徐樹蘭，陳其津

（1.中山大學生命科學學院，廣州，510275；2.廣州市生物防治站）

甜菜夜蛾核多角體病毒可濕性粉劑生產(chǎn)技術的研究

徐樹蘭2，陳其津1

（1.中山大學生命科學學院，廣州，510275；2.廣州市生物防治站）

報道了甜菜夜蛾核多角體病毒可濕性粉劑的生產(chǎn)關鍵技術，包括甜菜夜蛾的飼養(yǎng)，多角體病毒的增殖，可濕性粉劑的生產(chǎn)，產(chǎn)品質(zhì)量檢測等。

甜菜夜蛾核多角體病毒；可濕性粉劑；生產(chǎn)工藝流程；關鍵技術

甜菜夜蛾核多角體病毒 （Spodoptera exigua Nucleopolyhedrovirus，SeNPV）是一種能有效防治甜菜夜蛾（Spodoptera exiguaHübner）的昆蟲病原微生物。20世紀60-70年代以來，國內(nèi)外學者在病毒的分離鑒定、毒力測定、致病機理、分子生物學、病毒制劑的研究以及田間應用等方面做了許多工作[1～4]，但是有關SeNPV殺蟲劑的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的研究報道較少。1998年以來，本課題組在SeNPV殺蟲劑研制和生產(chǎn)方面做了大量的工作[5]，建立了一套完整的利用人工半合成飼料規(guī)?；曫B(yǎng)甜菜夜蛾，增殖SeNPV，并加工成SeNPV可濕性粉劑的生產(chǎn)工藝流程?，F(xiàn)介紹如下，以便為工廠化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甜菜夜蛾由廣州市中達生物工程有限公司養(yǎng)蟲車間提供。人工半合成飼料原料為黃豆粉和麥麩，由市場購得；酵母粉，安琪酵母股份有限公司生產(chǎn)；L-抗壞血酸，鄭州錦德化工有限公司生產(chǎn)；尼泊金，廣州市升月化工有限公司生產(chǎn)；山梨酸，泰州市明光食品添加劑有限公司生產(chǎn)；瓊脂，廣州海洋生物有限公司生產(chǎn)。

表1 人工半合成飼料配方

1.2 試驗方法

①甜菜夜蛾人工飼養(yǎng) a.人工半合成飼料配制。人工半合成飼料按照表1的配方進行配制。先用500 mL水調(diào)勻黃豆粉、酵母粉和麥麩，另500 mL水用于煮融瓊脂，兩者混勻后經(jīng)121℃蒸氣滅菌30 min。待壓力表降至零時，取出飼料，加入山梨酸和泥泊金，邊加邊攪拌均勻。當飼料溫度降至50℃左右，再加入其余成分。充分攪拌均勻，冷卻后置于4℃冰箱備用。如要做平面飼料，則趁熱倒入直徑13 cm，高3.5 cm的圓形塑料盒中，厚度3～4 mm。

b.甜菜夜蛾人工飼養(yǎng)技術。卵消毒及孵化：在卵孵化前1 d，放入5%（v/v）甲醛溶液中消毒15 min，用無菌水漂洗干凈，晾干，然后放在圓形塑料盒（13 cm×14 cm）中孵化，記錄孵化率。培養(yǎng)溫度為25℃，相對濕度（75±5）%，L∶D=12∶12。

幼蟲飼養(yǎng)：卵孵化完畢后，將產(chǎn)卵的紙移走，并根據(jù)蟲口密度適當添加飼料。當幼蟲飼養(yǎng)至四齡時，將幼蟲轉(zhuǎn)移至方形塑料盒（35 cm×25 cm×10 cm）中，使每盒幼蟲量為300頭左右。飼養(yǎng)溫度為25℃，相對濕度（75±5）%，L∶D=12∶12。

蛹的管理：在方形塑料盒（35 cm×25 cm× 10 cm）中，放入5 cm厚的已經(jīng)高溫消毒的沙子。沙上放一塊鐵絲網(wǎng)，并投放人工飼料，當老熟幼蟲全部入沙營造蛹室時，取走鐵絲網(wǎng)，蓋紙避光。每盒可供300～350頭幼蟲化蛹，待蛹變棕黑色后，挑選個體大，有光澤，有活力的蛹，放入交配產(chǎn)卵箱羽化。飼養(yǎng)溫度為25℃，相對濕度（75±5）%，L∶D=12∶12。

