鄭新強(qiáng) 梁月榮 陸建良 趙 東
(浙江大學(xué)茶葉研究所 杭州 3100580)
2011年國(guó)內(nèi)外茶樹(shù)遺傳育種工作者在茶樹(shù)育種資源收集與利用、茶樹(shù)遺傳基礎(chǔ)研究、新品種選育和良種繁育推廣等方面開(kāi)展了大量研究,并取得重要進(jìn)展。
為了使一些重要遺傳資源在產(chǎn)業(yè)發(fā)展中迅速發(fā)揮作用,采取了資源收集、鑒定與轉(zhuǎn)化利用同時(shí)進(jìn)行的措施。
汪云剛等[1]從105份云南茶樹(shù)種質(zhì)資源中篩選出抗性表現(xiàn)較好的資源11份,其中抗寒性較強(qiáng)的有‘86.8-1’、‘86-9.12’、‘86-12-7’、‘86-6-9’、‘河頭白尖毛茶’和‘弄島黑茶’等6份;抗假小綠葉蟬蟲(chóng)性較強(qiáng)的有‘馬鞍山大葉茶’、‘昌選2’和‘中葉2號(hào)’;抗咖啡小爪螨蟲(chóng)性較強(qiáng)的有‘基諾大葉茶’和‘丫口小茶’;抗根結(jié)線蟲(chóng)性較強(qiáng)的有’84-1-1’和‘曼噴龍大葉茶’。
可可茶是一種新的天然不含咖啡堿的茶資源。廣東研究者以可可茶資源為原料加工成綠茶、烏龍茶和紅茶,感官審評(píng)顯示,加工的綠茶為85.1分,烏龍茶86.8分,紅茶94.4分;水浸出物含量分別為46.67%、41.8% 和 40%;茶多酚分別為 38.58%、30.41% 和 23.6%; 總 兒 茶 素 分 別 為 23.51%、17.68%和4.02%。說(shuō)明利用該資源生產(chǎn)低咖啡堿紅茶可產(chǎn)生良好效果。進(jìn)一步分析顯示,該資源加工的綠茶、烏龍茶和紅茶的可可堿含量明顯高于一般茶樹(shù)品種,分別為 3.52%、3.43%和 3.71%[2]。
湖南省從400多份城步峒茶、江華苦茶、汝城白毛茶、云臺(tái)山種等茶樹(shù)資源選育出高氨基酸茶樹(shù)新品種保靖‘黃金茶1號(hào)’,以氨基酸含量高、綠茶品質(zhì)優(yōu)異而深受歡迎。育種單位采取產(chǎn)業(yè)化育苗措施,使該資源生產(chǎn)力得到迅速發(fā)揮[3,4]。
四川省對(duì)33份地方茶資源和19個(gè)引進(jìn)品種化學(xué)成分測(cè)量,結(jié)果表明,供試資源的水浸出物含量均高于45%,其中‘天府28號(hào)’的氨基酸含量>4%,‘N-2’、‘N-4’和‘N-5’的 EGCG 含量 >10%,可用于高 EGCG 品種培育[5,6]。
廣西柳州對(duì)境內(nèi)分布的‘野生石崖茶’等野生茶或類(lèi)茶資源開(kāi)展調(diào)查,顯示野生石崖茶的形態(tài)特征明顯,加工的成品茶具有特殊“崖韻”。提出了開(kāi)發(fā)利用措施以促進(jìn)柳州茶品牌建設(shè)[7]。
福建省根據(jù)閩、臺(tái)茶葉產(chǎn)業(yè)的共性和特點(diǎn),總結(jié)了品種創(chuàng)新和推廣應(yīng)用的經(jīng)驗(yàn),提出資源共享等開(kāi)發(fā)利用措施,并收到良好社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益[8]。
日本在種質(zhì)資源收集保護(hù)、育種、繁育和推廣等均取得重要進(jìn)步,但面臨茶葉風(fēng)味單一、推廣品種的茶多酚和兒茶素含量偏低等問(wèn)題[9]。為了進(jìn)一步優(yōu)化品種的特征特性,利用代謝組學(xué)方法比較了43個(gè)日本綠茶品種資源的生物活性,并構(gòu)建了生物活性預(yù)測(cè)模型,為新型功能性茶食品相關(guān)品種培育和產(chǎn)品設(shè)計(jì)提供新思路[10]。
土耳其主產(chǎn)紅茶,現(xiàn)有品種多為有性系。育種研究不能滿(mǎn)足需求,政府建立了茶葉推廣體系,近年開(kāi)始致力于茶樹(shù)種質(zhì)資源的收集以及無(wú)性系品種的培育,選出64個(gè)無(wú)性系,其中‘Muradiye-10’等7個(gè)品系已在黑海地區(qū)大量種植[11]。孟加拉國(guó)經(jīng)過(guò)研究認(rèn)為,品種‘MZ/39’最適合當(dāng)?shù)胤N植,其次為‘B2× T1’和‘SDL/1’[12]。
貴州對(duì)云霧貢茶(Camellia sinensis(L.)Kuntze Var.niaowangensis Q.H.Chen)開(kāi)展了研究,該資源是山茶屬的一個(gè)新變種,其與栽培茶樹(shù)(Camellia sinensis var.sinensis)的主要區(qū)別在于葉片較大、質(zhì)地較薄、葉表面?zhèn)让}明顯下凹、葉面呈皺紋狀、花萼片背面被微毛、邊緣具緣毛。這些變異可能源于天然雜交或生境變化[13]。
中國(guó)農(nóng)科院茶葉研究所使用對(duì)數(shù)比例法和Ward’s聚類(lèi)方法,從2665份茶樹(shù)種質(zhì)資源中隨機(jī)選取約20%不同組的種質(zhì)組成一個(gè)532份的核心種質(zhì)資源。經(jīng)分析形態(tài)特征的方差分析、Newman-Keuls檢驗(yàn)等證實(shí)所收集的種質(zhì)變異均存在于核心種質(zhì)庫(kù)中,不同性狀的“香農(nóng)-韋弗”多樣性指數(shù)在初始種質(zhì)與核心種質(zhì)中類(lèi)似[14]。
RAPD、AFLP、ISSR和SSR等分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)及其在茶樹(shù)遺傳多樣性分析、分子育種中的作用,為種質(zhì)的遺傳改良和核心種質(zhì)的利用提供了重要依據(jù)[15]。
中國(guó)學(xué)者利用96個(gè)新多態(tài)EST-SSR標(biāo)記研究了14個(gè)產(chǎn)茶區(qū)收集的450份茶樹(shù)種質(zhì)資源,總共發(fā)現(xiàn)409個(gè)等位基因,平均遺傳多樣性指數(shù)和多態(tài)性信息量分別為0.64和0.6,其中廣西、云南等發(fā)源地的遺傳多樣性水平最高;而且等位基因數(shù)、遺傳多樣性、多態(tài)性信息量隨著遠(yuǎn)離茶樹(shù)發(fā)源地而下降,從分子遺傳角度闡述了茶在中國(guó)的傳播路徑[16]。喬小燕等[17]利用109對(duì)核心 EST-SSR標(biāo)記研究了105份廣東、廣西的茶樹(shù)核心資源的遺傳多樣性,共檢測(cè)到等位基因435個(gè),平均等位基因(NA)3.99個(gè),平均有效等位基因(NE)、Nei's基因多樣性(H)、觀測(cè)雜合度(Ho)、期望雜合度(He)及多態(tài)性信息含量(PIC)分別為 2.12、0.59、0.32、0.46 及 0.56。廣東茶樹(shù)資源遺傳多樣性低于廣西茶樹(shù)資源。廣東白毛茶比廣東茶的遺傳多樣性豐富,種群遺傳分化低,存在較頻繁的基因交流[18]。而利用ISSR標(biāo)記分析云南省10個(gè)古茶園的茶樹(shù)資源的遺傳多樣性和遺傳分化,發(fā)現(xiàn)種群內(nèi)遺傳變異水平的下降可能是茶樹(shù)之間的高度自然雜交和生境的破壞所致。因此,提出要結(jié)合原產(chǎn)地保護(hù)和易地種質(zhì)取樣來(lái)保護(hù)這些古茶樹(shù)種群[19]。Afridi等分析發(fā)現(xiàn)巴基斯坦種植的75個(gè)品種茶的遺傳距離范圍為0~100%,說(shuō)明該國(guó)茶樹(shù)基因型具有高度多樣性[20]。
為了開(kāi)發(fā)鑒定茶葉品種的酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列(CAPS)標(biāo)記,Ujihara等選擇了16個(gè)標(biāo)記對(duì)63個(gè)品種進(jìn)行鑒定發(fā)現(xiàn),除了‘Kiraka’(一個(gè)芽突變種)和藪北種等3份材料以外,借助該16個(gè)標(biāo)記結(jié)合篩選的CAPS標(biāo)記以及形態(tài)特征,可以區(qū)分和鑒別這些茶樹(shù)品種[21]。
段云裳等利用自主開(kāi)發(fā)的39對(duì)多態(tài)性SSR引物分析157份中國(guó)紅、綠茶適制品種(系)的遺傳多樣性和親緣關(guān)系,發(fā)現(xiàn)平均可檢測(cè)4.90個(gè)等位基因,11.28個(gè)基因型,平均多態(tài)性信息量(PIC)0.53,基因多樣性指數(shù)(H)0.57,遺傳分化系數(shù) GST 0.19,顯示81%的遺傳多樣性來(lái)自品種之間的遺傳差異。適制紅茶品種(系)的遺傳多樣性水平最高,其次是紅綠茶兼制型,適制綠茶的最低;系統(tǒng)選育法得到的品種(系)的遺傳多樣性水平高于雜交選育品種(系)和地方品種(系)[22]。王旭等研究也表明,紅茶組的遺傳多樣性遠(yuǎn)高于“烏龍茶”組[23]。
