劉秀菊，張志清，楊秀嶺，杜杰，郭利（.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，石家莊050000；.河北邢臺(tái)市人民醫(yī)院，河北邢臺(tái) 05406）

奧拉西坦（Oxiracetam）化學(xué)名為4-羥基-2-酮-1-吡咯酰胺，是一種環(huán)γ-氨基丁酸（GABA）類(lèi)促智藥，可促進(jìn)磷酰膽堿和磷酰乙醇胺的合成，提高大腦對(duì)氧和葡萄糖的利用及三磷酸腺苷/二磷酸腺苷的比值（ATP/ADP），使大腦中蛋白質(zhì)和核酸的合成增加；還能作用于谷氨酸鹽促代謝受體，防止谷氨酸所致的神經(jīng)毒性[1，2]。研究[3]顯示，奧拉西坦可改善記憶與智能障礙患者的記憶和學(xué)習(xí)功能。已報(bào)道的奧拉西坦血藥濃度測(cè)定方法，流動(dòng)相制備復(fù)雜，血漿樣品處理操作煩瑣、成本高[4～8]。本研究擬建立大鼠血漿中奧拉西坦?jié)舛鹊母咝б合嗌V檢測(cè)方法，為奧拉西坦大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究提供方法學(xué)參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高效液相色譜系統(tǒng)，包括515泵、486紫外檢測(cè)器、Empower Application操作平臺(tái)（美國(guó)Waters公司）；GL-20G-Ⅱ冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)）；XW-80A渦旋混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠(chǎng)）；低溫冰箱（日本三洋公司）。

1.2 試藥

奧拉西坦對(duì)照品（石藥集團(tuán)中諾藥業(yè)有限公司，批號(hào):128101207，純度:99.60%）；奧拉西坦注射液（廣東世信藥業(yè)有限公司，批號(hào):1012010，規(guī)格:1 g∶5 mL）；乙腈為色譜純。

1.3 動(dòng)物

健康SD大鼠，清潔級(jí)，♂，體重（300±10）g，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)為SCXK（冀）2008-1-003。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Symmetry shiedTMRP18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相:乙腈-水（3.2∶96.8，V/V），流速:0.8 mL·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng):210 nm ；柱溫:40 ℃；進(jìn)樣量:20 μL。

2.2 血漿樣品處理

取冷凍血漿樣品室溫自然解凍，5 000 r·min－1離心5 min，取上清液200 μL置于帶塞離心管中，加乙腈300 μL沉淀蛋白，渦旋振蕩1 min，10 000 r·min－1離心5 min，取上清液20 μL進(jìn)樣分析。

2.3 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

奧拉西坦對(duì)照品溶液直接進(jìn)樣，另取空白血漿、空白血漿+奧拉西坦對(duì)照品及給藥后2 h的血漿樣品分別按“2.2”項(xiàng)下處理并測(cè)定，記錄色譜。結(jié)果表明，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，奧拉西坦峰形良好，保留時(shí)間為3.65 min，大鼠血漿中內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)奧拉西坦的測(cè)定無(wú)干擾。色譜見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

精密稱(chēng)取奧拉西坦對(duì)照品約100 mg，置于100 mL量瓶中，蒸餾水定容制備成濃度為1 000 mg·L－1的奧拉西坦貯備液。分別精密量取奧拉西坦貯備液適量，制備成濃度為1 000、600、400、200、100、50、20 mg·L－1的奧拉西坦對(duì)照品溶液。取上述溶液各100 μL，分別置于3 mL帶塞離心管中，加入空白血漿900 μL，制成濃度為100、60、40、20、10、5、2 mg·L－1的模擬血漿樣品，按“2.2”項(xiàng)下處理并測(cè)定。以?shī)W拉西坦峰面積（Y）對(duì)血漿藥物濃度（X）進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程Y＝13 044X－15 957（r＝0.999 8，n＝7），奧拉西坦檢測(cè)濃度的線(xiàn)性范圍為2～100 mg·L－1，最低檢出濃度為0.01 mg·L－1。

2.5 回收率試驗(yàn)

取空白血漿15份，分為3組，每組5份，分別制備成低、中、高（5、20、60 mg·L－1）3種濃度的奧拉西坦模擬血漿樣品，按“2.2”項(xiàng)下處理并測(cè)定，以?shī)W拉西坦峰面積與等量奧拉西坦對(duì)照品溶液直接進(jìn)樣的峰面積比，即為奧拉西坦的絕對(duì)回收率；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算藥物濃度，以測(cè)得藥物濃度與已知藥物濃度之比，計(jì)算方法回收率。結(jié)果，低、中、高濃度的模擬血漿樣品的絕對(duì)回收率分別為（91.1±5.17）%、（97.9±3.22）%、（98.4±1.99）%；方法回收率分別為（96.35±3.01）%、（101.40±3.41）%、（102.23±1.37）%。

2.6 精密度試驗(yàn)

按“2.5”項(xiàng)下方法制備低、中、高3種濃度的奧拉西坦模擬血漿樣品，分別放置1、2、3、4、5 h，按“2.2”項(xiàng)下處理并測(cè)定。同日測(cè)定5次，計(jì)算日內(nèi)RSD；另每日測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定5 d，計(jì)算日間RSD。精密度試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果（±s，n＝5）Tab 1 Results of precision tes（t±s，n＝5）

