于孟誠(chéng)，李湘寧，滿忠勝

（上海理工大學(xué) 光電信息與計(jì)算機(jī)工程學(xué)院，上海 200093）

引 言

共焦顯微鏡一種是以光學(xué)系統(tǒng)的共焦成像為基礎(chǔ)，利用光掃描技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行動(dòng)態(tài)測(cè)量的裝置，具有很高的分辨力和層析能力［1］。目前，它已成為半導(dǎo)體，微電子器件，陶瓷元件的生產(chǎn)檢測(cè)和生物學(xué)，醫(yī)學(xué)研究珍斷的重要工具［2］，為開拓新學(xué)科和促進(jìn)各學(xué)科領(lǐng)域向更高層次發(fā)展起了重要作用。它利用單點(diǎn)成像，從而突破了限制傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的瑞利衍射極限，大幅度提高了成像分辨力，共焦顯微鏡有很好的層析能力，采用適當(dāng)?shù)膱D像處理技術(shù)，對(duì)樣品縱向連續(xù)層析，再將二維圖像進(jìn)行重構(gòu)，可以得到物體的三維圖像，其特點(diǎn)是可以對(duì)樣品進(jìn)行斷層掃描和成像，進(jìn)行無(wú)損傷觀察和分析細(xì)胞的三維空間結(jié)構(gòu)［3］。共焦顯微鏡的橫向掃描方式起初以單點(diǎn)掃描為主，之后發(fā)展為以nipkow盤掃描和微透鏡陣列掃描為主的多點(diǎn)并行掃描等階段［4］。2011年，官志超等人設(shè)計(jì)了基于DMD共焦顯微并行檢測(cè)系統(tǒng)，該系統(tǒng)光能利用率高，具有高分辨、非接觸、速度快和可柔性測(cè)量等優(yōu)點(diǎn)［5］。

綜上所述，實(shí)驗(yàn)開展了納米分辨遠(yuǎn)場(chǎng)光學(xué)共焦成像系統(tǒng)研究，其中控制軟件的合理設(shè)計(jì)可提高系統(tǒng)的自動(dòng)化程度，既節(jié)省時(shí)間，又能降低人工操作的出錯(cuò)概率。根據(jù)系統(tǒng)的界面控制特點(diǎn)，鑒于VC＋＋在Windows界面開發(fā)中的優(yōu)勢(shì)，采用VC＋＋設(shè)計(jì)和開發(fā)了控制系統(tǒng)的控制程序和操作子系統(tǒng)。軟件平臺(tái)設(shè)計(jì)如下［6］：

1 系統(tǒng)硬件介紹

1.1 實(shí)驗(yàn)原理

納米分辨遠(yuǎn)場(chǎng)光學(xué)共焦成像系統(tǒng)采用激光作為光源。在傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的基礎(chǔ)上采用了共軛聚焦原理和裝置。并利用計(jì)算機(jī)對(duì)所觀察的對(duì)象進(jìn)行數(shù)字圖像處理的一整套觀測(cè)、分析和輸出系統(tǒng)。

系統(tǒng)硬件主要包括激光光源、物鏡、納米移動(dòng)平臺(tái)、光電倍增管、計(jì)算機(jī)等。原理如圖1所示。共焦系統(tǒng)利用物鏡使光束聚焦形成的小光點(diǎn)對(duì)樣品逐點(diǎn)成像。該系統(tǒng)采用共軛焦點(diǎn)技術(shù)，使光源、被測(cè)物點(diǎn)、探測(cè)器處于彼此對(duì)應(yīng)的共軛位置，光源經(jīng)物鏡在樣品表面銳聚焦成衍射限制的斑點(diǎn)，其反射光再次通過物鏡或聚光鏡在空間濾波器的共焦針孔平面成像，由靠近像面位置的探測(cè)器接收光信號(hào)。出于焦面以外的光線在成像針孔前和成像針孔后聚焦，使得焦面以外的光信號(hào)被大大抑制，極大地提高了共焦顯微鏡的縱向分辨力，故共焦顯微鏡具有很好的層析能力；采用適當(dāng)?shù)膱D像處理技術(shù)，對(duì)樣品縱向連續(xù)層析，再將二維圖像進(jìn)行重構(gòu)，可以得到物體的三維圖像。共聚焦顯微鏡常見的掃描方式有三種：一是物體移動(dòng)，而聚焦在被測(cè)物上的光點(diǎn)保持不動(dòng)；二是利用反射鏡構(gòu)成的掃描系統(tǒng)；三是利用聲光偏轉(zhuǎn)器?，F(xiàn)采用物體移動(dòng)的掃描方式，將被掃描的物體放置于PI納米平臺(tái)中，通過VC＋＋編程控制納米平臺(tái)運(yùn)動(dòng)，從而帶動(dòng)被掃描物體的運(yùn)動(dòng)，再通過計(jì)算機(jī)進(jìn)行控制和操作。

