劉猛 董偉 馮曉潔 鄧久鵬 戚孟春 李金源

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)是目前刺激骨組織形成最強(qiáng)的生長因子，其生理效應(yīng)是通過靶細(xì)胞表面Ⅰ型、Ⅱ型受體及胞內(nèi)Smads信號(hào)通路來發(fā)揮的［1］。在Smads信號(hào)通路中，Smad6對(duì)BMPs信號(hào)傳遞起抑制作用，形成了BMPs信號(hào)傳遞的自身負(fù)反饋調(diào)控機(jī)制［2－4］;其單獨(dú)或與其它協(xié)同抑制子(如Smad泛素化調(diào)節(jié)因子-1，smad ubiguitin regulatory factor-1，Smurf1)一起，可以影響其他 Smads分子(如Smad5)的信號(hào)傳遞［5，6］。本研究在前期構(gòu)建的小鼠 Smad6慢病毒干擾載體的基礎(chǔ)上，探索Smad6信號(hào)干擾對(duì)小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)骨向分化中Smad5及Smurf1基因表達(dá)的影響，從而進(jìn)一步揭示應(yīng)用Smad6信號(hào)干擾促進(jìn)BMP-2誘導(dǎo)的MSCs骨向分化的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 攜帶綠色熒光蛋白(GFP)的重組干擾載體 pGCSIL-GFP-Smad6，為自行構(gòu)建［7］。D/F12 小鼠骨髓MSCs專用培養(yǎng)基，購自廣州賽業(yè);胎牛血清購自hyclone公司;Percoll分離液購自美國PHAMACIA公司;人重組BMP-2購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。TrizolTMRNA Isolation Reagent，美國Gibco BRL 公司;iQ SYBR Green supermix，美國 Bio-Rad公司;上下游引物，上海生工合成。兔抗鼠單克隆抗體(一抗)，購自美國SANTA CRUZ公司。

1.2 重組干擾載體對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的轉(zhuǎn)染及骨向分化 密度梯度離心法培養(yǎng)小鼠骨髓MSCs［8］，應(yīng)用含15%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。取第三代MSCs用于本實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為A、B、C 3組:A組，細(xì)胞作為對(duì)照組;B組，空白載體轉(zhuǎn)染+BMP-2誘導(dǎo);C組，重組干擾載體轉(zhuǎn)染+BMP-2誘導(dǎo)。轉(zhuǎn)染病毒液均為50 μl/孔。轉(zhuǎn)染前更換培養(yǎng)基，換用無血清的培養(yǎng)基，使細(xì)胞同步化。應(yīng)用病毒載體轉(zhuǎn)染B、C 2組MSCs，轉(zhuǎn)染第72小時(shí)后，更換新鮮培養(yǎng)基，熒光顯微鏡下觀察;并用200 ng/ml的rhBMP-2對(duì)小鼠骨髓MSCs進(jìn)行骨向誘導(dǎo)。于BMP-2誘導(dǎo)第6、24小時(shí)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)收獲細(xì)胞，進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

1.3 SyberGreen實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Smurf1的基因表達(dá)水平 參照NCBI Genebank中小鼠Smurf1和GAPDH基因序列，根據(jù)SyberGreen Real-time PCR的要求，設(shè)計(jì)待檢測(cè)基因上下游引物。見表1。

表1 小鼠基因Smurf1和GAPDH的Real-time RT-PCR引物

Trizol提取總RNA，用RT-PCR kit在Rotor-Gene 3000熒光定量PCR儀上逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR;引物標(biāo)記采用熒光染料SYBR Green。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為:94℃ 2 min;53℃ 20 s，60℃40 s，共 45個(gè)循環(huán)。GAPDH的cDNA經(jīng)倍比稀釋后進(jìn)行同期PCR，用于回歸分析。反應(yīng)結(jié)束后在PCR儀上自動(dòng)讀取閾值Ct;PCR產(chǎn)物同時(shí)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。每組細(xì)胞檢測(cè)三個(gè)樣本(n=3)。