利用RAPD標(biāo)記和花瓣顏色、花徑、花期等三個(gè)性狀檢測(cè)中國(guó)溫州的15個(gè)茶樹(shù)品種表明,15個(gè)品種可分為兩組,第一組中RAPD標(biāo)記和花瓣顏色相關(guān),第二組中未發(fā)現(xiàn) RAPD標(biāo)記和任何性狀相關(guān)[24]。
Bornali等比較了9種實(shí)驗(yàn)方案,證實(shí)18S rRNA和RuBP基因是茶樹(shù)最穩(wěn)定的參考基因[25]。吳揚(yáng)等研究‘白葉茶1號(hào)’白化期基因的差異表達(dá),建立了理想的預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增體系[26]。應(yīng)用抑制消減雜交技術(shù)(Suppression subtractive hybridization,SSH)分析了‘白葉茶1號(hào)’全白期與全綠期葉片差異表達(dá)基因,并構(gòu)建了白期葉與綠期葉的正、反向消減文庫(kù)。對(duì)從中隨機(jī)挑選的80個(gè)陽(yáng)性克隆測(cè)序并比對(duì),發(fā)現(xiàn)80個(gè)序列(200~900 bp)中不存在任何同源性的有30個(gè),其中1-5、1-9、2-13等基因3個(gè)基因片段可能與‘白葉茶1號(hào)’高氨基酸性狀存在相關(guān)性,前兩者與氨基酸合成相關(guān),后者與耐熱性及抗性相關(guān)[27]。
高通量RNA-seq技術(shù)為檢測(cè)功能基因組提供了高效手段。使用高通量Illumina RNA-seq對(duì)茶樹(shù)中從poly(A)+RNA的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行深度分析(2.59 gigabase對(duì)),獲得的約34.5百萬(wàn)個(gè)閱讀框可組裝成127094個(gè)非重復(fù)序列,其中包括788個(gè)重疊群和126306單一序列,序列平均長(zhǎng)355 bp;該非重復(fù)序列數(shù)量是GenBank中現(xiàn)有序列的10倍,可作為一個(gè)重要的公共信息平臺(tái)[28]。
基因網(wǎng)絡(luò)分析也是目前常用的研究方法,可以對(duì)茶樹(shù)冬季休眠期或者溫度、激素相關(guān)的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)進(jìn)行分析。研究表明,茶樹(shù)對(duì)低溫脅迫,涉及多種代謝途徑中的眾多基因,而且大葉種比中小葉種對(duì)低溫反應(yīng)更為敏感,抗凍蛋白隨低溫誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而表達(dá)量增加,至12時(shí)達(dá)到高峰[29]。對(duì)中小葉種‘舒茶早’、云南大葉種‘73-11’4oC低溫處理4 d后,采用AFLP技術(shù)篩選出冷誘導(dǎo)下茶樹(shù)差異表達(dá)基因片段41個(gè),其中‘舒茶早’產(chǎn)生19條差異條帶,‘73-11’產(chǎn)生38條差異條帶。
質(zhì)膜透性研究表明,受冷馴化茶苗葉片質(zhì)膜相對(duì)透性變化很小,但可溶性蛋白含量較高,容易分離茶樹(shù)低溫誘導(dǎo)蛋白。不同分離方法比較表明,改良Tris-HCl法提取的低溫誘導(dǎo)蛋白得率高、帶多清晰、雜質(zhì)少、易操作,比傳統(tǒng)的丙酮沉淀法、硫酸銨沉淀法和直接提取法有明顯優(yōu)勢(shì)。還有研究顯示,在冷馴化蛋白樣品中,25 kDa、35 kDa和90 kDa蛋白差異條帶可能與茶樹(shù)抗凍性有關(guān)[30]。
李先文等運(yùn)用RACE技術(shù)從茶樹(shù)克隆了一個(gè)冷誘導(dǎo)基因CsCOR1,該基因可編碼86個(gè)氨基酸的多肽,多肽由N-端的信號(hào)肽以及富含甘氨酸、精氨酸和脯氨酸的C-端兩部分組成,其成熟蛋白中有兩個(gè)重復(fù)的13肽段。在低溫和脫水脅迫條件下,CsCOR1基因表達(dá)劇烈上調(diào),而且外源ABA對(duì)其有中度上調(diào)作用[31]。
與植物休眠相關(guān)的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑可引起基因表達(dá)的變化。SSH技術(shù)是研究芽休眠期基因基因差異表達(dá)的有效方法,也為調(diào)節(jié)田間茶葉芽休眠提供了新思路。Krishnaraj等構(gòu)建了茶樹(shù)休眠芽正、反向抑制消減雜交文庫(kù),各有17和45個(gè)單一序列,其中一部分與細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝相關(guān),但功能未知序列的分別有41.1%和26.7%、假想功能的序列分別占11.7%和2.2%[32]?;蚍治龃_定,這些EST序列與細(xì)胞代謝途徑和芽休眠密切相關(guān)。
基因網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn),在冬眠芽中表達(dá)下調(diào)的基因和逆境誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)的基因與細(xì)胞周期/細(xì)胞分裂有關(guān)。在4°C低溫時(shí),生長(zhǎng)活躍期嫩梢的基因調(diào)控模式與冬眠時(shí)的一芽二葉期相似,而冬眠期組織在25°C時(shí)的基因調(diào)控又與在生長(zhǎng)期的新稍相似。受冬眠、溫度和植物激素控制的基因在同一個(gè)基因網(wǎng)絡(luò)中[33]。該網(wǎng)絡(luò)中的α-微管蛋白(CsTUA)基因已從茶樹(shù)中克隆,可編碼449氨基酸的蛋白質(zhì),推算的分子量為 49.6 kDa,等電點(diǎn)(pI)為 5.09,與其它植物中的TUA基因的核酸序列和氨基酸序列分別有76-84%和90-95%的相似性。在生長(zhǎng)活躍期,CsTUA在花芽中表達(dá)最強(qiáng);低溫處理24 h后可誘導(dǎo)幼葉CsTUA表達(dá),且表達(dá)的變化不受生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑影響。此外,氯化鈉、聚乙二醇和過(guò)氧化氫也可誘導(dǎo)CsTUA表達(dá)。研究認(rèn)為,CsTUA基因可能與低溫下茶樹(shù)保持常綠有關(guān)[34]。
Borchetia等從茶樹(shù)中克隆了類(lèi)胡蘿卜素、葉黃素前體番茄紅素EPSILON環(huán)化酶的基因,該基因全長(zhǎng)1982 bp,開(kāi)放閱讀框1599 bp;編碼的氨基酸序列可能與葡萄屬具有84%的同源性。克隆的基因在大腸桿菌 PET載體中獲得表達(dá),其蛋白分子為59.615 kDa[35]。
以品種‘龍井長(zhǎng)葉’與‘福鼎大白茶’為研究對(duì)象,利用cDNA-AFLP技術(shù)分析基因差異表達(dá)文本,發(fā)現(xiàn)‘龍井長(zhǎng)葉’自花授粉后有25個(gè)差異表達(dá)的基因,分別參與能量代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞程序化死亡(PCD)、蛋白質(zhì)的合成、轉(zhuǎn)錄及其他生物進(jìn)程。其中在SI信號(hào)傳導(dǎo)中,G蛋白和磷酸肌醇參與調(diào)控Ca2+濃度,微管蛋白參與調(diào)控花粉管發(fā)育,這些基因可能與自交不親和性密切相關(guān)[36]。
Sharma等比較了生長(zhǎng)在印度 Kangra地區(qū)Assam變種和中國(guó)變種新梢化學(xué)成分發(fā)現(xiàn),Assam變種的兒茶素類(lèi)含量和預(yù)苯酸脫水酶活性高于中國(guó)變種,而中國(guó)變種的2-苯乙醇含量高。在茶樹(shù)品種受外生擔(dān)子菌侵染后,兒茶素類(lèi)和2-苯乙醇含量以及預(yù)苯酸脫水酶的活性會(huì)下降,適度的干旱可誘導(dǎo)它們上升[37]。
茶樹(shù)品種兒茶素類(lèi)含量受到環(huán)境條件和人為處理的影響。對(duì)烏龍茶品種‘黃枝香’不同部位的枝條進(jìn)行環(huán)剝后,鮮葉的淀粉和兒茶素類(lèi)的含量均顯著提高[38]。云南省南糯山古茶園鮮葉的茶多酚、兒茶素類(lèi)、氨基酸、咖啡堿、水浸出物等成分含量均高于臺(tái)地茶園,且以氨基酸更突出;但臺(tái)地茶的揮發(fā)性成分含量高于老樹(shù)茶[39]。
