劉美艷 肖圣雄劉 浩尹智偉

（1.湖南師范大學化學化工學院，湖南 長沙 410081；2.湖南省湘南稀貴金屬配合物及其應用重點實驗室，湖南 郴州 423000；3.湘南學院化學與生命科學系，湖南 郴州 423000）

黑曲霉是一類廣泛分布于土壤、空氣中的真菌，其某些種類可引起食物、谷物和果蔬及飼科與糧油的變質，有可能產生致癌性的黃曲霉毒素，還能使許多工業(yè)器材霉變［1］。由于黑曲霉的孢子具有較強的抗逆性，它們能在自然界中快速的散播和生存，而且在大量抑菌試驗中很多抑菌劑對黑曲霉的抑菌效果并不理想［2，3］。因此，研制和開發(fā)安全高效的黑曲霉殺菌劑是當前亟待解決的問題。

稀土配合物具有抗菌、消炎、抗腫瘤等作用，且多數稀土配合物的抗菌活性高于配體及稀土離子，主要是由于稀土與配體發(fā)生了協(xié)同作用，并且比許多有機合成物或過渡金屬配合物的毒性低［4］，為開發(fā)稀土配合物抗菌劑提供了理論依據。鑒于黑曲霉的危害，本試驗針對稀土、水楊酸（Hsal）與8－羥基喹啉（Hhq）的三元配合物RE（sal）2hq（RE ＝Pr、Gd）對黑曲霉生長的抑制作用進行研究，旨在為研發(fā)高效黑曲霉殺菌劑提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

藥品試劑：稀土水楊酸8－羥基喹啉三元配合物RE（sal）2hq（RE ＝Pr、Gd），由本實驗室按文獻［5］制備；

水楊酸：分析純，天津市光復精細化工研究所；

8－羥基喹啉（Hhq）：分析純，曹楊第二中學化工廠；

PrCl3·6H2O、GdCl3·6H2O：分析純，天津市北聯(lián)精細化學品開發(fā)有限公司；

二甲基亞砜（DMSO）：分析純，天津市河東區(qū)紅巖試劑廠；

瓊脂粉：生化試劑，天津市英博生化試劑有限公司；

葡萄糖：分析純，天津市永大化學試劑開發(fā)中心。

菌種：黑曲霉（Aspergillus niger）AF91004，中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）；

PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，蒸餾水1 000mL；

立式壓力蒸汽滅菌鍋：YXQ－LS－50G 型，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；

超凈工作臺：SW－CJ－2F型，上海將來實驗設備有限公司；

電子天平：AUY200型，日本島津公司；

生化培養(yǎng)箱：SPX－150型，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；

振蕩培養(yǎng)箱：2102型，上海綠宇生物科技有限公司；

移液槍：20～200μL，大龍醫(yī)療設備（上海）有限公司；

牛津杯：7.6mm×6mm×10mm，東臺市溱東鎮(zhèn)吉廣泰不銹鋼制品廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 孢子懸液的制備 將黑曲霉菌種接種在PDA 斜面培養(yǎng)基上，于37℃恒溫培養(yǎng)4～6d充分活化，再用無菌生理鹽水將新鮮菌株洗脫，制成孢子懸液A 10mL備用。

將黑曲霉預先在PDA 斜面培養(yǎng)基上活化兩代后再接種到液體培養(yǎng)基中，在37 ℃條件下培養(yǎng)，使孢子懸液濃度達106CFU／mL左右，制成孢子懸液B備用。

1.2.2 待測藥品溶液的配制 準確稱取RECl3·6H2O（RE＝Pr、Gd），配體水楊酸、8－羥基喹啉及其配合物RE（sal）2hq（RE ＝Pr、Gd），然后分別用DMSO 配制為8mmol／L的溶液各10mL，待充分溶解后利用二倍稀釋法將各物質溶液分別稀釋成4，2，1，0.5，0.25mmol／L的藥品溶液儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 藥品對黑曲霉的抑菌作用 采用杯碟法。試驗前將牛津杯和移液槍槍頭置于60 ℃干燥箱中烘干后密封滅菌。將已滅菌的固體培養(yǎng)基在無菌操作臺內倒制成平板。待其冷卻凝固后，在無菌操作條件下用移液槍吸取0.4mL 備用的孢子懸液A 至平板上，用無菌玻璃涂布棒涂布均勻，再用無菌鑷子夾取滅過菌的牛津杯置于平板上，每個平板放置3個，要求牛津杯與培養(yǎng)基之間無縫隙。待培養(yǎng)基表面的水分干燥以后，用移液槍向牛津杯中準確加入30μL 待測溶液［6］。然后置于37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。平行試驗5次，測得15組抑菌圈直徑D。

藥品抑菌能力測定：試驗設置2個對照組，對照組1平板為加孢子懸液A 不加牛津杯，對照組2平板為牛津杯內加入30μL DMSO。當對照組1平板上布滿白色菌絲時，開始測量試驗組平板上的抑菌圈直徑，以藥品濃度在8 mmol／L時所產生的抑菌圈直徑作為標準，判斷藥品的抑菌能力。