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果（±s，n＝5）Tab 1 Results of precision tes（t±s，n＝5）

RSD/%3.25 3.17 3.14質(zhì)量濃度/mg·L－1 5 20 60日內(nèi)實(shí)測(cè)值/mg·L－1 4.88±0.14 19.41±0.85 57.74±2.04 RSD/%2.86 4.38 3.54日間實(shí)測(cè)值/mg·L－1 4.88±0.16 20.35±0.65 58.82±1.85

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取空白血漿，按“2.4”項(xiàng)下方法制備成濃度為20 mg·L－1的奧拉西坦模擬血漿樣品，照“2.2”項(xiàng)下處理，處理時(shí)間分為即刻處理、－40℃低溫保存30 d后處理、反復(fù)凍融3次后處理，然后進(jìn)樣測(cè)定，考察血漿樣品低溫保存穩(wěn)定性、反復(fù)凍融穩(wěn)定性；另即刻處理后，分別放置0、1、2、3、4 h后進(jìn)樣測(cè)定，考察血漿樣品處理后放置穩(wěn)定性。結(jié)果表明，奧拉西坦血漿樣品低溫保存穩(wěn)定性、反復(fù)凍融穩(wěn)定性均良好，血漿樣品處理后放置4 h穩(wěn)定性良好。

2.8 血漿樣品的測(cè)定

取奧拉西坦注射液1支（1 g∶5 mL），置于25 mL量瓶中，蒸餾水定容，制備成濃度為40 mg·mL－1的奧拉西坦溶液（臨用現(xiàn)配）。取大鼠8只，禁食不進(jìn)水12 h后，按人臨床常用劑量換算200 mg·kg－1的劑量一次性灌胃給予奧拉西坦溶液1.5 mL，分別于給藥前和給藥后2 h眼內(nèi)眥取血0.5 mL，置于肝素鈉抗凝的帶蓋塑料離心管中，3 000 r·min－1離心5 min，取上層血漿，－40℃冰箱保存待測(cè)。冷凍血漿樣品按“2.2”項(xiàng)下處理并測(cè)定。結(jié)果，8只大鼠血漿樣品中奧拉西坦?jié)舛确謩e為38.16、20.05、38.52、27.28、30.65、41.91、56.04、32.00 mg·L－1，平均濃度為（35.58±10.83）mg·L－1。

3 討論

奧拉西坦是一種極性很強(qiáng)的小分子物質(zhì)，水溶性很強(qiáng)，而在有機(jī)溶劑中的分配系數(shù)很小，很難用有機(jī)溶劑從生物樣品中提取分離出來(lái)供高效液相色譜分析[5，6]。本實(shí)驗(yàn)采用耐水的Waters C18反相色譜柱，調(diào)整流動(dòng)相的組成，增加流動(dòng)性中極性成分的比例并降低流速，使待測(cè)物的保留時(shí)間維持在3.65 min，與血漿內(nèi)源性物質(zhì)分離完全。

本研究選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，該波長(zhǎng)下，大多數(shù)脂溶性高、極性較弱的藥物不易檢測(cè)，而對(duì)極性較大的奧拉西坦則較為適宜。進(jìn)行反相高效液相色譜分析時(shí)，最常采用甲醇作為流動(dòng)相的主要成分，但其紫外截止波長(zhǎng)為205 nm，與210 nm接近，故本實(shí)驗(yàn)采用乙腈作為流動(dòng)相[7]。

本研究結(jié)果顯示，本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏度高、重現(xiàn)性好，可用于大鼠血漿中奧拉西坦?jié)舛鹊臏y(cè)定。

[1]Hokonohara T，Sako K，Shinoda Y，et al.The effects of oxiracetam（CT-848）on local cerebral glucose utilization after focal cerebral ischemia in rats[J].Jpn J Pharmacol，1992，58（2）:127.

[2]Pugliese AM，Corradetti R，Ballerini L，et al.Effect of the nootropic drug oxiracetam on field potentials of rat hippocampal slices[J].Br J Pharmacol，1990，99（1）:189.

[3]劉治軍，胡 欣.促智藥奧拉西坦的臨床和基礎(chǔ)研究[J].中華神經(jīng)外科疾病研究雜志，2005，4（3）:286.

[4]Perucca E，Albrici A，Gatti G，et al.Pharmacokinetics of oxiracetam following intravenous and oral administration in healthy volunteers[J].Eur J Drug Me Tab Pharmacokinet，1984，9（3）:267.

[5]劉昌孝，顧以保，李全勝.奧拉西坦在大鼠和小鼠的藥代動(dòng)力學(xué)研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，1999，34（2）:85.

[6]劉治軍，李可欣，陰繼愛(ài)，等.奧拉西坦注射液在中國(guó)健康受試者體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2005，25（5）:404.

[7]焦效蘭，於東暉，鄒安慶，等.高效液相色譜法測(cè)定人血清及尿中奧拉西坦的濃度[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，1994，29（8）:570.

[8]閆小燕，胡 欣，曹?chē)?guó)穎，等.高效液相色譜法測(cè)定奧拉西坦氯化鈉注射液中主藥的含量[J].中國(guó)藥房，2006，17（8）:618.