1.2 納米控制平臺(tái)介紹

現(xiàn)采用的納米移動(dòng)控制平臺(tái)型號(hào)為E－517.i3，由兩部分組成：控制器和移動(dòng)平臺(tái)，如圖2所示?？刂破魍ㄟ^輸出電壓信號(hào)來控制三維運(yùn)動(dòng)平臺(tái)在XYZ三個(gè)方向上的運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)的最大幅度為200μm。其輸出有三個(gè)通道a、b、c，其中通道a控制X軸的運(yùn)動(dòng)，b控制Y軸，c控制Z軸。

圖1 共焦系統(tǒng)原理圖Fig.1 The principle scheme of confocal system

圖2 PI納米移動(dòng)控制平臺(tái)Fig.2 PI nanometer movement control stage

控制器有一個(gè)低噪聲24位D／A轉(zhuǎn)換器，可以通過三種接口：TCP／IP，USB，RS－232實(shí)現(xiàn)主機(jī)與控制器間的連接與通信。

2 系統(tǒng)軟件設(shè)計(jì)

2.1 PI控制器初始設(shè)置

PI控制器通過輸出電壓信號(hào)的變化來控制三維運(yùn)動(dòng)平臺(tái)的運(yùn)動(dòng)。實(shí)驗(yàn)通過RS232口將計(jì)算機(jī)和控制器相連。為了讓三維運(yùn)動(dòng)平臺(tái)按照要求的方式進(jìn)行掃描運(yùn)動(dòng)，實(shí)驗(yàn)前需對(duì)控制器進(jìn)行一些初始設(shè)置。設(shè)置過程的流程圖如圖3所示。要實(shí)現(xiàn)計(jì)算機(jī)與控制器間的通信，以及對(duì)控制器模式的選擇主要用到三個(gè)函數(shù)：

（1）int PI ＿ConnectRS232 （int iPortNumber，int iBaudRate）

此函數(shù)用途是建立計(jì)算機(jī)與控制器的連接。如果連接成功將返回控制器的ID值；如果連接失敗將返－1。參數(shù)iPortNumber是一個(gè)整形變量，其含義是連接到控制器上的串口的編號(hào)。參數(shù)iBaudRate是一個(gè)整形變量，其含義是所設(shè)置的控制器的波特率。

（2）BOOL PI＿ONL （long ID，int iPiezoChannels，int pdValarray，int iArraySize）

此函數(shù)的用途是設(shè)置控制器的控制模式。參數(shù)ID就是控制器的ID值，此值是函數(shù)PI＿ConnectRS232（）返回得來的。參數(shù)iPiezoChannels是一個(gè)整形變量，此變量的含義是選擇要設(shè)置的控制器的通道，控制器總共有三個(gè)通道，其中數(shù)字‘1’代表通道1，‘2’代表通道2，‘3’代表通道3。參數(shù)pdValarray是一個(gè)整形變量，用來設(shè)置通道的工作模式，‘0’代表非聯(lián)機(jī)模式，‘1’代表聯(lián)機(jī)模式。參數(shù)iArraySize也是一個(gè)整形變量，此變量用來顯示數(shù)組的大小，因?yàn)楝F(xiàn)要同時(shí)對(duì)三個(gè)通道進(jìn)行控制模式的設(shè)置，即將參數(shù)iPiezoChannels設(shè)置為一個(gè)維數(shù)為三的整形數(shù)組，所以此時(shí)此整形變量應(yīng)設(shè)置為常數(shù)3。

（3）BOOL PI＿SVO （int ID，char szAxes，BOOL pbValueArray）

此函數(shù)用來設(shè)置控制器的伺服模式。通過此函數(shù)，可設(shè)置控制器工作在開環(huán)模式或閉環(huán)模式。參數(shù)ID就是控制器的ID值，此值是函數(shù)PI＿ConnectRS232（）返回得來的。參數(shù)szAxes是一個(gè)字符類型的變量，其值由函數(shù)PI＿qSAI（）返回得來，用來存放被選定的三維納米平臺(tái)的運(yùn)動(dòng)方向的標(biāo)識(shí)符，其中‘a(chǎn)’代表X軸，‘b’代表Y軸，‘c’代表Z軸。如果返回abc，說明此納米平臺(tái)為三維運(yùn)動(dòng)平臺(tái)，能在XYZ三個(gè)方向上進(jìn)行運(yùn)動(dòng)。由于所選用納米平臺(tái)的類型為三維運(yùn)動(dòng)平臺(tái)，因此當(dāng)調(diào)用函數(shù)PI＿qSAI（）時(shí)，將返回abc。參數(shù)pbValueArray是一個(gè)布爾類型的變量，通過對(duì)此變量的設(shè)置，可以選擇控制器的伺服模式，其中true代表閉環(huán)模式，false代表開環(huán)模式。

