趙金明 趙 云 黃 慶 呂 敏,3 李 江 楊夏峰

1 (四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 成都 610065)

2 (中國(guó)科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所物理生物實(shí)驗(yàn)室 上海 201800)

3 (中國(guó)科學(xué)院院研究生院 北京 100049)

碳納米管(CNTs)由于其具有極高的強(qiáng)度、韌性和電子傳遞性能，獨(dú)特的生物應(yīng)用性，已引起廣泛關(guān)注[1–9]。有關(guān)CNTs的制備方法、其結(jié)構(gòu)和性能相關(guān)[5–14]的研究報(bào)道非常多，而研究 CNTs對(duì)微生物生長(zhǎng)影響的報(bào)道則較少[2–4]。Menachem等[2]對(duì)單壁碳管(SWNTs)抑制大腸桿菌(E.coli)生長(zhǎng)作了研究，結(jié)果表明，在生理鹽水條件下，SWNTs濃度僅為0.5 μg/mL時(shí)，其抑菌效率高達(dá)90%以上，而其抑菌機(jī)理為機(jī)械性損傷細(xì)胞膜，使細(xì)胞破裂損壞，胞質(zhì)外流，從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡。Simmons等[3]用純SWNTs和聚乙烯吡咯烷酮碘制成復(fù)合性抗菌材料，發(fā)現(xiàn)此材料具有良好的抗菌性能，抑菌率亦高達(dá)90%以上，其抗菌機(jī)理為碘與SWNTs協(xié)同作用。但是，上述研究的實(shí)驗(yàn)環(huán)境均為生理鹽水或磷酸緩沖液等非細(xì)菌培養(yǎng)基體系，僅諸穎等[4]驗(yàn)證了多壁碳管(MWNTs)在含有蛋白的培養(yǎng)基中被四膜蟲(chóng)吸收后并無(wú)毒性產(chǎn)生。而在培養(yǎng)基中SWNTs對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響則未見(jiàn)報(bào)道。

本文以 SWNTs為材料，以革蘭氏陽(yáng)性菌(G+)枯草芽孢桿菌(B.subtilis)為研究對(duì)象，分別在在生理鹽水及LB培養(yǎng)基兩種環(huán)境下，研究了SWNTs的抗菌性能對(duì)培養(yǎng)條件的依賴性。并通過(guò)測(cè)定生理鹽水體系中 SWNTs對(duì)枯草芽孢桿菌(B.subtilis)刺激是否產(chǎn)生氧自由基(ROS)，探討SWNTs的抗菌機(jī)理。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 試劑與儀器

SWNTs(美國(guó)阿爾法公司)，LB培養(yǎng)基(固體，液體)，0.9%生理鹽水，去離子水。

掃描電鏡(Hitachi S-2400，日立公司)、透射電鏡(joel JEM-1230，日本電子公司)、紫外光譜儀(日立 U-3010)、多功能酶標(biāo)儀(TECAN infinite，tecan公司，奧地利)。

1.2 抗菌性能測(cè)試

取濃度～109/mL枯草芽孢桿菌(B.subtilis)菌液1 mL，10000 r/min離心1 min，生理鹽水重懸，按連續(xù)稀釋法用生理鹽水將菌液稀釋100倍，得到～107/ mL菌液，備用。

實(shí)驗(yàn)組為2.87 mL生理鹽水或LB培養(yǎng)基中加入30 μL濃度為0.5 mg/mL的SWNTs溶液?；靹蚝?，加入100 μL濃度為～107/mL菌液；對(duì)照組為2.9 mL生理鹽水中加入同樣濃度的100 μL菌液。

上述體系置于試管中，棉塞封口，試管置于搖床內(nèi)，在37oC、200 r/min條件下避光培養(yǎng)1 h。每管取100 μL (對(duì)照組用連續(xù)稀釋法稀釋100倍后取100 μL)涂板(每個(gè)樣品涂三塊平板)。平板置于37oC恒溫箱中培養(yǎng)18 h，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。觀測(cè)并統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目。對(duì)照組菌落數(shù)目標(biāo)記為C0，樣品菌落數(shù)目標(biāo)記為CS，抑菌率R=[(C0–CS)/C0]×100%。

1.3 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

構(gòu)建培養(yǎng)體系：實(shí)驗(yàn)組為28.7 mL LB培養(yǎng)基加入300 μL濃度為0.5 mg/mL的SWNTs溶液，混勻后加入1000 μL濃度為～107/mL菌液；對(duì)照組為29 mL生理鹽水中加入同樣濃度的1000 μL菌液。