成蟲管理：在蛹羽化前1 d將50對蛹放入籠中。待蛹羽化后，在籠底放入折疊的小紙條，小紙條要覆蓋過籠子底板，籠頂貼一塊紗布。放入10%蜂蜜水5～6 mL。每日收取所產(chǎn)卵，直至全部成蟲產(chǎn)卵完畢。飼養(yǎng)溫度（27±1）℃，相對濕度75%±5%，L∶D= 14∶10。

②多角體病毒的增殖 采用群養(yǎng)的方法[5]，對5個批次的五齡初甜菜夜蛾幼蟲進行涂毒感染，感染溫度為（27±1）℃，感染濃度為1×108PIB/mL，飼養(yǎng)密度為30頭/dm2的，然后統(tǒng)計5個批次的單頭幼蟲的病毒產(chǎn)量和病毒總產(chǎn)量，考察是否能達到產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的要求。

③可濕性粉劑的生產(chǎn) SeNPV干燥：將病蟲尸體與自來水按1∶10比例混合后，倒進電動勻漿過濾機研磨過濾，經(jīng)顯微計數(shù)確定含量后，加入少許填充料攪拌均勻，放置在熱泵干燥機內(nèi)干燥，干燥后的病毒中間體要求水分含量不能超過8%。

SeNPV粉碎：將干燥后的病毒中間體放進流化床氣流粉碎機內(nèi)進行粉碎，粉碎后的病毒粉體細度要達到300目篩以上，含量約為500億PIB/g。

SeNPV WP包裝：將粉碎后每1 g含量為500億PIB的病毒粉體與填充料、助劑按配方比例配成含量為50億PIB/g的SeNPV WP。經(jīng)攪拌機充分攪拌均勻后，經(jīng)DXDS180型水平式全自動包裝機包裝，每袋凈質(zhì)量為20 g，每1 h產(chǎn)量可達2 500袋。

④可濕性粉劑的質(zhì)量檢測 按照農(nóng)藥可濕性粉劑產(chǎn)品標準[6]編寫規(guī)范中的有關方法進行檢測。多角體病毒含量的測定采用血球計數(shù)板法；病毒殺蟲活性的測定采用致死中濃度測定法；懸浮率的測定按照GB/T 14825中農(nóng)藥懸浮率測定方法中的方法1進行；潤濕時間的測定按GB/T 5451的方法進行；細度的測定按GB/T 16150中濕篩法進行；pH值的測定按GB/T 1601中pH計法進行；水分的測定按GB/T 1600中共沸蒸餾法進行。

表2 人工半合成飼料飼養(yǎng)的5個批次甜菜夜蛾生長發(fā)育情況

表3 5個批次甜菜夜蛾幼蟲病毒增殖的結果

表4 5個批次產(chǎn)品質(zhì)量控制指標的實測值

2 結果與分析

2.1 健康幼蟲的飼養(yǎng)

大規(guī)模飼養(yǎng)甜菜夜蛾生產(chǎn)SeNPV殺蟲劑時，幼蟲存活率、幼蟲歷期、老齡幼蟲體重及世代歷期是影響產(chǎn)品產(chǎn)量和成本的最重要的指標。采用本課題組研究出的人工半合成飼料配方和上述飼養(yǎng)條件對5個批次的甜菜夜蛾進行大規(guī)模飼養(yǎng)，得到的甜菜夜蛾生長發(fā)育的各項指標，見表2。

從該研究結果可以看出，甜菜夜蛾幼蟲的平均存活率為91.54%，顯著高于徐金漢等[7]報道的人工半合成飼料的飼養(yǎng)效果，與趙國營等[8]報道人工半合成飼料的效果相當，而平均幼蟲歷期和平均世代歷期則略高于趙國營等的報道。但該飼料配方組分較徐金漢和趙國營的簡單，成本低廉。因此，利用該飼料大規(guī)模飼養(yǎng)甜菜夜蛾增殖SeNPV，可達到產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)SeNPV可濕性粉劑的要求。

2.2 SeNPV的增殖

從表3可以看出，5個批次甜菜夜蛾幼蟲病毒增殖的結果差異不顯著。平均幼蟲死亡率可達83.7%，平均單頭幼蟲病毒產(chǎn)量為15.79×108PIB，平均病毒總產(chǎn)量達3 963.29×108PIB，與本課題組之前的報道相符[5]，從死亡率和病毒總產(chǎn)量來看，較適宜工廠化生產(chǎn)SeNPV殺蟲劑的需求。

2.3 可濕性粉劑的生產(chǎn)