現(xiàn)選擇采用聯(lián)機(jī)模式，在調(diào)用函數(shù)PI＿ONL（）時(shí)只需將參數(shù)pdValarray設(shè)置為“1”即可。只需調(diào)用函數(shù)PI＿SVO（），并且將參數(shù)pbValueArray設(shè)置為true即可。初始設(shè)置完成以后就可以通過計(jì)算機(jī)輸入命令，控制納米平臺(tái)的運(yùn)動(dòng)。此時(shí)的納米平臺(tái)將會(huì)在默認(rèn)的速率下運(yùn)動(dòng)，這個(gè)默認(rèn)速率會(huì)比要求的速度快或者慢。

2.2 掃描速率設(shè)置

掃描速率是指納米平臺(tái)從初始位置運(yùn)動(dòng)到目標(biāo)位置的運(yùn)動(dòng)速率，它是否合理直接影響實(shí)驗(yàn)的最終結(jié)果?，F(xiàn)必須對(duì)納米平臺(tái)的掃描速率［7］進(jìn)行設(shè)置，才能在一個(gè)合理的范圍內(nèi)找個(gè)一到最佳的點(diǎn)，將納米平臺(tái)的速率設(shè)置在這個(gè)點(diǎn)上時(shí)，隨即得到最理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。軟件設(shè)計(jì)的思路如圖4所示。

圖3 初始設(shè)置流程圖Fig.3 Init settings flow chart

由圖4可知，要想對(duì)納米平臺(tái)的掃描速率進(jìn)行設(shè)置，首先需要打開速率控制模塊，只有在速率控制模塊打開成功的前提下才能對(duì)納米平臺(tái)的運(yùn)動(dòng)速率進(jìn)行設(shè)置，同時(shí)納米平臺(tái)為三維運(yùn)動(dòng)平臺(tái)，現(xiàn)必須對(duì)三個(gè)方向的速率同時(shí)進(jìn)行設(shè)置。在此過程中主要用到兩個(gè)函數(shù)PI＿VCO（）和PI＿VEL（），下面分別介紹這兩個(gè)函數(shù)。

（1）BOOL PI＿VCO

此函數(shù)用來設(shè)置速率控制模塊“打開”或“關(guān)閉”兩種狀態(tài)，當(dāng)處于“打開”狀態(tài)時(shí)，當(dāng)前軸將會(huì)在所設(shè)置速率的狀態(tài)下運(yùn)動(dòng)，參數(shù)ID為控制器的ID號(hào)，由上文可知，ID號(hào)是由函數(shù)PI＿ConnectRS232（）返回得來的。參數(shù)szAxes是一個(gè)字符類型的變量，用來存放被選定的三維納米平臺(tái)的標(biāo)識(shí)符，其中‘a(chǎn)’代表X軸，‘b’代表Y軸，‘c’代表Z軸。參數(shù)pbValueArray是一個(gè)布爾類型的變量，通過對(duì)此變量的設(shè)置可以選擇速率控制模塊的打開或者關(guān)閉狀態(tài)。其中‘true’代表打開狀態(tài)，‘false’代表關(guān)閉狀態(tài)。

（2）BOOL PI＿VEL

此函數(shù)用來設(shè)置納米平臺(tái)的掃描速率，它可以同時(shí)對(duì)納米平臺(tái)在X、Y、Z軸三個(gè)方向上的運(yùn)動(dòng)速率同時(shí)進(jìn)行設(shè)置。參數(shù)ID代表控制器的ID號(hào)，由上文可知，此ID號(hào)是由函數(shù)PI＿ConnectRS232（）返回得來的。參數(shù)szAxes是一個(gè)字符類型的變量，是用來存放被選定的三維納米平臺(tái)運(yùn)動(dòng)方向的標(biāo)識(shí)符，其中‘a(chǎn)’代表X軸，‘b’代表Y軸，‘c’代表Z軸。參數(shù)PdValueArray是一個(gè)雙精度類型的變量，此變量是用來接收由對(duì)話框所輸入的要設(shè)置的掃描速率的大小。

