阮 沖，李新春，夏 爽（廣西醫(yī)科大學(xué)，南寧 530021）

羅格列酮（Rosiglitazone，Rog）為第2代噻唑烷二酮類（TZDs）衍生物，是選擇性的過氧化物酶增殖體γ受體（PPAR-γ）激動藥，近年來廣泛應(yīng)用于2型糖尿病的治療。其作用機(jī)制主要是通過增加肌肉和脂肪組織對葡萄糖的攝取，抑制肝糖元的異生，增強(qiáng)胰島素的敏感性，從而發(fā)揮降糖的作用[1]。苯溴馬隆（Benzbromarone，Beb）屬苯并呋喃衍生物，是一種新型的尿酸排泄促進(jìn)劑，該藥不僅能抑制腎小管對尿酸的重吸收，還可抑制嘌呤氧化酶，對降低尿酸具有雙重功效，臨床上主要用于高尿酸血癥和痛風(fēng)的治療[2]。高尿酸血癥（包括痛風(fēng)）與糖尿病、高血壓、高血脂以及胰島素抵抗相關(guān)聯(lián)，大約有14.1%的2型糖尿病患者合并有高尿酸血癥[3]，因此在糖尿病的治療過程中可能會聯(lián)合使用尿酸排泄劑（如Beb）。Beb是一種強(qiáng)效的細(xì)胞色素P450（CYP）2C9抑制劑[4]，能夠抑制多種CYP2C9的底物如甲苯磺丁脲、吲哚美辛等藥物的代謝；Rog在肝臟內(nèi)主要經(jīng)CYP2C8代謝，CYP2C9也參與其體內(nèi)的代謝過程[5]，因此在Beb與Rog聯(lián)合使用時，可能會對Rog的代謝產(chǎn)生影響。

近來，美國食品藥品管理局（FDA）提出藥物預(yù)警:Rog可能會增加心血管事件的風(fēng)險[6]，因而探討聯(lián)合用藥情況下該藥物在體內(nèi)的代謝過程顯得尤為必要。目前尚未有Rog與Beb聯(lián)合使用時Rog藥動學(xué)研究的報道。本研究擬建立高效液相色譜-熒光（HPLC-FLU）法，考察Beb對Rog在小鼠體內(nèi)藥動學(xué)的影響。

1 儀器與材料

1.1 儀器

HPLC儀，包括LC-10ATvp輸液泵、RF-10Axl熒光檢測器、5301PC熒光分光光度計（日本Shimadzu公司）；超純水發(fā)生器（美國Millipore公司）；精密移液器（法國Gilson公司）。

1.2 試藥

Rog對照品（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號:20080518，純度:99.5%）；Beb原料藥（廣東東陽光藥業(yè)有限公司，批號:080902，純度:98.8%）；甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 動物

昆明種小白鼠110只，♀♂不拘，體重（20±1.5）g，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，許可證號:SCXK（桂）2003-0003。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相:乙腈-四氫呋喃-10 mmol·L－1KH2PO4（含0.2%三乙胺，H3PO4調(diào)pH至5.5）＝45∶10∶45，使用前經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾和超聲脫氣，流速:1 mL·min－1；熒光檢測波長:λex＝247 nm、λem＝370 nm；柱溫:30 ℃；進(jìn)樣量:20 μL。

2.2 系統(tǒng)適用性試驗

取空白血漿、Rog對照品溶液、空白血漿+Rog對照品溶液、血漿樣品處理后，按“2.1”項色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果顯示，Rog峰形良好，保留時間約為6.8 min；理論板數(shù)按Rog計大于6 000；血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)及代謝物不干擾Rog的出峰。取濃度為1 μg·mL－1的Rog對照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，峰面積的RSD為1.6%。色譜見圖1。

2.3 對照品溶液的制備

取Rog對照品25 mg，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加甲醇適量使溶解，定容到刻度，搖勻，得濃度為1 mg·mL－1的貯備液，置于4℃冰箱中保存。精密吸取貯備液適量，分別置于7個量瓶中，加甲醇稀釋，使?jié)舛确謩e為0.2、0.5、1、2、5、10、20 μg·mL－1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 Rog熒光光譜考察

用甲醇制備濃度為1 μg·mL－1的Rog對照品溶液，以甲醇為空白，在熒光分光光度計上掃描，其最大激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為247 nm和370 nm。

2.5 血漿樣品的處理

精密吸取血漿0.2 mL，置于5 mL離心管中，加入pH8.0的磷酸鹽緩沖液0.1 mL，渦旋混勻10 s，加入乙醚-二氯甲烷（2∶1，V/V）混合液2 mL，渦旋提取3 min，于3 500 r·min－1離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液1.0 mL至另一尖底離心管中，置于40℃水浴中，通N2流揮干，殘渣用100 μL流動相復(fù)溶，渦旋混合30 s，8 000 r·min－1離心3 min，取20 μL進(jìn)樣。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢測限考察