Hasegawa等檢測(cè)發(fā)現(xiàn),茶籽中含有咖啡堿,而未檢出兒茶素類(lèi)。用己烷萃取茶籽獲得的提取液中含有油酸甘油酯(79.9%)和亞油酸甘油酯(20%),而用甲烷提取液則含有柚皮素糖苷[40]。
江蘇茅山對(duì)‘毛蟹’、‘梅占’、‘武夷菜茶’、‘龍井長(zhǎng)葉’、‘浙農(nóng)113’所制烏龍茶檢測(cè)發(fā)現(xiàn),其共同特點(diǎn)是茶多酚含量適中,游離氨基酸較高,酚/氨比較小,可溶性糖較高,水浸出物豐富,綜合品質(zhì)優(yōu),適合當(dāng)?shù)卦谇锛旧a(chǎn)清香型烏龍茶[41]。
以‘龍井43’、‘迎霜’、‘鳩坑群體種’原料加工松陽(yáng)香茶比較品種適制性發(fā)現(xiàn),該3個(gè)品種所制成品茶“色綠、香高、味濃”,符合松陽(yáng)香茶的要求。但香氣持久性方面‘龍井43’表現(xiàn)更突出,滋味方面以‘鳩坑群體種’為佳[42]。湖南武陵山區(qū)沅陵縣以‘碧香早’、‘櫧葉齊’等綠茶品種加工卷曲形綠茶表明,多毫品種‘碧香早’加工成卷曲形茶比直條形茶品質(zhì)優(yōu);而茸毛較少的品種‘櫧葉齊’則以加工成直條形茶品質(zhì)優(yōu)于卷曲形茶,且適合機(jī)械加工[43]。祁紅香螺適制性研究發(fā)現(xiàn),‘安徽1號(hào)’、‘安徽3號(hào)’和‘鳧早2號(hào)’品質(zhì)順序依次為:‘鳧早2號(hào)’>‘安徽3號(hào)’>‘安徽l(shuí)號(hào)’>‘祁門(mén)櫧葉’[44]。福建以新品種‘榕春早’制茶試驗(yàn)表明,該品種春季適制扁形綠茶,夏季適制紅茶;春季綠茶具花香,夏季紅茶具甜香或類(lèi)似棗香,品質(zhì)均優(yōu)[45]。
不同地區(qū)由于土壤質(zhì)地和營(yíng)養(yǎng)元素存在差異,成品茶在特征化學(xué)指標(biāo)、礦質(zhì)元素等方面也表現(xiàn)出差異。據(jù)此可借助礦質(zhì)元素和特征性化學(xué)鑒定結(jié)合主成分分析,可以鑒別不同產(chǎn)地利用同樣品種加工的同樣茶類(lèi)產(chǎn)品,即產(chǎn)品的原產(chǎn)地[46]。意大利有人利用偏光X射線熒光光度法檢測(cè)茶葉的主要和非主要元素,試圖了解產(chǎn)品的原產(chǎn)地情況[47]。
代謝組學(xué)方法在茶葉成分鑒定中開(kāi)始得到應(yīng)用。Lee等利用代謝組學(xué)方法研究同一品種不同嫩度茶葉和莖的化學(xué)成分發(fā)現(xiàn),隨著茶樹(shù)葉片生長(zhǎng)發(fā)育,茶氨酸、咖啡堿和沒(méi)食子酸水平上升,而兒茶素類(lèi)、葡萄糖和蔗糖水平下降;茶莖則具有很高的茶氨酸水平和很低的兒茶素類(lèi)水平[48]。揭示了葉片和莖存在不同的代謝模式,合理利用茶葉和茶莖,可使產(chǎn)品的主要化學(xué)成分更加協(xié)調(diào)合理。
隨著日均溫度升高,EGC、EC、ECG、和EGCG 的含量增加,而C含量下降。長(zhǎng)期降水可引起EGC、EC、ECG、EGCG和總兒茶素類(lèi)含量下降。此外,相對(duì)濕度明顯影響EGC、總兒茶素類(lèi)和咖啡堿的含量。回歸模型分析發(fā)現(xiàn),不同化學(xué)成分對(duì)氣候的依賴(lài)程度不同,依次為:C>EGCG>TC>EGC>EC>咖啡堿>ECG>可可堿;季節(jié)性氣候?qū)S烷醇類(lèi)的影響大于對(duì)嘌呤堿的影響[49]。
湖北對(duì)從福建引種的15個(gè)烏龍茶品種進(jìn)行8年適栽性試驗(yàn)表明,各品種的生化成分發(fā)生了明顯變化,但不同品種的表現(xiàn)趨勢(shì)不一致。其中大紅袍的氨基酸、茶多酚、咖啡堿含量均減少;該3種成分含量均增加的品種幾乎沒(méi)有。這可能與茶樹(shù)品種對(duì)生態(tài)氣候和土壤條件適應(yīng)變化有關(guān)[50]。
山東日照從南方引進(jìn)的茶樹(shù)品種春季萌發(fā)期比其原產(chǎn)地遲1-1.5個(gè)月;在化學(xué)成分含量方面表現(xiàn)為氨基酸含量明顯增高,其中‘黃山群體種’增加8.4%,‘龍井 43’增加 75.7%,‘鳩坑群體種’增加69.6%,‘福鼎大白’增加 81.1%;而茶多酚含量則明顯減少,其中‘黃山群體種’減少16.3%,‘龍井43’減少 3.2%,‘福鼎大白’減少 16.6%,‘鳩坑群體種’基本持平[51]。
湖南武陵山區(qū)比較了‘碧香早’、‘龍井43’、‘白毫早’等12個(gè)品種(系)的生態(tài)適應(yīng)性,其中表現(xiàn)最好的是‘碧香早’;‘早春毫’可作為特早生品種搭配種植,‘碧香早’、‘迎霜’、‘白毫早’可作為早生品種、‘櫧葉齊’可作為中晚生品種推廣種植[52]。
福建對(duì)引進(jìn)的重慶新品種‘歌樂(lè)茶’試驗(yàn)表明,‘歌樂(lè)茶’春季萌芽期早,持嫩性特強(qiáng),抗性強(qiáng),適制綠、紅、白茶。適宜福建省茶區(qū)種植[53]。游小妹等以‘黃旦’作為對(duì)照種,對(duì)從廣東引種到福建的6個(gè)烏龍茶新品種‘白毛2號(hào)’、‘鴻雁1號(hào)’、‘鴻雁7號(hào)’、‘鴻雁9號(hào)’、‘鴻雁12號(hào)’等進(jìn)行了6年觀察發(fā)現(xiàn),6個(gè)品種表現(xiàn)均較好,適宜在福安茶區(qū)引種[54,55]。
曾志云等研究了茶樹(shù)新品種‘金牡丹’在廣西龍州地區(qū)的適應(yīng)性,結(jié)果表明在冬季采用栽培保護(hù)措施,‘金牡丹’生長(zhǎng)良好,適制綠茶和烏龍茶,品質(zhì)優(yōu)良[56]。
徐凱明等觀察了‘中茶108’、‘中茶102’、‘中茶302’在陜西南鄭縣的適應(yīng)性,發(fā)現(xiàn)該3個(gè)品種發(fā)芽早,產(chǎn)量高,制綠茶品質(zhì)優(yōu)異[57]。
云南包云秀等對(duì)茶樹(shù)雜交新品種‘佛香l號(hào)’、‘佛香2號(hào)’和‘佛香3號(hào)’進(jìn)行區(qū)試表明,參試品種定植成活率、生長(zhǎng)勢(shì)、產(chǎn)量、品質(zhì)、抗逆性方面都優(yōu)于對(duì)照,可在適宜云南大葉茶種植地區(qū)推廣[58]。李媛分析了普洱茶新品種保護(hù)工作現(xiàn)狀,并提出了有針對(duì)性和可操作性的解決對(duì)策[59]。
廣東省調(diào)研了梅州清涼山茶和鍋叾茶2個(gè)系列的13個(gè)客家茶樹(shù)新品系,結(jié)果表明,清涼山茶系列屬灌木型小葉種,發(fā)芽密度大,芽頭數(shù)高達(dá)1719~2862 個(gè)/m2,百芽重 8.4 ~15.2 g;鍋叾茶系列為喬木或小喬木型中小葉種,發(fā)芽密度比清涼山系列小,芽頭數(shù)450~774個(gè)/m2,但芽葉較大,百芽重25.0~43.8 g。該13 個(gè)客家茶品系內(nèi)含物豐富[60]。
福建研究表明,品種類(lèi)型基因型以及土壤質(zhì)地是決定土壤N可利用性、轉(zhuǎn)換及其微生物群體的決定因素。土壤真菌和細(xì)菌的比例在綠茶品種‘福云6號(hào)’茶園高于烏龍茶品種‘黃金桂’茶園,在上坡茶園明顯高于中坡和低坡茶區(qū)[61]。
利用1H NMR分析結(jié)合多變量分析統(tǒng)計(jì)法研究發(fā)現(xiàn),不同海拔地區(qū)的斯里蘭卡紅茶生化成分含量不同。海拔高于1800 m地區(qū)的紅茶特征成分為茶黃素;茶紅素類(lèi),尤其是是茶紅素-3,3-二沒(méi)食子酸含量低于低海拔地區(qū)紅茶,而茶氨酸和咖啡堿含量高于低海拔區(qū)[62]。
茶葉氟含量受到茶樹(shù)品種和種植地區(qū)的影響。貴州20個(gè)茶樹(shù)品種的氟含量差異顯著,其中低氟(<300 mg/g)品種11個(gè)[63]。不同品種的生理指標(biāo)隨環(huán)境氟濃度變化而變化。隨著水培溶液氟濃度提高,葉綠素含量、凈光合速率、過(guò)氧化物歧化酶活性明顯下降,脯氨酸、丙二醛和過(guò)氧化氫含量明顯增加;氟濃度為0.11~0.21 mM時(shí)細(xì)胞結(jié)構(gòu)保持完整,氟濃度達(dá)到0.32~0.53 mM時(shí)細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞。據(jù)此推斷,茶能忍受的最高氟濃度可能在0.32 mM 左右[64]。
品種抗性的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),茶樹(shù)受到昆蟲(chóng)侵害后可散發(fā)一些揮發(fā)性物質(zhì),可能有兩方面,一是驅(qū)避劑作用,驅(qū)趕害蟲(chóng),避免進(jìn)一步的危害;二是害蟲(chóng)天敵引誘劑作用,吸引其天敵前來(lái)控制害蟲(chóng)。這些揮發(fā)性物質(zhì)有多種,包括芳樟醇、α-法尼烯等。外源噴施茉莉酸可誘導(dǎo)出與害蟲(chóng)危害后類(lèi)似的揮發(fā)性成分[65]。