參照衛(wèi)生部公布的《消毒技術規(guī)范2006》中對藥物抑菌活性強弱的規(guī)定判定結果：抑菌圈小于等于7.6mm 時無抑菌活性，抑菌圈大于7.6mm 小于10mm 時抑菌活性弱；抑菌圈大于等于10mm 小于20mm 時中等抑菌；抑菌圈大于等于20mm 強抑菌作用。即抑菌圈直徑越大抑菌活性越強［7，8］。

1.2.4 藥品最小抑菌濃度（MIC）的測定 抑菌藥物在培養(yǎng)基中以牛津杯為中心向四周擴散，在擴散過程中濃度逐漸減小，直到抑菌藥物溶液濃度與對該種抑菌藥品的最高耐受濃度相等（即藥品溶液濃度小于藥品MIC），此時抑菌圈不再增大而形成具有恒定直徑的抑菌圈。本試驗結合二倍稀釋法測定不同濃度下的藥品所形成的抑菌圈直徑，初步推測出其最小抑菌濃度［9，10］。

1.2.5 藥品最小殺菌濃度（MBC）的測定

（1）配制不同濃度的含藥安瓿瓶：用少量的DMSO 將各藥品溶解后加入PDA 液體培養(yǎng)基配制成10mmol／L的各藥品母液100mL。按照表1中所示量取藥品母液加入到含不同量的液體培養(yǎng)基中，并充分混勻，配制成濃度為8.00～0.25mmol／L的配合物RE（sal）2hq（RE ＝Pr、Gd）及配體8－羥基喹啉溶液各5mL。每濃度設3個平行試驗組。

表1 不同濃度藥劑的配制Table 1 The preparation of drugs solution with different concentration

（2）加孢子懸液及培養(yǎng)：在含不同濃度的藥劑安瓿瓶中，各加入孢子懸液B 0.1mL，充分混勻。將上述安瓿瓶置于37 ℃恒溫振蕩箱中培養(yǎng)24h。

（3）轉接培養(yǎng)檢測藥品MBC：將培養(yǎng)后的各安瓿瓶培養(yǎng)物0.1mL接至新的PDA 平板培養(yǎng)基上，37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h 后，以每皿菌落數小于5 的最低藥物濃度為MBC［11，12］。每個試驗重復3次。

1.2.6 數據采集及統(tǒng)計分析方法 用游標卡尺從不同水平方向測量抑菌圈直徑3 次，求得其平均值作為抑菌圈直徑D，得15組數據D。

采用SPSS 11.5 統(tǒng)計軟件對數據進行統(tǒng)計學處理，采用T 檢驗法淘汰15組數據中95% 置信區(qū)間以外的數據，以置信區(qū)間內保留值的平均值作為藥物所產生的抑菌圈直徑D。

2 結果與分析

2.1 藥品對黑曲霉的抑制作用

試驗對照組1在培養(yǎng)15h后長滿白色菌絲，此時測得各藥品濃度在8mmol／L時所形成的抑菌圈直徑D 見表2。

根據標準判斷，由表2可知，配體8－羥基喹啉（Hhq）、配合物RE（sal）2hq（RE ＝Pr、Gd）產生的抑菌圈直徑都大于20mm，具有強抑菌作用，且配合物的抑菌效果強于配體Hhq。RECl3·6H2O（RE ＝Pr、Gd）溶于DMSO 后電離出稀土（RE ＝Pr、Gd）離子和氯離子，結果表明兩種離子都不存在抑菌效果。當無抑菌活性的稀土（RE ＝Pr、Gd）離子與配體形成配合物后抑菌效果明顯增強，說明稀土離子與配體之間存在協(xié)同作用。

表2 藥品的抑菌圈直徑Table 2 Antibacterial circle diameter（abbreviation：ACD）of experimental drugs

2.2 藥品的最小抑菌濃度

培養(yǎng)15h后測得不同濃度藥品所產生的抑菌圈直徑D見表3。

由表3和圖1可知，在不同濃度下配合物的抑菌能力都明顯強于其配體。配合物Pr（sal）2hq、Gd（sal）2hq的MIC 分別位于0.50～0.25，1.00～0.50 mmol／L，配體8－羥基喹啉的MIC位于0.50～0.25mmol／L。

表3 藥品的最小抑菌濃度Table 3 The minimum inhibiting concentration of drugs

圖1 兩種三元配合物及8－羥基喹啉的濃度與抑菌圈直徑關系Figure 1 ACD of RE（sal）2hq（RE ＝Pr，Gd）and 8－h(huán)ydr oxylquinoline with different concentration

