗倩，翟科，金尹，等.急性壞死性胰腺炎胰腺組織中褪黑激素受體表達(dá)及褪黑激素干預(yù)作用［J］.中華內(nèi)科雜志，2010，49(11): 959－962

2 金太欣，張家衡，吳彪.川芎嗪對(duì)急性胰腺炎大鼠血漿血栓素、前列環(huán)素的影響［J］.中國(guó)普通外科雜志，2006，15(6):470－472

3 LevyGA，LiuMF，DingJW，etal.Molecularandfunctionalanalysisof thehumanprothrombinasegene(HFGL2)anditsroleinviralhepatitis［J］.AmJPathology，2000，156(4):1217－1224

4 DingYP，LiuK，WangY，etal.Expressionandsignificanceoffgl2 prothrombinaseincardiacmicrovascularendothelialcellsofratswith type2Diabetes［J］.JHuazhongUnivSciTechnol，2010，30(5):575－581

5 SuK，ChenF，YanWM，etal.Fibrinogen－likeprotein2/fibroleukin prothrombinasecontributestotumorhypercoagulabilityviaIL－2and IFN－γ［J］.WorldJGastroenterol，2008，14(39):5980－5989

6 林旭紅，李永渝.急性胰腺炎發(fā)病機(jī)制及相關(guān)治療的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)病理生理雜志，2010，26(5):1029－1032、1040

7 ChanCW，ChanMW，LiuMF，etal.Kineticanalysisofauniquedirectprothrombinase，F(xiàn)GL2，andidentificationofaserineresiduecriticalfortheprothrombinaseactivity［J］.JImmunol，2002，168:5170－5177

8 LevyGA，MarsdenR，ZhongEH，etal.Strategiestopreventthrombosis inxenotransplants［J］.TransplantProc，1998，30:458－2460

9 NingQ，SunY，HanM，eta1.Roleoffibrinogen－likeprotein2prothrombinase/fibroleukininexperimentalandhumanallograftrejection［J］.JImmunol，2005，174(11):7403－7411

10 ZhuCL，YunWM，ZhuF，etal.Fibrinogen－likeprotein2fibroleukin expressionanditscorrelationwithdiseaseprogressioninmurinehepatitisvirustype3－inducedfulminanthepatitisandinpatientswithsevereviralhepatitisB［J］.WorldJGastroenterol，2005，11(44):6936－6940