茶樹(shù)葉片組織結(jié)構(gòu)及次生代謝物質(zhì)與茶樹(shù)品種抗蟲(chóng)力有關(guān),茶樹(shù)茸毛、氣孔、角質(zhì)層及葉片內(nèi)部柵欄組織和海綿組織的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可以作為篩選抗蟲(chóng)茶樹(shù)品種的依據(jù)[66]??谷~蟬能力‘龍井43’>‘蘇茶120’>‘中茶108’>‘白葉茶1號(hào)’>‘蘇茶l號(hào)’>‘錫茶5號(hào)’。以葉蟬取食方式為指標(biāo)進(jìn)行聚類(lèi)分析,認(rèn)為茶氨酸、綠原酸、谷氨酸、沒(méi)食子酸兒茶素、EGCG和ECG具有抗葉蟬取食作用;茶多酚、兒茶素類(lèi)與葉蟬取食行為的相關(guān)性較小。以5%的蔗糖溶液為對(duì)照,0.05%茶黃素對(duì)葉蟬具有較強(qiáng)的促進(jìn)取食作用;0.15%的谷氨酸、綠原酸和EGCG濃度以及0.10%的茶氨酸、ECG和EGC對(duì)葉蟬具有較強(qiáng)的拒刺探和拒食作用[67]。
干旱脅迫對(duì)不同茶樹(shù)品種物候期的影響不同,如‘黔湄809’的萌動(dòng)期會(huì)推遲,而‘福鼎大白茶’、‘黔湄601’、‘黔湄419’、‘黔湄701’、‘黔湄502’等品種不受影響[68]。在干旱脅迫過(guò)程,葉內(nèi)的脯氨酸和酚類(lèi)含量增加,SOD、POX和CAT活力增強(qiáng)。這些指標(biāo)變化大的品種,因ROS的積累和脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)導(dǎo)致的傷害減輕,表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗旱力[69]。
組織培養(yǎng)快速繁殖研究表明,以早生種金鳳凰、中生種金鎖匙和晚生種肉桂莖段為外植體時(shí),春季一芽二葉期的第二葉位莖段較為合適;消毒用0.1%HgCl浸泡9-11 min;適宜的初代培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+IAA 0.5 mg/L+GA3 0.5 mg/L+蔗糖 30 g/L[70]。
繁育方法不同影響到茶苗移栽后生長(zhǎng)勢(shì)。研究表明,扦插苗栽培后的茶樹(shù)生長(zhǎng)情況比壓條表現(xiàn)好,產(chǎn)量高,質(zhì)量好[71]。
扦插育苗工程苗床畦面鋪心土是費(fèi)工的作業(yè),而且因心土肥力等問(wèn)題不利于后續(xù)種植作物的生長(zhǎng)。為了解決該問(wèn)題,張正秋等在貴州羅甸上隆茶果場(chǎng)以GT1-2號(hào)育苗劑進(jìn)行土壤消毒、鋪草燃燒高溫殺菌等土壤消毒技術(shù)替代傳統(tǒng)的鋪心土技術(shù)。結(jié)果顯示,畦面不鋪心土處理育苗時(shí)間比傳統(tǒng)方法縮短7-8個(gè)月,每666.7 m2分別減少鋪心土費(fèi)用800~1500元,節(jié)約管護(hù)成本600~1000元[72]。對(duì)茶樹(shù)品種桂熱2號(hào)扦插繁殖試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),母穗靜置時(shí)間對(duì)扦插發(fā)根和茶苗出圃率有影響,其中以靜置2 d的母穗生根株數(shù)和每株生根條數(shù)均比靜置0 d、1 d、3 d、4 d的高,扦插320 d后的出圃率分別為74.3%,較靜置 0 d、3 d、4 d 的處理高[73]。
嫁接繁殖在劣質(zhì)低產(chǎn)老茶園改造中具有成園快、對(duì)土壤破壞程度低等特點(diǎn)。方知添以梅占為砧木嫁接鐵觀音,第2年即可進(jìn)入生產(chǎn)期,茶青產(chǎn)量達(dá)50~100 kg/667 m2,第3年進(jìn)入盛產(chǎn)期,茶青產(chǎn)量可達(dá)到500 kg/667m2,可比新植茶園提前2-3年投產(chǎn),且產(chǎn)品售價(jià)是梅占的10倍以上。試驗(yàn)還表明,嫁接砧木直徑不宜小于1 cm,否則影響嫁接成活率[74,75]。以廣西當(dāng)?shù)夭铇?shù)為砧木高接‘金萱’接穗,可迅速培育良好的分枝結(jié)構(gòu),產(chǎn)量比云南大葉種增13%,且制茶品質(zhì)明顯提高[76]。
王愛(ài)杰等分析了人工植物種子、種子引發(fā)等新技術(shù)在我國(guó)茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展中種子繁殖優(yōu)勢(shì)利用的可能性[77]。茶樹(shù)種子活力是影響茶樹(shù)種苗質(zhì)量的關(guān)鍵因素。茶樹(shù)種子藏貯需要較高的水份和較低的溫度[78]。比較室內(nèi)盒藏、冰箱冷藏和茶園堆藏茶籽的效果發(fā)現(xiàn),茶園堆藏的茶籽較之冰箱冷藏和室內(nèi)盒藏的脫氫酶活性高,氨基酸外滲少,能夠較好地保持茶樹(shù)的種子活力,出苗率高,幼苗健壯,是高山茶園種苗繁殖的簡(jiǎn)便易行的方法[77]。
陳德華等對(duì)水仙的品種特性、栽培技術(shù)、加工工藝及制茶品質(zhì)進(jìn)行了分析,并提出通過(guò)“品種搭配種植結(jié)合測(cè)土配方施肥”的老叢水仙栽培技術(shù)要點(diǎn),以提高夏秋茶生產(chǎn)潛力[79]。針對(duì)鐵觀音幼苗根系不發(fā)達(dá)、蕾多果多、適應(yīng)性差等問(wèn)題,有研究提出可采用稻草或蘑菇土覆蓋茶園,并結(jié)合疏花疏果和合理施肥等科學(xué)管理措施[80]。在新品種‘金觀音’栽培中,方志添提出了茶園里鋪草的免耕栽培技術(shù),具有控制地溫、抑制雜草、改善土壤表層結(jié)構(gòu)和提高肥料利用率的作用,增產(chǎn)效果達(dá)到15%[81]。‘白雞冠’品種適宜種植在半山腰紅壤地,適當(dāng)密植,輔以充足的水肥營(yíng)養(yǎng)和及時(shí)打項(xiàng),可提早形成采蓬面;成齡以后需要及時(shí)適時(shí)分批采,結(jié)合農(nóng)業(yè)防治、生物防治、化學(xué)防治進(jìn)行病蟲(chóng)害綜合控制[82]。鄭小琴總結(jié)了‘白葉茶1號(hào)’在浙西南地區(qū)推廣栽培的技術(shù)要點(diǎn)[83]。
侯君合等比較不同茶樹(shù)品種不同季節(jié)的移栽成活率后認(rèn)為,‘龍井 43’、‘浙農(nóng) 113’、‘浙農(nóng) 139’、‘中茶108’、‘千年雪’等品種在青島地區(qū)栽植,移栽成活率春季最高,夏季最低,秋季移栽須在越冬期采取保溫防寒措施[84]。田林鳳等提出,山東茶區(qū)發(fā)展生態(tài)茶園,首先是選擇適宜的茶樹(shù)品種,結(jié)合科學(xué)規(guī)劃各功能區(qū)、適當(dāng)密植和合理修剪,有條件時(shí)放養(yǎng)蚯蚓,實(shí)現(xiàn)茶、果、林多種經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益同步提升[85]。
合理的茶園間作可改善茶園生態(tài)環(huán)境,提高雨水利用率[86],還有提高復(fù)種指數(shù)和增加整體效益的作用。間作模式有多種,如板栗-銀杏-茶、板栗-茶等。與純茶模式相比,該兩種間作模式茶葉水浸出物、咖啡堿、氨基酸含量增加,茶多酚含量有所降低,可提高綠茶品質(zhì)[87]。趙甜甜等觀測(cè)發(fā)現(xiàn),間作模式的茶樹(shù)新梢呼吸強(qiáng)度極顯著低于對(duì)照,凈光合強(qiáng)度極顯著提高;茶樹(shù)鮮葉產(chǎn)量均極顯著高于對(duì)照[88]。江蘇蘇州洞庭山地區(qū)柑桔-茶、板栗-茶、楊梅-茶、枇杷-茶、銀杏-茶5種果茶間作模式下,枇杷-茶間作模式下的凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度和胞間CO2濃度日均值分別為 1.46 μmol/m·s,0.91 mol/m·s,60.43 mol/m·s和 305.57 μmol/m·s,適合在洞庭山地區(qū)推廣[89]。鐵觀音與蜜柚混交,鐵觀音茶樹(shù)生長(zhǎng)好,病蟲(chóng)害少[90]。樟-茶間作茶園和山蒼子-茶間作茶園可提高表土層有機(jī)質(zhì)和全氮含量,改善土壤水分和容重,而杉木-茶的土壤養(yǎng)分和水分含量偏低。間種作物對(duì)茶葉化學(xué)成分含量的影響,一般是咖啡堿含量有所提高,而茶多酚、兒茶素含量及酚/氨比則有所降低;茶葉質(zhì)量也得到改善[91,92]。貴州銅仁地區(qū)提出了幼齡茶園中套種花生的栽培管理要點(diǎn)[93]。林茶間作能顯著抑制林區(qū)雜草的生長(zhǎng)和積累,從而減少致病性蜱蟲(chóng)數(shù)量,野生菌種類(lèi)和數(shù)量顯著增加,增加生物多樣性。同時(shí)可改善林區(qū)生態(tài)環(huán)境,減少茶樹(shù)凍害發(fā)生,為擴(kuò)大茶樹(shù)栽培面積,為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)野生茶葉及山林防火打下一定的基礎(chǔ)[94]。然而,茶-林間種復(fù)合林中,適度的郁閉度才能提高茶葉產(chǎn)量和質(zhì)量,林木的郁閉度以 0.3~0.6為宜[91]。