1.4 Western-blot檢測(cè)磷酸化 Smad5(pSmad5)、Smad5 和Smurf1蛋白水平 MSCs經(jīng)病毒轉(zhuǎn)染及BMP-2骨向誘導(dǎo)后，于兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)收獲B、C兩組細(xì)胞，提取總蛋白。測(cè)定蛋白濃度，以每孔90 pg上樣，濃縮膠電泳條件為80 V、30 min;分離膠條件為150 V、2 h;恒流電轉(zhuǎn)膜2.5 h。5% 牛血清白蛋白室溫封閉1 h，一抗4℃過夜，二抗室溫60 min，BCIP/NBT顯色1 min。硝酸纖維素膜上蛋白表達(dá)的條帶用自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)(Image J)進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，3組細(xì)胞基因相對(duì)濃度進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病毒載體轉(zhuǎn)染小鼠骨髓 MSCs后GFP觀察 B、C 2組MSCs分別經(jīng)空白載體和重組病毒載體轉(zhuǎn)染，24 h后綠色熒光蛋白(GFP)開始表達(dá)，在熒光顯微鏡下細(xì)胞胞漿呈綠色;轉(zhuǎn)染后72 h，GFP表現(xiàn)為強(qiáng)表達(dá)(圖1)，病毒對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率接近100%;在BMP-2處理后，兩組細(xì)胞內(nèi)GFP仍持續(xù)強(qiáng)表達(dá)，提示病毒載體的轉(zhuǎn)染為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。

圖1 病毒轉(zhuǎn)染MSCs 72 h后GFP表達(dá)(熒光顯微鏡×100)A:B組(空白病毒載體);B:C組(重組病毒載體)

2.2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Smurf 1基因表達(dá) 將待測(cè)樣品在定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，采集每一反應(yīng)管中熒光強(qiáng)度的變化，并繪制動(dòng)力學(xué)曲線，得出樣品熒光強(qiáng)度增加到閾值時(shí)的Ct值，并由分析軟件自動(dòng)計(jì)算出與內(nèi)參管家基因GAPDH比較的ΔCt值，以及與A組(無病毒轉(zhuǎn)染及BMP-2處理)ΔCt值比較的ΔΔCt。樣本相對(duì)濃度 =1/2ΔΔCt。

在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，3組Smurf 1相對(duì)濃度經(jīng)單因素方差分析均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);除BMP-2誘導(dǎo)6 h時(shí)A、B 2組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。提示 BMP-2誘導(dǎo)顯著提高了 MSCs中Smurf1基因的表達(dá)，而Smad6 RNA干擾使其表達(dá)進(jìn)一步顯著上升;隨著時(shí)間的延長，這種變化更明顯。見表2，圖2。

表2 SyberGreen實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Smurf 1基因表達(dá)n=3，±s

表2 SyberGreen實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Smurf 1基因表達(dá)n=3，±s

注:與 A 組比較，*P ＜0.01;與 B 組比較，#P ＜0.01

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圖2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Smurf 1基因相對(duì)濃度

2.3 Western-blot檢測(cè)pSmad5、Smad5和Smurf1蛋白水平 在BMP-2處理后兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，B組(空白載體)、C組(重組載體)細(xì)胞Smad5總蛋白水平變化不顯著，未受Smad6信號(hào)干擾的影響。而pSmad5的蛋白水平在C組比B組則明顯提高，蛋白條帶灰度值在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別上升了26.31%和48.21%。上述結(jié)果說明，Smad6信號(hào)干擾雖然對(duì)Smad5總蛋白水平?jīng)]有影響，但明顯提高了磷酸化Smad5的水平，即促進(jìn)了Smad5磷酸化，從而增強(qiáng)BMPs的信號(hào)傳導(dǎo)。Smurf1蛋白水平的變化規(guī)律與pSmad5相似。C組Smurf1蛋白水平在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)比B組均明顯提高，蛋白條帶灰度值分別上升了63.72%和58.65%。提示Smad6干擾后，Smurf1蛋白代償性表達(dá)增高，在一定程度上補(bǔ)償了因Smad6干擾對(duì)BMPs信號(hào)負(fù)調(diào)控的抑制。見圖3。

圖3 Western blot檢測(cè)pSmad5、Smad5、Smurf1的蛋白水平

3 討論

Smad6是BMPs信號(hào)通路中重要的自身負(fù)反饋調(diào)控因子［2－4，9］。在 BMPs刺激下，胞內(nèi) Smad1、Smad5 等受體型 Smad(R-Smad)與Smad4結(jié)合成異源多聚體，易位進(jìn)入核內(nèi)，作用到靶基因特異序列，發(fā)揮BMPs各種生理效應(yīng)。Smad6基因上有SBE序列(smad binding element)，能夠與R-Smad直接結(jié)合;并激活了 Smad6基因轉(zhuǎn)錄，使其表達(dá)水平迅速升高［3，9］，發(fā)揮對(duì)BMPs信號(hào)的負(fù)調(diào)節(jié)作用。