精密吸取Rog對照品系列溶液各20 μL，分置于7個5 mL的離心管中，N2流揮干溶劑，加入空白血漿0.2 mL，混勻，得濃度分別為20、50、100、200、500、1 000、2 000 ng·mL－1的含藥血漿樣品，按“2.5”項下操作，記錄藥物色譜峰面積，以峰面積（A）對血藥濃度（c）作加權(quán)回歸計算。得回歸方程:A＝1.584×103c－236.5（r＝0.999 7）。結(jié)果表明，Rog檢測濃度的線性范圍為20～2 000 ng·mL－1；按S/N＞3∶1計，本方法的最低檢出限為5 ng·mL－1。

2.7 回收率試驗

按“2.6”項下方法用空白血漿制備Rog濃度分別為50、200、1 000 ng·mL－1的低、中、高濃度血漿樣品，每種濃度重復(fù)5個樣本，按“2.5”項下操作。以血漿樣品中藥物峰面積與相對應(yīng)的Rog的峰面積之比，計算絕對回收率；用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到的濃度值除以理論值，得相對回收率，結(jié)果見表1。

表1 回收率與精密度試驗結(jié)果（±s，n＝5）Tab 1 Results of recovery and precision of tes（t±s，n＝5）

表1 回收率與精密度試驗結(jié)果（±s，n＝5）Tab 1 Results of recovery and precision of tes（t±s，n＝5）

濃度/ng·mL－1 50 200 1 000絕對回收率/%84.0±6.8 88.4±7.5 89.8±6.3相對回收率/%104.5±11.9 99.6±7.4 96.9±8.8 RSD/%日內(nèi)11.3 7.4 9.0日間8.6 5.4 10

2.8 精密度試驗

取“2.7”項下方法制備處理后的低、中、高濃度血漿樣品，分別在同日內(nèi)測定，每個濃度平行分析5次，考察日內(nèi)精密度；另3種濃度每日各測定1次，連續(xù)測定5 d，考察日間精密度。結(jié)果見表1。

2.9 給藥方案

取小鼠隨機(jī)分為單用組（Rog 0.2 mg·kg－1）和 聯(lián)用組（Rog 0.2 mg·kg－1+Beb 5 mg·kg－1）組，每組55只，按人臨床常用劑量換算灌胃給予相應(yīng)藥物，給藥前12 h禁食，但全程不限飲水。將Rog和Beb分別用0.5%的羧甲基纖維素鈉（CMCNa）溶液制成混懸液后進(jìn)行灌胃。給藥后分別于0.17、0.33、0.75、1.5、2.0、2.5、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0 h隨機(jī)處死5只小鼠抽取靜脈血，合并同一時間點(diǎn)血樣，置于肝素化的抗凝試管中，3 000 r·min－1離心5 min，分取血漿，置于－20 ℃冰箱中保存。

2.10 血藥濃度的測定與藥動學(xué)參數(shù)計算

用所建立的HPLC-FLU法測定“2.9”項下采得血漿中Rog的濃度。另外，用空白血漿制備濃度分別為75、250、1 500 ng·mL－1的含藥血漿，作為質(zhì)控（QC）樣品，按“2.5”項下操作，每種濃度重復(fù)6次，記錄色譜，采用3p97軟件進(jìn)行擬合。結(jié)果表明，Rog在小鼠體內(nèi)過程符合一級吸收的一室模型（權(quán)重系數(shù)為1），藥動學(xué)參數(shù)結(jié)果見表2。

3 討論

目前關(guān)于Rog定量分析的方法有HPLC-紫外檢測法及高效毛細(xì)管電泳法[7]、液質(zhì)聯(lián)用法[8]等。由于Rog的血藥濃度低，利用紫外檢測器時，其靈敏度達(dá)不到分析的要求；高效毛細(xì)管電泳法盡管具有極高的分離效能，但方法的精密度較差，制約了其在生物分析中的廣泛使用。

Wang等[8]采用去蛋白方法處理血樣，但這種方法不能使藥物有效地富集，因此極大地降低了分析的靈敏度?？紤]到Rog的血藥濃度低，筆者前期分別嘗試了乙醚、二氯甲烷和乙酸乙酯等有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙醚的提取效率低（小于70%），而后2種溶劑對Rog均有很高的絕對回收率。但由于單獨(dú)采用二氯甲烷提取時，有機(jī)相位于下層，使得轉(zhuǎn)移揮干的操作不便；而選用乙酸乙酯提取時，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)對藥物出峰存在著一定的干擾，遂嘗試用乙醚-二氯甲烷混合溶劑提取，可有效地避免內(nèi)源性物質(zhì)的干擾。

本研究結(jié)果顯示，聯(lián)用Beb時，Rog的cmax和AUC0～24h均顯著升高（P＜0.05），提示Beb在小鼠體內(nèi)可增強(qiáng)Rog的吸收，增加其生物利用度。這種效應(yīng)是否會增加Rog所致的心血管風(fēng)險還有待進(jìn)一步的研究。

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