將感染了SeNPV死亡的蟲尸通過機械勻漿過濾、熱泵干燥機干燥、氣流粉碎機粉碎、全自動包裝機包裝后即可獲得含量為50億PIB/g的SeNPV可濕性粉劑。具體指標檢測結果見表4，生產(chǎn)工藝流程見圖1。

圖1 SeNPV可濕性粉劑生產(chǎn)工藝流程

2.4 產(chǎn)品質(zhì)量檢測

隨機抽取5個批次的樣品，進行各項質(zhì)量控制指標的檢測，均符合產(chǎn)品企業(yè)標準的要求，結果見表4。

3 小結與討論

SeNPV可濕性粉劑產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中遇到的主要技術難題有兩個，一為甜菜夜蛾的人工飼養(yǎng)；二為SeNPV的增殖。要實現(xiàn)甜菜夜蛾的人工飼養(yǎng)，首先要解決甜菜夜蛾的人工飼料。有關甜菜夜蛾人工飼料的研究，前人有很多的報道[7～9]，但這些飼料配方多存在含有“葉因子”或配方組分復雜的缺陷，難以適應工廠化飼養(yǎng)甜菜夜蛾的需要。本研究采用的人工半合成飼料不含“葉因子”、原料來源廣、成本低，且飼養(yǎng)效果好，非常適合工廠化甜菜夜蛾的飼養(yǎng)。而適宜的甜菜夜蛾人工飼養(yǎng)技術是實現(xiàn)其大規(guī)模飼養(yǎng)的另一重要內(nèi)容。

目前，甜菜夜蛾在實驗室小規(guī)模飼養(yǎng)的基本程序是將初孵幼蟲單頭放入小塑料杯，或在小容器內(nèi)低密度飼養(yǎng)，幼蟲成熟后轉(zhuǎn)至鋪有沙子的容器內(nèi)化蛹，然后將蛹自沙內(nèi)取出，如此飼養(yǎng)，不僅成本高，而且相當費時，難以進行規(guī)模化飼養(yǎng)[10，11]。而試驗采用甜菜夜蛾群養(yǎng)的飼養(yǎng)方法，操作簡便，減少了工作量，較好地解決了該問題。昆蟲病毒的增殖方法主要有兩種，組織培養(yǎng)法和活體增殖法[2]，由于組織培養(yǎng)法成本高、操作繁瑣，不適合大規(guī)模、廉價生產(chǎn)感染力強的病毒。因此，活體增殖法是實現(xiàn)SeNPV大規(guī)模繁殖的主要方法。昆蟲病毒在宿主細胞內(nèi)進行增殖時，其增殖速度和數(shù)量受多種因素的影響，包括營養(yǎng)、接毒量、環(huán)境因子、蟲齡等[12]。在前期的研究中，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)不同的接種齡期和接種濃度是影響SeNPV產(chǎn)量的主要因素[5]。本研究結果也進一步說明，當進行大規(guī)模SeNPV增殖時，選擇接種濃度為1×108PIB/mL，接種齡期為五齡初甜菜夜蛾幼蟲時，獲得的病毒產(chǎn)量最高，產(chǎn)品生產(chǎn)成本最低。

本試驗通過解決以上2個技術難題，開發(fā)出了SeNPV可濕性粉劑的生產(chǎn)工藝流程，不僅為其大規(guī)模工廠化生產(chǎn)提供了可靠的的依據(jù)，還填補了國內(nèi)外在此方面的空白。

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Production Technology ofSpodoptera exiguaHübner Nucleopolyhedrovirus Wettable Powder

XU Shulan2,CHEN Qijin1
(1.College of Life Sciences,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510275;2.Biology Control Station of Guangzhou)

The article reported the key production technology ofSpodoptera exiguanucleopolyhedrovirus wettable powder (WP),including the rearing ofS.exigua,the proliferation ofS.exiguanucleopolyhedrovirus,the production ofS.exigua nucleopolyhedrovirus WP and quality testing of products.

Spodoptera exiguanucleopolyhedrovirus;Wettable powder;Production process;Key technology

=85,ebook=90

10.3865/j.issn.1001-3547.2012.14.032

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項項目（200803007），廣東省農(nóng)業(yè)領域?qū)ｍ椈痦椖浚?009A020101003），廣州市科技計劃項目（2010Z1-E281）

徐樹蘭（1981-），女，碩士，主要從事微生物殺蟲劑的研究，E-mail：xushujuan_21@163.com

陳其津，通信作者，電話：13610044229，E-mail：lsscqj@mail.sysu.edu.cn

2012-03-26