2.3 藥品的最小殺菌濃度

轉接培養(yǎng)24h后測得各藥品的MBC，結果見表4。

配合物Gd（sal）2hq的MBC 測定部分試驗結果見圖2，藥品濃度為3 mmol／L 時所長菌落數小于5。因此，Gd（sal）2hq的MBC為3mmol／L。

表4 藥品的最小殺菌濃度Table 4 The minimum bactericidal concentration of drugs

圖2 轉接后培養(yǎng)的黑曲霉生長情況Figure 2 The situation of Aspergillus nigerafter the transfer

2.4 配合物的持久穩(wěn)定性

試驗中對照組1，在培養(yǎng)15h后長滿白色菌絲，隨即開始第一次測量抑菌圈直徑D。通過每間隔2h再次測量抑菌圈直徑來探究藥品抑菌能力的持久性。培養(yǎng)24h后，對照組1平板布滿黑色孢子，抑菌圈直徑基本趨于恒定。繼續(xù)檢測發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)48，72，96h后抑菌圈直徑均無明顯變化。結果見表5。

由表5可知，配合物RE（sal）2hq（RE ＝Pr、Gd）抑菌圈直徑隨時間的變化趨勢較小，而配體8－羥基喹啉抑菌圈直徑則發(fā)生了很大的變化，由最初的強抑菌活性轉變?yōu)槿跻志钚浴?/p>

表5 抑菌圈隨時間變化情況Table 5 The changing of ACD with different incubation time ／mm

以培養(yǎng)時間為橫坐標，以其相應的抑菌圈直徑為縱坐標，得到抑菌圈直徑隨時間變化關系，見圖3和圖4。

由圖3和圖4可知，配體的抑菌能力不斷降低，而配合物抑菌效果好且具有抑菌持久穩(wěn)定性。其原因可能是稀土離子與其配體以配位鍵相結合形成穩(wěn)定的化合物，而導致其在抑菌過程中產生緩慢釋放效應，從而產生比其配體更加穩(wěn)定持久的抑菌效果。

圖3 藥品濃度為8mmol／L時抑菌圈隨時間變化情況Figure 3 The changing of ACD with different time，when the concentration of drugs are 8mmol／L

圖4 藥品濃度為4mmol／L時抑菌圈隨時間變化情況Figure 4 The changing of ACD with different time，when the concentration of drugs are 4mmol／L

3 結論

（1）本試驗以水楊酸（Hsal）、8－羥基喹啉（Hhq）及其稀土三元配合物等為材料，采用杯碟法研究對黑曲霉的抑菌作用、及抑菌持久穩(wěn)定性。結果表明：水楊酸沒有抑菌作用，8－羥基喹啉抑菌作用較強，但抑菌效果隨時間的推移明顯減弱。抑菌作用不明顯的稀土（RE ＝Pr、Gd）離子與配體形成配合物后，其抑菌效果明顯增強且具有持久穩(wěn)定性。配合物Pr（sal）2hq、Gd（sal）2hq和配體8－羥基喹啉的最小抑菌濃度分別為0.50～0.25，1.00～0.50，0.50～0.25mmol／L；最小殺菌濃度分別為2，3，5mmol／L。此研究成果期望能為研制新型的黑曲霉抑菌劑和拓寬稀土資源的開發(fā)利用提供新的思路和方向。

（2）稀土離子不能進入正常的細胞內［13］，致使單獨的稀土離子抑菌效果不明顯。而稀土離子與配體形成配合物后，所帶的正電荷部分轉移到配體上，使螯合環(huán)上的電子產生離域效應，導致稀土離子極性降低，脂溶性增強，配合物能更好的穿透微生物細胞膜的類脂層［14］，配合物穿過細胞保護層后，在稀土離子與配體的協(xié)同作用下，細胞內外正常的生化級聯(lián)反應被阻斷，細胞的一系列形態(tài)結構的穩(wěn)定性失去了整體調節(jié)機制，細胞內外正常的生理代謝過程也必將受到影響，從而達到抑菌的效果。兩種稀土配合物對黑曲霉的抑菌作用強，且強于其配體，很有可能是由上述原因所致。

（3）在日常生產生活中，只有強而穩(wěn)定的抑菌劑才能徹底解決由黑曲霉帶來的食品腐敗、機械霉變和木材防腐等問題。試驗結果表明：稀土水楊酸8－羥基喹啉三元配合物的抑菌能力強，且與其配體相比具有更好的抑菌持久穩(wěn)定性，滿足抑菌劑穩(wěn)定性的要求。在藥品研發(fā)的過程中藥品的低毒性是一個很重要的標準。資料［15］表明，稀土配合物比許多有機合成藥物或過渡金屬配合物的毒性低，通過口服或外用稀土配合物未發(fā)現(xiàn)其在體內積累，符合藥品研制的標準。同時，中國稀土資源極為豐富，為合成稀土配合物提供了廉價的原材料，適合于大規(guī)模生產。

本試驗研究成果旨在為研制新型的黑曲霉抑菌劑和拓寬稀土資源的開發(fā)利用提供新的思路和方向。至于兩種稀土配合物能否作用于其它有害病菌以及其相關應用，還有待進一步探討和研究。

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