上述體系分別盛入150 mL錐形瓶(高溫高壓濕熱滅菌并烘干)，置于37oC、200 r/min搖床中培養(yǎng)，從0 h開(kāi)始，每隔一個(gè)小時(shí)取1 mL菌液，到第17 h終止，用紫外光譜儀測(cè)定OD600并記錄。

1.4 ROS測(cè)定

所用探針為H2DCFA，初始濃度為20 mmol/L，稀釋1000倍后備用，按以下分組并在室溫、避光條件下孵育30 min：對(duì)照組、H2O2和SWNTs三組樣品中各加入H2DCFA探針800 μL，濃度為～109/mL的菌液200 μL；空白組不加H2DCFA，加入濃度為～109/mL的菌液200 μL。

按104r/min離心1 min，用生理鹽水重懸，再離心，棄上清，之后用生理鹽水重懸從而洗去多余探針。對(duì)照組加入200 μL生理鹽水，H2O2組加入200 μL濃度為400 μmol/L的雙氧水，SWNTs組加入200 μL濃度為5 μg/mL的SWNTs生理鹽水溶液，以上與菌液充分混勻后加入到96孔板中，置于酶標(biāo)儀中，設(shè)置激發(fā)光波長(zhǎng)488 nm，吸收光波長(zhǎng)525 nm，測(cè)定30 min時(shí)的吸收值。

特別注明，由于SWNTs本身能夠氧化DCFHDA，產(chǎn)生熒光，故特設(shè)一個(gè)相同濃度的純SWNTs樣品，處理數(shù)據(jù)時(shí)，有SWNTs存在的樣品組減去同時(shí)間所測(cè)得純SWNTs樣品的熒光值。

2 結(jié)果與討論

2.1 SEM和TEM電鏡分析

純SWNTs的TEM及SEM圖像分別見(jiàn)圖1(a)和圖1(b)，LB培養(yǎng)基中SWNTs的SEM圖像見(jiàn)圖1(c)，培養(yǎng)有枯草芽孢桿菌的LB培養(yǎng)基中SWNTs的SEM圖像見(jiàn)圖1(d)。由圖1(b)和圖1(c)，在LB培養(yǎng)基存在條件下，碳管有明顯聚集并伴隨有蛋白吸附；由圖1(d)，碳管聚集的同時(shí)也富集了LB培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使周圍細(xì)菌能附著在聚集物上生長(zhǎng)。

圖1 SWNTs透射電鏡(TEM)圖及掃描電鏡(SEM)圖(a) SWNTs的TEM圖, (b) SWNTs的SEM圖, (c) 培養(yǎng)基中加入單臂碳管后培養(yǎng)大腸桿菌的SEM圖, (d) 培養(yǎng)有枯草芽孢桿菌的LB培養(yǎng)基中SWNTs的SEM圖Fig.1 TEM and SEM image of SWNTs.(a) TEM image of SWNTs, (b) SEM image of SWNTs, (c) SEM image of E.coli cultured with SWNTs in LB, (d) SEM image of B.subtilis cultured with SWNTs in LB

2.2 抑菌效果及抑菌機(jī)理探討

實(shí)驗(yàn)采用統(tǒng)計(jì)枯草芽孢桿菌菌落的方法測(cè)定SWNTs抑菌率，如圖2所示，在生理鹽水體系中，SWNTs的抑菌率達(dá)99.92%，但在培養(yǎng)基存在的條件下，SWNTs基本喪失抑菌性能。對(duì)照?qǐng)D1，可以看出在LB培養(yǎng)基中SWNTs明顯有團(tuán)聚現(xiàn)象，管壁上有蛋白附著，營(yíng)養(yǎng)化富集，導(dǎo)致SWNTs抑菌性能喪失，細(xì)菌最終濃度高于普通水平。

圖2 SWNTs在生理鹽水和LB體系中的抑菌率Fig.2 Inactivation efficiency of SWNTs in LB culture and in a saline solution.

文獻(xiàn)[2]認(rèn)為，SWNTs對(duì)大腸桿菌的殺滅機(jī)理是機(jī)械損傷細(xì)胞膜。在 SWNTs對(duì)枯草芽孢桿菌(B.subtilis)殺滅過(guò)程中，我們研究了其是否還存協(xié)同作用，即細(xì)胞膜機(jī)械破損的同時(shí)還有氧化損傷。即測(cè)定生理鹽水體系中枯草芽孢桿菌產(chǎn)生氧自由基(ROS)的量(圖3)?？莶菅挎邨U菌受SWNTs影響產(chǎn)生ROS的量遠(yuǎn)小于正常水平，結(jié)合SWNTs殺滅細(xì)菌的時(shí)間很短(<1h)，說(shuō)明在生理鹽水體系中，SWNTs對(duì)枯草芽孢桿菌(B.subtilis)的殺滅作用是一個(gè)急性機(jī)械破膜殺滅過(guò)程。

圖3 生理鹽水體系中枯草芽孢桿菌受SWNTs影響產(chǎn)生ROS的量Fig.3 ROS caused by SWNTs in a saline solution.