廣東省農(nóng)科院和廣東省仁化縣農(nóng)業(yè)局共同選育的無(wú)性系茶樹(shù)新品種‘丹霞1號(hào)茶’和‘丹霞2號(hào)茶’通過(guò)了廣東省品種審定[95,96],二者均抗寒、抗旱力強(qiáng),均適制名優(yōu)紅、白茶。
湖北省農(nóng)科院果樹(shù)茶葉研究所選育的茶樹(shù)新品種‘鄂茶11’通過(guò)了湖北省品種審定[97]。
四川一枝春茶業(yè)有限公司和四川農(nóng)業(yè)大學(xué)共同選育茶樹(shù)新品種‘川沐28’通過(guò)了四川省品種審定,其水浸出物含量高達(dá) 53.8%[98]。
中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院陳亮等分別從‘云桂大葉’、‘矮豐’、‘醉毛猴’和‘武夷81’的實(shí)生群體中選育出‘中茶111’、‘中茶112’、‘中茶115’、‘中茶116’等4個(gè)新品系[99]。國(guó)家新品種‘中茶302’春季萌芽期早,每667 m2鮮葉產(chǎn)量可達(dá)538 kg,抗逆性強(qiáng),適制優(yōu)質(zhì)綠茶[100]。
湖北通過(guò)雜交選育出‘鄂茶12號(hào)’,適制優(yōu)質(zhì)綠茶[101]。該省新品種‘鄂茶5號(hào)’經(jīng)區(qū)試表明,屬于特早生種適制綠茶[102]。早期培育的‘鄂茶1號(hào)’應(yīng)用組織培養(yǎng)與溫室設(shè)施繁育的手段加快育苗進(jìn)程[103]。
浙江武義選育了‘春雨1號(hào)’、‘春雨2號(hào)’2個(gè)綠茶新品種[104],其中‘春雨2號(hào)’具獨(dú)特花香,適制高香型綠茶,但該品種抗寒性稍弱[105]。
廣西從六堡茶有性系群體種中選擇出8個(gè)優(yōu)良品系,其中品系2-10的腋芽為雙芽,該性狀在國(guó)內(nèi)現(xiàn)有茶資源中極為少見(jiàn)[106]。福建省對(duì)‘優(yōu)3’、‘優(yōu)4’、‘優(yōu)10’、‘優(yōu)108’、‘優(yōu)183’和‘優(yōu) 510’進(jìn)行篩選表明,‘優(yōu)3’為特早生種,‘優(yōu)183’為早生種;除‘優(yōu)510’外,其余5個(gè)品種的綠茶品質(zhì)均高于對(duì)照‘福鼎大白茶’[107]。
貴州省選出新品系‘都勻79號(hào)’、‘都勻49號(hào)’、‘都勻 48號(hào)’、‘都勻 21號(hào)’、‘都勻 67號(hào)’、‘都勻42號(hào)’,并制訂了無(wú)公害種植管理規(guī)范[108]。
湖南省總結(jié)了第三輪全國(guó)茶樹(shù)品種區(qū)試結(jié)果,認(rèn)為‘春波綠’和‘霞浦元宵茶’2個(gè)綠茶品種以及‘鴻雁9號(hào)’、‘紫玫瑰’、‘鴻雁1號(hào)’等15個(gè)烏龍茶品種符合國(guó)家茶樹(shù)品種鑒定要求[109,110]。
重要分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)不但有助于深入了解茶樹(shù)品種的遺傳機(jī)理,而且有助于精確開(kāi)展品種經(jīng)濟(jì)性狀的早期鑒定,縮短育種周期、加速育種進(jìn)程、節(jié)約育種成本。目前,雖然每年都有許多關(guān)于茶樹(shù)經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的分子標(biāo)記報(bào)道和登記,但與實(shí)際應(yīng)用還有相當(dāng)距離。究其原因:①研究隨意性較大,缺乏頂層設(shè)計(jì),沒(méi)有系統(tǒng)性和計(jì)劃性,導(dǎo)致重復(fù)研究很普遍;②茶樹(shù)是異花授粉多年生作物,缺乏自交系或者合適的群體為研究對(duì)象。前者是組織和管理問(wèn)題,后者是技術(shù)障礙。欲使該問(wèn)題得到較好的解決,建議在全國(guó)范圍內(nèi)組織一項(xiàng)茶樹(shù)基因組研究計(jì)劃,整合國(guó)內(nèi)相關(guān)研究單位和技術(shù)力量,優(yōu)化分工,協(xié)作攻關(guān),在基因組基礎(chǔ)上推動(dòng)分子標(biāo)記、遺傳轉(zhuǎn)化等工作的開(kāi)展。
種苗繁育不能適應(yīng)產(chǎn)業(yè)發(fā)展需求主要表現(xiàn)在:①可供種苗數(shù)量與市場(chǎng)需求數(shù)量不對(duì)稱(chēng),苗木供應(yīng)不足或者供過(guò)于求的現(xiàn)象周期性發(fā)生。在供不應(yīng)求時(shí)常出現(xiàn)劣種替代良種,而供過(guò)于求時(shí)育苗者經(jīng)濟(jì)損失慘重。種苗的需求決定于各地新茶園和衰老茶園換種改植的規(guī)模,且其規(guī)模在很大程度上受各省政府出臺(tái)的產(chǎn)業(yè)鼓勵(lì)政策制約,而育苗地與需苗地往往分離在不同省份,以至導(dǎo)致信息不對(duì)稱(chēng)。②茶樹(shù)扦插育苗時(shí)間一般需要14個(gè)月,如果加上穗條培育的時(shí)間,則需要17個(gè)月左右;供需之間在計(jì)劃上存在較大時(shí)間差。③我國(guó)茶樹(shù)種苗繁育缺乏規(guī)模化、集團(tuán)化龍頭企業(yè),主要以個(gè)體或者合作社為主,規(guī)模小、數(shù)量多,相互之間缺乏信息溝通。建議:①整體規(guī)劃全國(guó)茶園布局,在規(guī)劃基礎(chǔ)上提出各省新茶園發(fā)展和老茶園改造5-10年計(jì)劃,明確年度種苗需求總量和各類(lèi)品種種苗數(shù)量,指導(dǎo)育苗單位進(jìn)行有計(jì)劃育苗,彌補(bǔ)時(shí)間差。②培育和扶持規(guī)?;铇?shù)種苗龍頭企業(yè),并提高供苗數(shù)量比例,增強(qiáng)育苗計(jì)劃性。
茶樹(shù)育種周期長(zhǎng),而市場(chǎng)需求發(fā)展和變化速度快,新品種培育不適應(yīng)市場(chǎng)需求。其原因:①市場(chǎng)熱點(diǎn)更替很快,育種目標(biāo)與市場(chǎng)需求步伐脫節(jié)。近幾年來(lái),市場(chǎng)熱點(diǎn)從綠茶、普洱茶、白茶、紅茶到黑茶不斷轉(zhuǎn)換,熱度周期大約維持2-3年時(shí)間,遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于育種周期,育種目標(biāo)始終游離于市場(chǎng)價(jià)值之外,使得新品種釋放期就是淘汰期。②專(zhuān)業(yè)育種單位受人員、經(jīng)費(fèi)和實(shí)驗(yàn)園地等限制,茶樹(shù)遺傳育種研究被邊緣化,作用被削弱;為了滿(mǎn)足良種需求,基層技術(shù)推廣部門(mén)和茶葉企業(yè)不得不自行育種,但因技術(shù)力量薄弱、操作不規(guī)范、資料不齊全,使育種周期進(jìn)一步延長(zhǎng),育種盲目性更加突出。③育種資源不能滿(mǎn)足育種需求。與其他國(guó)家相比,我國(guó)是茶樹(shù)資源大國(guó);但現(xiàn)有收集的茶樹(shù)育種資源的變異范圍仍然比較狹窄,育種資源的創(chuàng)新能力不足,導(dǎo)致已經(jīng)育成的品種在許多經(jīng)濟(jì)性狀方面大同小異,不能滿(mǎn)足市場(chǎng)多樣化需求。建議:①加強(qiáng)育種資源創(chuàng)新能力的開(kāi)發(fā),通過(guò)多途徑擴(kuò)大育種資源的變異范圍,擴(kuò)大育種選擇余地,以滿(mǎn)足不斷發(fā)展的市場(chǎng)多樣化需求。②設(shè)立專(zhuān)項(xiàng)資金,用于扶持良種選育和推廣(中華人民共和國(guó)種子法第六條),鼓勵(lì)和支持單位和個(gè)人從事良種選育和開(kāi)發(fā)(中華人民共和國(guó)種子法第十一條),解決育種單位存在的人員、經(jīng)費(fèi)和實(shí)驗(yàn)園地等不足等問(wèn)題。③制訂“茶樹(shù)種質(zhì)資源保護(hù)和使用條例”,通過(guò)制度的完善鼓勵(lì)育種單位或個(gè)人有賞使用收集和保存單位現(xiàn)有茶樹(shù)育種資源,或者資源保存單位之間的資源交換,提高資源利用率。
