石勇，張守堯，張忠義，賀帥（南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院藥劑科，廣州510282）

黃連素與谷維素均為傳統(tǒng)經(jīng)典老藥，臨床應(yīng)用廣泛，近年來(lái)藥理學(xué)研究和臨床應(yīng)用[1，2]表明，較大劑量的黃連素和谷維素均具有降低血脂的作用，且谷維素可以促進(jìn)黃連素的體內(nèi)吸收[3]，在筆者的前期研究中發(fā)現(xiàn)兩者合用可產(chǎn)生協(xié)同降血脂的作用。目前關(guān)于谷維素的含量測(cè)定方法2010年版《中國(guó)藥典》尚未收錄，在衛(wèi)生部部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)[4]中采用紫外分光光度（UV）法；而黃連素的含量測(cè)定在2010年版《中國(guó)藥典》中采用高效液相色譜（HPLC）法；文獻(xiàn)中采用HPLC法[5～8]和UV法[9～11]測(cè)定黃連素、谷維素含量的報(bào)道也較多，筆者對(duì)這些方法進(jìn)行了逐一篩選，發(fā)現(xiàn)這些方法均無(wú)法排除同一種制劑中二者的相互干擾，實(shí)現(xiàn)同一制劑中2組分的同時(shí)測(cè)定，也未見(jiàn)如何同時(shí)分離測(cè)定黃連素與谷維素的文獻(xiàn)報(bào)道。新興的微乳液相色譜（Microemulsion liquid chromatography，MELC）是指以微乳為流動(dòng)相的HPLC法，具有獨(dú)特的分離效能，分離效率高，國(guó)內(nèi)、外已有較多文獻(xiàn)報(bào)道[12～14]。筆者采用MELC法實(shí)現(xiàn)了黃連素與谷維素的同時(shí)分離測(cè)定，且準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，可用于制劑的質(zhì)量控制分析，為后期黃連素與谷維素復(fù)方制劑的開(kāi)發(fā)提供了研究基礎(chǔ)，彌補(bǔ)了同時(shí)分離測(cè)定黃連素與谷維素的研究空白。

1 儀器與試藥

Agilengt 1100 HPLC儀（美國(guó)安捷倫公司）；RD-200電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）；超聲儀（江蘇昆山市超聲儀器公司）。

谷維素對(duì)照品（日本東京化成販殼株式會(huì)社，批號(hào):YNPCO000172，純度:99%）；鹽酸小檗堿對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào):110713-200911，純度:86.8%，本試驗(yàn)中黃連素含量以鹽酸小檗堿計(jì)算）；乙腈為色譜純，十二烷基硫酸鈉（SDS）、三乙胺（TEA）及其他試劑均為分析純；三合平脂膠囊（珠江醫(yī)院藥劑科提供，批號(hào):091225、100124、100210，主要組分為谷維素與黃連素，制備時(shí)將黃連素與谷維素按一定比例（暫時(shí)不宜公開(kāi)）物理混合后直接裝膠囊，不含其他輔料）。

2 方法與結(jié)果

2.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

分別精密稱(chēng)定谷維素和鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，以乙腈作為溶劑制備成26.4 mg·L－1的谷維素對(duì)照品溶液和9.45 mg·L－1的鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液，在200～500 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)分別掃描，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 紫外光譜圖Fig 1 UV spectrum

比較谷維素和黃連素的紫外光譜圖可發(fā)現(xiàn)在230 nm波長(zhǎng)處谷維素與黃連素吸收峰比較接近；另外在230 nm波長(zhǎng)處可排除溶劑的干擾，基線穩(wěn)定性好，因此確定測(cè)定波長(zhǎng)為230 nm。

2.2 微乳流動(dòng)相的制備

取33 g SDS，加入約800 mL的0.5%TEA水溶液中，攪拌至完全溶解，再加入100 mL正丁醇、10 mL正辛烷和30 mL乙酸乙酯，最后加入0.5%TEA水溶液稀釋至1 000 mL，超聲15 min至形成澄明溶液，即得微乳流動(dòng)相，磷酸調(diào)節(jié)pH＝3，0.45 μm濾膜過(guò)濾備用。

2.3 色譜條件

色譜柱采用Agilent XBD C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；采用“2.2”項(xiàng)下的微乳流動(dòng)相，流速為1 mL·min－1；二極管陣列檢測(cè)器（DAD），檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm；柱溫為30℃。

2.4 溶液制備

鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液:精密稱(chēng)定鹽酸小檗堿對(duì)照品10 mg，置于100 mL量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻備用。