2.3 生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果及討論

圖4為L(zhǎng)B體系中，正常培養(yǎng)基以及有SWNTs存在的培養(yǎng)基中枯草芽孢桿菌(B.subtilis)的生長(zhǎng)曲線。顯示在SWNTs的LB培養(yǎng)基中，枯草芽孢桿菌(B.subtilis)終濃度高于對(duì)照組，其中15 h時(shí)平均濃度為5.7×109/mL，而對(duì)照組15 h時(shí)細(xì)菌平均濃度為5.3×109/mL，說(shuō)明在LB培養(yǎng)基中，SWNTs會(huì)促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)，作為一種細(xì)菌生長(zhǎng)促進(jìn)因子，使細(xì)菌終濃度高于正常水平。

圖4 LB體系中枯草芽孢桿菌(B.subtilis)生長(zhǎng)曲線Fig.4 Growth curve of B.subtilis in LB culture.

3 結(jié)語(yǔ)

(1) 生理鹽水條件下，SWNTs具有極佳的抗菌、殺菌性能。

(2) 生理鹽水條件下，SWNTs對(duì)細(xì)菌的殺滅作用是急性機(jī)械損傷細(xì)胞膜，同時(shí)，無(wú)氧化損傷作用或氧化損傷作用極小。

(3) 在LB培養(yǎng)基中，SWNTs可作為細(xì)菌生長(zhǎng)的促進(jìn)因子，促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)，使細(xì)菌菌液終濃度高于正常水平。

(4) SWNTs的抑菌性具有條件依賴性，在生理鹽水及在細(xì)菌培養(yǎng)基中，其抑菌性能表現(xiàn)迥異。

1 Ijima S. Helical microtubules of graphitic carbon[J]. Nature Sci, 1991, 354(6348): 56–58

2 Menachem Elimelech, Kang S, Pinault M, et al, Singlewalled carbon nanotubes exhibit strong antimicrobial activity[J]. Langmuir Sci, 2007, 23(17): 8670–8673

3 Simmons T J, Lee S H, Park T J, et al. Antiseptic single wall carbon nanotube bandages[J]. Carbon Sci, 2009, 47(6): 1561–1564

4 Zhu Y, Ran T C, Li Y G, et al. Dependence of the cytotoxicity of multi-walled carbon nanotubes on the culture medium[J]. Nanotechnology Sci, 2006, 17(18): 4668–4674

5 Balasubramanian K, Burghard M. Chemically functionalized carbon nanotubes[J]. Small, 2005, 1(2): 180–192

6 Chen R J, Bangsaruntip S, Drouvalakis K A, et al. Noncovalent functionalization of carbon nanotubes for highly specific electronic biosensors[J]. Acad Sci U S A, 2003, 100(9): 4984–4989

7 Kam N W S, O’Connell M, Wisdom J A, et al. Carbon nanotubes as multifunctional biological transporters and near-infrared agents for selective cancer cell destruction[J]. Natl Acad Sci U S A, 2005, 102(33): 11600–11605

8 Liu Z, Cai W, He L, et al. In vivo biodistribution and highly efficient tumour targeting of carbon nanotubes in mice[J]. Nanotechnol Sci, 2007, 2(1): 47–51

9 Narayan R J, Berry C J, Brigmon R L, et al. Structural and biological properties of carbon nanotube composite films[J]. Mater Sci Eng, B 2005, 123(2): 123–129

10 Worle-Knirsch J M, Pulskamp K, Krug H F, et al. Oops they did it again! Carbon nanotubes hoax scientists in viability assays[J]. Nano Lett, 2006, 6(6): 1261–1268

11 Ding L H, Stilwell J, Zhang T T, et al. Molecular characterization of the cytotoxic mechanism of multiwall carbon nanotubes and nano-onions on human skin fibroblast[J]. Nano Lett, 2005, 5(12): 2448–2464

12 Manna S K, Sarkar S, Barr J, et al. Single-walled carbon nanotube induces oxidative stress and activates nuclear transcription factor-kappa B in human keratinocytes[J]. Nano Lett, 2005, 5(9): 1676–1684

13 Jia G, Wang H F, Yan L, et al. Cytotoxicity of carbon nanomaterials: Single-wall nanotube, multi-wall nanotube, and fullerene[J]. EnViron Sci Technol, 2005, 39(5): 1378–1383

14 Magrez A, Kasas S, Salicio V, et al. Cellular toxicity of carbon-based nanomaterials[J]. Nano Lett, 2006, 6(6): 1121–1125