研究表明，Smad6可在胞漿內(nèi)直接與BMPs I型受體結(jié)合，阻礙R-Smad(Smad1、Smad5)磷酸化(激活);也可與 Smad1、Smad5直接結(jié)合，阻礙它們與Smad4形成異源多聚體，進(jìn)而發(fā)揮阻礙 BMPs 信號(hào)傳遞的作用［2，3，9］。

同時(shí)，Smad6的表達(dá)和活性受許多其它信號(hào)分子的協(xié)同調(diào)節(jié);在這些協(xié)同分子中，大多數(shù)是Smad6的協(xié)同抑制子(corepressor);Smurf1便是其中之一。Smurf1高表達(dá)在體外可抑制成骨細(xì)胞前體細(xì)胞2T3骨向分化;在體內(nèi)會(huì)使成骨細(xì)胞增殖和分化顯著下降，并導(dǎo)致骨小梁體積及骨形成速度顯著降低［10］。而Smurf1突變失活則可增強(qiáng)BMP-2誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞前體C2C12和2T3細(xì)胞的骨向分化［11］。Smurf1可直接與BMPs I型受體及Smad1、Smad5結(jié)合，使蛋白泛素化(uniquitiation)，從而導(dǎo)致蛋白降解，阻礙BMPs信號(hào)傳導(dǎo)。Smurf1還可與Smad6形成復(fù)合體，使其與I型受體及Smad1、Smad5的結(jié)合更為容易;這樣，一方面發(fā)揮Smad6阻礙BMPs信號(hào)傳導(dǎo)的作用，另一方面發(fā)揮Smurf1對(duì)蛋白的降解作用，使對(duì)BMPs信號(hào)的負(fù)調(diào)控更強(qiáng)［5，6，10－12］。在共同調(diào)控中，Smurf1 與 Smad6 復(fù)合體對(duì)磷酸化的Smads的作用比非磷酸化的Smads作用更強(qiáng)。

在前期研究中，我們已證實(shí)Smad6信號(hào)干擾可有效促進(jìn)BMP-2誘導(dǎo)的MSCs骨向分化中(另文報(bào)道);然而，Smad6信號(hào)干擾會(huì)對(duì)Smads信號(hào)通路中其它信號(hào)分子(如Smad5、Smurf1)產(chǎn)生怎樣的影響，正是本研究所要解決的問題。

本研究結(jié)果表明，在BMP-2誘導(dǎo)的MSCs骨向分化中，Smad6信號(hào)干擾可有效促進(jìn)Smad5蛋白磷酸化，而對(duì)Smad5總蛋白量無影響。提示Smad6信號(hào)干擾有效解除了其對(duì)Smad5磷酸化的抑制，從而促進(jìn)了信號(hào)傳遞，增強(qiáng)了BMPs的效應(yīng)，表現(xiàn)為MSCs骨向分化增加。同時(shí)，本研究表明，Smad6信號(hào)干擾一定程度上增加了Smurf1的mRNA及蛋白表達(dá)。由于Smurf1是Smad6的協(xié)同抑制子，發(fā)揮著對(duì)BMPs信號(hào)傳遞的抑制作用，因而上述結(jié)果提示機(jī)體內(nèi)部存在一定的代償機(jī)制，在Smad6被干擾后，Smurf1蛋白代償性表達(dá)增高，在一定程度上補(bǔ)償了Smad6分子對(duì)BMPs信號(hào)的負(fù)調(diào)控。

鑒于BMPs體內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的復(fù)雜性，Smad6引號(hào)干擾不僅能促進(jìn)BMP-2誘導(dǎo)的骨向分化，影響Smad5磷酸化及Smurf1基因表達(dá)，還可能對(duì)下游一系列信號(hào)分子及效應(yīng)基因產(chǎn)生影響，從而發(fā)揮BMPs促進(jìn)骨再生的效應(yīng)。然而有哪些信號(hào)分子及效應(yīng)基因會(huì)受到影響?它們的基因表達(dá)會(huì)發(fā)生怎樣的變化?尚待進(jìn)一步深入研究。

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