谷維素對(duì)照品溶液:精密稱(chēng)定谷維素對(duì)照品10 mg，置于100 mL量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻備用。

供試品溶液:精密稱(chēng)定三合平脂膠囊內(nèi)容物粉末20 mg，置于100 mL量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻備用。

空白溶液:取乙腈稀釋后作為空白溶液。

2.5 專(zhuān)屬性考察

取鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液、谷維素對(duì)照品溶液、空白溶液和供試品溶液各20 μL，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果表明，鹽酸小檗堿的峰與相鄰的雜質(zhì)峰，以及谷維素主峰與相鄰的雜質(zhì)峰的分離度均符合要求，詳見(jiàn)圖2所示。

2.6 線性考察

取鹽酸小檗堿對(duì)照品10 mg、谷維素對(duì)照品10 mg置于50 mL量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻備用。分別精密量取上述混合對(duì)照液1、2、5、10、15 mL置于25 mL量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，搖勻。按“2.3”項(xiàng)下色譜條件，對(duì)5份對(duì)照品溶液各進(jìn)樣20 μL，每個(gè)濃度重復(fù)進(jìn)樣3次，測(cè)定并記錄峰面積。以濃度（c）與峰面積（A）進(jìn)行線性回歸，得鹽酸小檗堿與谷維素線性方程分別為A＝6.742 8c－2.378 7（r＝0.999 8）、A＝22.615 2c+16.006 4（r＝0.999 1），結(jié)果表明二者檢測(cè)濃度線性范圍均為8～200 mg·L－1。

圖2 微乳液相色譜圖Fig 2 MELC chromatograms

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

分別精密量取2 mL已知濃度的樣品溶液3份于50 mL量瓶中，分別加入混合對(duì)照液2、5、10 mL，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，取20 μL進(jìn)樣測(cè)定（n＝3），按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）Tab 1 Results of recovery test（n＝3）

2.8 精密度試驗(yàn)

精密量取混合對(duì)照液5 mL，置于50 mL量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，每次進(jìn)樣20 μL，反復(fù)進(jìn)樣9次，計(jì)算峰面積RSD值。結(jié)果黃連素RSD＝1.4%，谷維素RSD＝2.5%，表明本法精密度較好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取混合對(duì)照液5 mL，置于50 mL量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，同日內(nèi)0、2、4、6、8 h進(jìn)樣1次；連續(xù)3 d每天進(jìn)樣1次，計(jì)算峰面積的RSD值。結(jié)果表明，黃連素在乙腈中穩(wěn)定性好，RSD＝1.6%；谷維素在乙腈中穩(wěn)定性較差，僅在8 h（1 d）內(nèi)保持穩(wěn)定，RSD＝3.4%。

2.10 方法耐用性考察

當(dāng)色譜柱由Agilent Eclipse XDB C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）更換為Agilent Hypersil ODS C18（250 mm×4.0 mm，5 μm）時(shí)，鹽酸小檗堿和谷維素的色譜峰變寬、保留時(shí)間延長(zhǎng)，但鹽酸小檗堿峰與相鄰的雜質(zhì)峰，以及谷維素峰與相鄰的雜質(zhì)峰的分離度均大于1.5；柱溫在25～35℃變化以及流速在0.8～1.2 mL·min－1變化時(shí)，該方法仍然適用。

2.11 樣品含量測(cè)定

取批號(hào)為091225、100124、100210的樣品，分別按“2.4”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，每批樣品測(cè)定3次，取其平均值，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝3）

3 討論

谷維素在部頒標(biāo)準(zhǔn)UV法含量測(cè)定中所用溶劑為正庚烷，另有文獻(xiàn)報(bào)道[15～17]采用氯仿、乙醇、異丙醇等作為溶劑，而本試驗(yàn)中筆者選用乙腈作為溶劑是因?yàn)辄S連素不溶于正庚烷，而黃連素與谷維素在乙腈中均有較大的溶解度，并且以乙腈作為溶劑符合2010年版《中國(guó)藥典》附錄紫外-可見(jiàn)分光光度法中對(duì)溶劑的要求，因而選用乙腈作為溶劑。