1 汪云剛,矣兵,冉隆殉,劉本英,李友勇,孫雪梅,宋維希.云南茶樹(shù)種質(zhì)資源的抗性鑒定和評(píng)價(jià).中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2011,27(13):86-91.
2 Yang XR,Wang YY,Li KK,Li CR,Shi XG,Ko CH,Leung PC,Ye CX,Song XH.Cocoa tea(Camellia ptilophylla Chang),a natural decaffeinated species of tea-Recommendations on the proper way of preparation for consumption.Journal of Functional Foods,2011,3:305-312.
3 劉振,趙洋,楊培迪,成楊,楊陽(yáng).湖南省茶樹(shù)種質(zhì)資源現(xiàn)狀及研究進(jìn)展.茶葉通訊,2011,38(3):8-10,18.
4 王旭,劉振,趙洋,楊培迪,成楊,楊陽(yáng).湖南省茶樹(shù)育種研究進(jìn)展及發(fā)展趨勢(shì).中國(guó)科技成果,2011,(1):26-27,30.
5 王小萍,李春華,羅凡,唐曉波,王迎春,王云.優(yōu)質(zhì)茶樹(shù)種質(zhì)資源篩選研究.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2011,24(2):425-430.
6 王小萍,唐曉波,王迎春,劉曉軍,魏鵬,羅凡.不同茶樹(shù)資源春梢生化成分比較研究.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2011,27(4):102-107.
7 葛智文,廖寅平,蘭毅.開(kāi)發(fā)野生石崖茶創(chuàng)建特色茶品牌.茶葉通訊,2011,38(3):29-31.
8 翁伯琦,張海峰,鐘珍梅.福建省種植業(yè)品種創(chuàng)新與發(fā)展對(duì)策思考.發(fā)展研究,2011,(1):81-83.
9 王志嵐,陳亮.日本茶樹(shù)品種與育種技術(shù).中國(guó)茶葉,2011,(8):11-13.
10 Fujimura Y,Kurihara K,Ida M,Kosaka R,Miura D,Wariishi H,Maeda-Yamamoto M,Nesumi A,Saito T,Kanda T,Yamada K,Tachibana H.Metabolomics-Driven Nutraceutical Evaluation of Diverse Green Tea Cultivars.PLoSONE,2011,6(8):e23426.
11 王志嵐,陳亮.土耳其茶產(chǎn)業(yè)與茶樹(shù)資源育種.中國(guó)茶葉,2011,(8):4-5.
12 Aziz MA,Ahmed B,Razvy MA,Karim MR,Islam R,Haque SKL,Hossain Monzur.Comparative study on some morphological features of six selected and one standard clones of Bangladesh Tea[Camellia sinensis(L)O.Kuntze].International Journal of Biosciences,2011,1(4):100-108.
13 王濟(jì)紅,陳謙海,林昌虎.云霧貢茶——貴州山茶屬一新變種.種子,2011,30(1):65-66.
14 Wang XC,Chen L,Yang YJ.Establishment of core collection for Chinese tea germplasm based on cultivated region grouping and phenotypic data.Frontiers of Agriculture in China,2011,5(3):344-350.
15 Bandyopadhyay T.Molecular marker technology in genetic improvement of tea.International Journal of Plant Breeding and Genetics,2011,5(1):23-33.
16 Yao MZ,Ma CL,Qiao TT,Jin JQ,Chen L.Diversity distribution and population structure of tea germplasms in China revealed by EST-SSR markers.Tree Genetics & Genomes,2011,DOI 10.1007/s11295-011-0433-z.
17 喬小燕,喬婷婷,周炎花,金基強(qiáng),馬春雷,姚明哲,陳亮.基于EST-SSR的廣東與廣西茶樹(shù)資源遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳分化比較分析.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,44(16):3297-3311.
18 周炎花,喬小燕,馬春雷,喬婷婷,金基強(qiáng),姚明哲,陳亮.廣西茶樹(shù)地方品種遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的EST-SSR分析.林業(yè)科學(xué),2011,47(3):59-67.
19 Ji PZ,Li H,Gao LZ,Zhang J,Cheng ZQ,Huang XQ.ISSR diversity and genetic differentiation of ancient tea(Camellia sinensis var.assamica)plantations from China:implications for precious tea germplasm conservation.Pakistan Journal of Botany,2011,43(1):281-291.
20 Afridi SG,Ahmad H,Alam M,Khan IA,Hassan M.DNA landmarks for genetic diversity assessment in tea genotypes using RAPD markers.African Journal of Biotechnology,2011,10(69):15477-15482.
21 Ujihara T,Taniguchi F,Tanaka J,Hayashi N.Development of Expressed Sequence Tag (EST)-Based Cleaved Amplified Polymorphic Sequence(CAPS)Markers of Tea Plant and Their Application to Cultivar Identification.Journal of Agricultural and Food Chemistry,2011,59(5):1557-1564.
22 段云裳,姜燕華,王麗鴛,成浩,王玉花,黎星輝.中國(guó)紅、綠茶適制品種(系)遺傳多樣性與親緣關(guān)系的SSR分析.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,44(1):99-109.
23 王旭,董麗娟,段繼華,李賽君,張曙光.84個(gè)茶樹(shù)品種遺傳多樣性及親緣關(guān)系的SSR分析.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2011,37(3):261-266.
24 Wang XF,Zheng HY,Zheng WH,Ao CQ,Jin HY,Zhao LH,Li N,Jia LR.RAPD-based genetic diversities and correlation with morphological traits in Camellia(Theaceae)cultivars in China.Genetics and Molecular Research,2011,10(2):849-859.
25 Bornali G,Tirthankar B,Sangeeta B,Raju B,Sushmita G,Priyadarshini B,Niraj A,Sudripta D.Identification and validation of stable reference genes in Camellia Species.E3 Journal of Biotechnology and Pharmaceutical Research,2011,2(1):9-18.26 吳揚(yáng),鄧婷婷,李娟,歐秋良,黃建安.茶樹(shù)cDNA-AFLP銀染技術(shù)體系的建立.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2011,27(19):94-99.
27 李娟,劉碩謙,劉仲華,李勤,吳揚(yáng),鄧婷婷,黃建安.‘安吉白茶’抑制消減雜交cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及初步分析.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2011,27(04):96-101.
28 Shi CY,Yang H,Wei CL,Yu O,Zhang ZZ,Jiang CJ,Sun J,Li YY,Chen Q,Xia T,Wan XC.Deep sequencing of the Camellia sinensis transcriptome revealed candidate genes for major metabolic pathways oftea-specificcompounds. BMC Genomics, 2011,12:131.
29 陳林波,李葉云,房超,朱政,江昌俊.茶樹(shù)冷誘導(dǎo)基因的AFLP篩選及其表達(dá)分析.西北植物學(xué)報(bào),2011,31(1):1-7.
30 張楠,洪永聰,丁兆堂,王玉.茶苗葉片低溫誘導(dǎo)蛋白提取分離研究.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2011,24(1):71-74.
31 李先文,余海波,孟瓊,李崢崢,張新玉.茶樹(shù)一個(gè)冷誘導(dǎo)基因的克隆及其表達(dá)分析.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2011,27(19):100-104.
32 Krishnaraj T,Gajjeraman P,Palanisamy S,Chandrabose SRS,Mandal AKA.Identification of differentially expressed genes in dormant(banjhi)bud of tea(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)using subtractive hybridization approach.Plant Physiology and Biochemistry,2011,49:565-571.
33 Paul A,Kumar S.Responses to winter dormancy,temperature,and plant hormones share gene networks.Functional& Integrative Genomics,2011,11:659-664.
34 Paul A,La L,Ahuja PS,Kumar S.Alpha-tubulin(CsTUA)upregulated during winter dormancy is a low temperature inducible gene in tea [Camellia sinensis(L.)O.Kuntze].Molecular Biology Reports,2011,doi:10.1007/s11033-011-1121-7.
35 Borchetia S,Bora C,Gohain B,Bhagawati P,Agarwala N,Bhattacharya N,Bharalee R,Bhorali P,Bandyopadhyay T,Gupta S,Das SK,Singh HR,Ahmed P,Gogoi M,Das S.Cloning and heterologous expression of a gene encoding lycopene-epsilon-cyclase,a precursor of lutein in tea(Camellia sinensis var assamica).African Journal of Biotechnology,2011,10(32):5934-5939.
36 Chen X,Liu TK,Hao S,F(xiàn)ang WP,Wang YH,Li XH.Differential gene expression analysis of self-incompatible lines in tea by cDNAAFLP.African Journal of Biotechnology,2011,10(53):10906-10913.
37 Sharma V,Joshi R,Gulati A.Seasonal clonal variations and effects of stresses on quality chemicals and prephenate dehydratase enzyme activity in tea(Camellia sinensis).European Food Research and Technology,2011,232:307-317.
38 Chen YL,Jiang YM,Shi J,Xu XL,Yang SY,Duan J.Effect of Girdling at Various Positions of Huang Zhi Xiang'Tea Tree(Camellia sinensis)on the Contents of Catechins and Starch in Fresh Leaf.Plant Foods for Human Nutrition,2011,66:169-174.
39 陳繼偉,粱名志,王立波,楊毅堅(jiān),羅正飛,李朝云,夏麗飛,王麗.古茶園與臺(tái)地茶園鮮葉常量成分及成茶品質(zhì)比較研究.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2011,27(4):339-344.
40 Hasegawa T,Akutsu K,Kishi Y,Nakamura K.Constituents of the green tea seeds of Camellia sinensis.Natural Product Communication,2011,6(3):371-374.
41 陳學(xué)林.茅山茶區(qū)秋季鮮葉加工清香型烏龍茶的品種適制性研究.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(4):2094-2095.
42 何迅民,葉火香,何科偉.松陽(yáng)香茶的品種適制性研究.中國(guó)茶葉,2011,(7):16-17.
43 黃懷生,鄭紅發(fā),李賽君,黃仲先.湖南武陵山區(qū)卷曲形優(yōu)質(zhì)綠茶綜合加工技術(shù)研究.湖南農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,(3):98-100,103.
44 徐奕鼎,丁勇,黃建琴,王燁軍,蘇有健,方吳云,夏先江.不同茶樹(shù)良種加工祁紅香螺的品質(zhì)比較研究.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2011,27(17):72-75.
45 郭雅玲,李紀(jì)艷,劉漢炳,江月平,陳思聰,黃江,許長(zhǎng)同.茶樹(shù)新品種“榕春早”適制性分析.茶葉科學(xué)技術(shù),2011,(1):25-26.
46 朱楠楠,胥錦樺,禹利君.成品茶產(chǎn)地理化分析鑒定現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢(shì).茶葉通訊,2011,38(3):3-6.
47 Desideri D,Meli MA,Roselli C,F(xiàn)eduzi L.Polarized X ray fluorescence spectrometer(EDPXRF) for the determination of essential and non essential elements in tea.Microchemical Journal,2011,98:186-189.
48 Lee JE,Lee BJ,Hwang JA,Ko KS,Chung JO,Kim EH,Lee SJ,Hong YS.Metabolic dependence of green tea on plucking positions revisited:a metabolomic study.Journal of Agricultural and Food Chemistry,2011,59(19):10579-10585.
49 Wang LY,Wei K,Jiang YW,Cheng H,Zhou J,He W,Zhang CC.Seasonal climate effects on flavanols and purine alkaloids of tea(Camellia sinensis L.).European Food Research Technology,2011,233:1049-1055.
50 李傳忠,高士偉,葉飛,王紅娟,王雪萍,鄭鵬程,龔自明.湖北省引種烏龍茶品種生化成分變化研究.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2011,(16):74-75.
51 鄭海濤.山東茶區(qū)與南方茶區(qū)不同茶樹(shù)品種特性試驗(yàn)比較.中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng),2011,17(7):20-22.
52 蔣洵.湖南武陵山區(qū)優(yōu)質(zhì)綠茶生態(tài)條件評(píng)價(jià)和茶樹(shù)品種適應(yīng)性研究.碩士學(xué)位論文,湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),2011.
53 吳鴻飛,蘭培春,蔡良綏,蔡清平.茶樹(shù)新品種歌樂(lè)茶選育研究報(bào)告.茶葉科學(xué)技術(shù),2011,(2):20-23.
54 游小妹,陳常頌,鐘秋生,陶湘輝,陳榮冰.廣東烏龍茶品種引種試驗(yàn)初報(bào).福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2011,26(3):377-382.
55 王文建.第三輪全國(guó)茶樹(shù)品種區(qū)試安溪點(diǎn)試驗(yàn)報(bào)告.福建茶葉,2011,33(4):18-26.
56 曾志云,韋雪英,何達(dá)標(biāo).茶樹(shù)新品種金牡丹引種試種初報(bào).農(nóng)業(yè)研究與應(yīng)用,2011,(1):19-20.
57 徐凱明,翟英,劉黎,吳華.國(guó)家茶葉產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系云山點(diǎn)引進(jìn)的新茶品種評(píng)述.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2011,95-97.
58 包云秀,黃梅,楊興榮,張俊,劉德和,唐一春,李友勇,張艷梅.茶樹(shù)佛香2號(hào)等雜交新品種區(qū)域試驗(yàn)研究.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2011,24(1):43-47.
59 李媛.云南省開(kāi)展普洱茶植物新品種保護(hù)工作的思考.科技信息,2011,(11):157,141.
60 吳華玲,陳棟,李家賢,喬小燕,黃華林,何玉媚,關(guān)美玲.13個(gè)梅州特色客家茶樹(shù)新品系的生物學(xué)性狀調(diào)查及主要生化組分研究.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2011,27(28):295-300.
61 Xing SH,Chen CR,Zhang H,Zhou BQ,Nang ZM,Xu ZH.Genotype and slope position control on the availability of soil soluble organic nitrogen in tea plantations.Biogeochemistry,2011,103:245-261.
62 OhnoA, OkaK, SakumaC, Okuda H, Fukuhara K.Characterization of tea cultivated at four different altitudes using1H NMR analysis coupled with multivariatestatistics.Journalof Agricultural and Food Chemistry,2011,59,5181-5187.
63 梁遠(yuǎn)發(fā),劉聲傳,王家倫,陳正武,鄢東海,劉紅梅,周宇.不同茶樹(shù)品種對(duì)氟的富集特征.貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(4):24-26.
64 Li C,Zheng Y,Zhou J,Xu J,Ni D.Changes of leaf antioxidant system,photosynthesis and ultrastructure in tea plant under the stress of fluorine.Biologia Plantarum,2011,55(3):563-566.