2010年版《中國(guó)藥典》中黃連素含量測(cè)定采用HPLC法，其色譜條件為磷酸鹽緩沖液（0.05 mol·L－1磷酸二氫鉀和0.05 mol·L－1庚烷磺酸鈉溶液（1∶1），含0.2%三乙胺，并調(diào)pH至3.0）-乙腈（60∶40），但采用該方法同時(shí)測(cè)定黃連素與谷維素時(shí)，谷維素在120 min內(nèi)仍未出峰；部頒標(biāo)準(zhǔn)中，谷維素的含量測(cè)定方法為UV法，由于谷維素與黃連素在紫外吸收范圍內(nèi)均有吸收，無(wú)法實(shí)現(xiàn)制劑中2組分的含量測(cè)定。本試驗(yàn)用微乳液相色譜法測(cè)定黃連素與谷維素復(fù)方制劑的含量，能夠有效地排除制劑中2組分的相互干擾，省時(shí)省力，準(zhǔn)確性高，可用于制劑中黃連素與谷維素的含量測(cè)定和質(zhì)量控制。

谷維素是環(huán)木菠蘿醇類(lèi)與阿魏酸組成的阿魏酸酯類(lèi)混合物，本試驗(yàn)將其作為一個(gè)整體的研究對(duì)象，進(jìn)行含量測(cè)定的研究，能夠有效地實(shí)現(xiàn)制劑中谷維素含量的控制，與張連成等[5]報(bào)道的方法思路一致。

試驗(yàn)中為消除黃連素與谷維素拖尾的現(xiàn)象，曾嘗試在流動(dòng)相中添加0.2%～1%（V/V）的三乙胺，結(jié)果0.5%的三乙胺能使得峰形變窄、拖尾減輕，再加入3%乙酸乙酯后，峰形更為理想。

[1]吳林根，陳 敏.黃連素伍用谷維素對(duì)血脂和體重的影響[J].臨床心血管病雜志，2007，23（8）:576.

[2]許仁溥，許大申.谷維素降脂藥開(kāi)發(fā)[J].糧食與油脂，1994，35（4）:20.

[3]李寶馨，楊寶峰，郝曉敏.黃連素單用及合用谷維素在家兔及健康志愿者體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2000，35（1）:154.

[4]WS1-47（B）-89，谷維素[S].2007.

[5]張連成，賈首時(shí)，王超眾.HPLC法測(cè)定谷維素片含量[J].中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)，2008，9（3）:237.

[6]Yoshie A，Kanda A，Nakamura T，et al.Comparison of γoryzanol contents in crude rice bran oils from different sources by various determination methods[J].J Oleo Sci，2009，58（10）:511.

[7]高 鵬，王曉南，韋 霞.高效液相色譜法測(cè)定一清顆粒中鹽酸小檗堿的含量[J].白求恩軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，6（3）:179.

[8]彭素蓮.HPLC法測(cè)定復(fù)方護(hù)肝顆粒中鹽酸小檗堿的含量[J].海峽藥學(xué)，2010，22（1）:61.

[9]招嘉文.紫外分光光度法測(cè)定更年靈膠囊中谷維素的含量[J].西北藥學(xué)雜志，2008，23（1）:7.

[10]李素梅，賈梅林，牟永利.紫外分光光度法測(cè)定更辰膠囊中谷維素的含量[J].黑龍江醫(yī)藥，2009，22（6）:763.

[11]溫 堅(jiān)，李 芳，林三清.紫外分光光度法測(cè)定三消丹膠囊中鹽酸小檗堿的含量[J].中國(guó)藥師，2009，12（5）:589.

[12]El-Sherbiny D，El-Ashry S，Mustafa M，et al.Evaluation of the use of microemulsions as eluents in high-performance liquid chromatography[J].J Sep Sci，2003，26（6-7）:503.

[13]Jancic B，Ivanovic D，Medenica M，et al.Development of liquid chromatographic method for fosinoprilat determination in human plasma using microemulsion as eluent[J].J Chromatography A，2005，1 088（1-2）:187.

[14]Broderick M，Donegan S，Power J，et al.Optimisation and use of water-in-oil MEEKC in pharmaceutical analysis[J].J Pham Biomed Anal，2005，37（5）:877.

[15]陳攸偉.谷維素片含量測(cè)定影響因素探討[J].中國(guó)藥事，2000，14（6）:124.

[16]邱紅鈺，湯柏寅.谷維素含量測(cè)定方法的改進(jìn)[J].華西藥學(xué)雜志，1998，13（1）:36.

[17]Bucci R，Magri AD，Magri AL，et al.Comparison of three spectrophotometric methods for the determination of γ-oryzanol in rice bran oil[J].Analytical and Bioanalytical Chemistry，2003，375（8）:1 254.