65 Dong F,Yang ZY,Baldermann S,Sato Y,Asai T,Watanabe N.Herbivore-induced volatiles from tea(Camellia sinensis)plants and their involvement in intraplant communication and changes in endogenous nonvolatile metabolites.Journal of Agricultural and Food Chemistry,2011,59(24):13131 13135.
66 高香鳳,李慧玲,王慶森.茶樹(shù)葉片組織結(jié)構(gòu)及次生物質(zhì)與抗蟲(chóng)性關(guān)系研究進(jìn)展.茶葉科學(xué)技術(shù),2011,(2):7-11.
67 劉麗芳.茶樹(shù)不同品種和次生代謝物質(zhì)對(duì)葉蟬取食行為影響的DC.EPG研究.碩士學(xué)位論文,中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2011.
68 段學(xué)藝,王家倫,陳正武,胡華健,陳娟,高秀兵.自然干旱脅迫對(duì)不同茶樹(shù)品種物候期的影響.農(nóng)技服務(wù),2011,28(3):363-364.
69 Upadhyaya H,Panda SK,Dutta BK.CaCl2improves post-drought recovery potential in Camellia sinensis(L)O.Kuntze.Plant Cell Report,2011,30:495-503.
70 陳菁,賴(lài)鐘雄,孫威江,郭玉瓊.烏龍茶品種武夷名叢成年材料的離體培養(yǎng)I.成年樹(shù)莖段無(wú)菌系的建立.福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2011,40(3):257-263.
71 趙平麗,董斌.杜鵑紅山茶特征特性及繁育技術(shù)研究進(jìn)展.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2011,15:214-215,217.
72 張正秋,王惠澤,羅顯揚(yáng),聶軍,周富裕,曹雨,賀西亮,張正霞.貴州羅甸茶樹(shù)高效快繁育苗技術(shù)研究.天津農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,17(2):144-147.
73 陳遠(yuǎn)權(quán),韋雪英,陸雄偉,何達(dá)標(biāo),韋錦堅(jiān),曾志云,韋麗娟.桂熱2號(hào)茶母穗靜置時(shí)間對(duì)扦插繁育的影響初探.農(nóng)業(yè)研究與應(yīng)用,2011,(1):4-5.
74 方志添.梅占老茶園嫁接鐵觀音技術(shù).農(nóng)業(yè)研究與應(yīng)用,2011,(2):69-70.
75 謝雪芳.茶樹(shù)嫁接換種.林業(yè)與生態(tài),2011,(8):3.
76 韋志清.試述金萱茶葉在山區(qū)的生產(chǎn)發(fā)展前景.新建設(shè),2011,10(8):60-63.
77 王愛(ài)杰,黃彩梅,劉海燕,鄒天才.茶樹(shù)種子繁殖與幼苗優(yōu)化培育的探討.種子,2011,30(8):105-107.
78 易官美.不同貯藏方法對(duì)廬山茶樹(shù)種子活力影響的比較研究.種子,2011,30(3):7-9.
79 陳德華,陳樺,劉寶順,戈佩貞.武夷巖茶當(dāng)家品種——水仙.福建茶葉,2011,33(3):39-43.
80 楊可.怎樣有效管理鐵觀音幼苗的措施.農(nóng)村實(shí)用技術(shù),2011,2:46.
81 方志添.金觀音引種免耕栽培技術(shù).福建農(nóng)業(yè)科技,2011,(1):41-42.
82 張瑋玲,方志添.白雞冠茶密早栽培技術(shù).農(nóng)業(yè)研究與應(yīng)用,2011,(1):56-57.
83 鄭小琴.安吉白茶在浙西南地區(qū)的栽培技術(shù).茶葉,2011,37(1):29-30.
84 侯君合,張?jiān)苽?,張翠?青島地區(qū)無(wú)性系茶樹(shù)移栽成活率比較試驗(yàn).山東農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,5:32-33.
85 田林鳳,劉相會(huì),孫云先.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2011,13:105,108.
86 Madhu M,Sahoo DC,Sharda VN,Sikka AK.Rainwater-use efficiency oftea (Camellia sinensis(L.)) underdifferent conservation measures in the high hills of south India.Applied Geography,2011,31:450-455.
87 肖正東,程鵬,馬永春,王道金,余誠(chéng)棋,蔡新玲,季琳琳.不同種植模式下茶樹(shù)光合特性、茶芽性狀及茶葉化學(xué)成分的比較.南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2011,35(2):15-19.
88 趙甜甜,蔡新,汪云剛,陳繼偉,劉德和,李嵐,羅正飛,李朝云.蘋(píng)果一茶間作對(duì)茶樹(shù)新梢生長(zhǎng)狀況及產(chǎn)量的影響.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(17):10251-10253.
89 阮旭,張玥,楊忠星,李浩宇,王玉花,黎星輝.果茶間作模式下茶樹(shù)光合特征參數(shù)的日變化.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2011,34(5):53-57.
90 林竹根.優(yōu)良品種鐵觀音茶葉蜜柚混交栽培試驗(yàn).綠色料技,2011,(2):40-42.
91 馬躍,劉志龍,虞木奎,徐慶玲,傅強(qiáng),趙樟.不同郁閉度林茶復(fù)合模式對(duì)茶樹(shù)光合日變化的影響.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2011,27(16):52-56.
92 王麗娟,朱興正,毛加梅,汪云剛,劉德和,高麗洪,唐建維.不同遮蔭樹(shù)種對(duì)茶園土壤和茶葉品質(zhì)的影響.中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2011,31(8):201167-201173.
93 幸玫.銅仁地區(qū)幼齡茶園套種花生栽培技術(shù).云南農(nóng)業(yè)科技,2011,(5):53.
94 丁立孝,梁青,侯可雷,呂祝章,張波,鞠志國(guó).林茶間作對(duì)山林防火及生物多樣性的影響.山東林業(yè)科技,2011.(4):70-71.
95 劉化平.茶樹(shù)新品種“丹霞1號(hào)茶”在廣東上市.農(nóng)村百事通,2011,(16):11.
96 劉化平.茶樹(shù)新品種“丹霞2號(hào)茶”在廣東上市.農(nóng)村百事通,2011,(18):12.
97 袁筱青.茶樹(shù)新品種“鄂茶11”.農(nóng)村百事通,2011,(17):13.
98 袁筱青.茶樹(shù)新品種“川沐28”.農(nóng)村百事通,2011,(12):12.
99 陳亮,姚明哲,金基強(qiáng),王新超,馬春雷,虞富蓮.中茶111等四個(gè)優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、早生茶樹(shù)新品系的選育研究.中國(guó)茶葉,2011,33(2):11-13.
100 楊亞軍,楊素娟,曾建明,王玉書(shū),陳亮,王新超.早生優(yōu)質(zhì)綠茶新品種‘中茶302’.園藝學(xué)報(bào),2011,38(9):1831-1832.
101 賈尚智,閔彩云,陳勛,金孝芳,石亞亞,盧素芳.優(yōu)質(zhì)茶樹(shù)新品種鄂茶12號(hào)選育報(bào)告.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,50(16):3319-3320,3324.
102 閔彩云,賈尚智,楊小林,陳勛,金孝芳,石亞亞.鄂茶5號(hào)全國(guó)茶樹(shù)品種區(qū)域試驗(yàn)總結(jié)報(bào)告.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,50(18):3743-3746.
103 陳勛,賈尚智,閔彩云,金孝芳.茶樹(shù)新品種鄂茶1號(hào)示范與推廣.茶葉通訊,2011,38(3):32-33,35.
104 鄭旭霞.茶樹(shù)新品種春雨1號(hào)、春雨2號(hào)區(qū)域適應(yīng)性研究.茶葉,2011,37(2):88-93.
105 沈生智,徐文武,鄭旭霞,鄧樹(shù)青,胡強(qiáng).茶樹(shù)新品種“春雨二號(hào)”的選育.中國(guó)茶葉,2011,(7):18-20.
106 李偉民,邱衛(wèi)華,陳佳,覃秀菊,邱瑞瑾.六堡茶原生種選育研究試驗(yàn)報(bào)告.大眾科技,2011,(8):164-165,171.
107 張景禹,林祥松.“優(yōu)3”等茶樹(shù)新品種霞浦點(diǎn)區(qū)域試驗(yàn)報(bào)告.福建茶葉,2011,33(1):22-25.
108 王亞維,謝維斌,顧靜生.都勻毛尖茶本地品種茶樹(shù)研究.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(9):5378-5379,5382.
109 楊陽(yáng),趙洋,劉振,梁國(guó)強(qiáng).第三輪全國(guó)茶樹(shù)品種區(qū)域試驗(yàn)湖南試驗(yàn)點(diǎn)區(qū)試報(bào)告.茶葉通訊,2011,38(1):3-8.
110 楊陽(yáng),趙洋,劉振,梁國(guó)強(qiáng).第三輪全國(guó)茶樹(shù)品種區(qū)域試驗(yàn)湖南試驗(yàn)點(diǎn)區(qū)試報(bào)告(續(xù)).茶葉通訊,2011,38(1):8-13,16.