通過上面對(duì)函數(shù)用途和參數(shù)的介紹，現(xiàn)只需調(diào)用函數(shù)PI＿VCO（），并且將true送給布爾類型的變量pbValueArray，同時(shí)，將由函數(shù)PI＿ConnectRS232（）返回得來的ID和由函數(shù)PI＿qSAI（）返回得來szAxes送給相應(yīng)的變量，此時(shí)速率控制模塊便可以成功打開?，F(xiàn)還需要調(diào)用函數(shù)PI＿VEL（），并且將由函數(shù)GetDlgItemText（）和函數(shù)atof（）從編輯框控件中轉(zhuǎn)化得來的浮點(diǎn)型的數(shù)值送給參數(shù)pdValueArray，這樣納米平臺(tái)的掃描速率便可以成功設(shè)定。

2.3 運(yùn)動(dòng)控制與實(shí)時(shí)顯示

初始設(shè)置和掃面速率設(shè)置成功完成以后，就可以通過指令控制納米平臺(tái)的運(yùn)動(dòng)了。首先，在對(duì)話框中加入三個(gè)編輯框控件，此編輯框控件分別用來接收納米平臺(tái)在三個(gè)軸方向上將要運(yùn)動(dòng)到的目標(biāo)位置，然后再添加一個(gè)按鈕控件，在此按鈕控件的消息響應(yīng)函數(shù)中加載納米平臺(tái)的掃描運(yùn)動(dòng)函數(shù)PI＿M(jìn)OV（），下面重點(diǎn)介紹這個(gè)函數(shù)。

BOOL PI＿M(jìn)OV （int ID，char szAxes，double pdValueArray）

此函數(shù)的作用是如果所設(shè)定的目標(biāo)位置在納米平臺(tái)所能到達(dá)的最大幅度之內(nèi)的話，將驅(qū)動(dòng)納米平臺(tái)向著所設(shè)定的目標(biāo)位置運(yùn)動(dòng)，此時(shí)函數(shù)返回‘真’，否則，將返回‘假’。參數(shù)ID為控制器的ID號(hào)，由上文可知，此ID號(hào)是由函數(shù)PI＿ConnectRS232（）返回得來的。參數(shù)szAxes是一個(gè)字符類型的變量，是用來存放被選定的三維納米平臺(tái)運(yùn)動(dòng)方向的標(biāo)識(shí)符，其中‘a(chǎn)’代表X軸，‘b’代表Y軸，‘c’代表Z軸。參數(shù)PdValueArray是一個(gè)雙精度類型的變量，此變量用來接收由對(duì)話框所輸入的納米平臺(tái)所要運(yùn)動(dòng)到的目標(biāo)位置。

BOOL PI＿qPOS （int ID，char szAxes，double pdValueArray）

此函數(shù)是用來得到納米平臺(tái)當(dāng)前時(shí)刻在XYZ三個(gè)方向上的位置坐標(biāo)，并將此位置保存在參數(shù)pdValueArray中。參數(shù)ID為控制器的ID號(hào)，由上文可知，此ID號(hào)是由函數(shù)PI＿ConnectRS232（）返回得來的。參數(shù)szAxes是一個(gè)字符類型的變量，是用來存放被選定的三維納米平臺(tái)運(yùn)動(dòng)方向的標(biāo)識(shí)符，其中‘a(chǎn)’代表X軸，‘b’代表Y軸，‘c’代表Z軸。參數(shù)pdValueArray是一個(gè)雙精度類型的變量，此變量用來接收由函數(shù)PI＿qPOS（）返回的來的納米平臺(tái)的當(dāng)前坐標(biāo)。

圖4 掃描速率設(shè)置流程圖Fig.4 Scanning rate settings flow chart

通過對(duì)函數(shù)PI＿qPOS（）的介紹可知，此函數(shù)來可以得到納米平臺(tái)的當(dāng)前坐標(biāo)，則只要每隔一個(gè)時(shí)間段就執(zhí)行一次這個(gè)函數(shù)，納米平臺(tái)的位置便可以實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)的顯示出來?？梢岳肅Wnd類中SetTimer（）這個(gè)函數(shù)，通過這個(gè)函數(shù)設(shè)置時(shí)間間隔的大小，此時(shí)間間隔默認(rèn)單位為ms，若這個(gè)函數(shù)的回調(diào)函數(shù)設(shè)置為空，將會(huì)使用系統(tǒng)默認(rèn)的onTime（）這個(gè)回調(diào)函數(shù)，在ClassWizard里，選擇CPi＿movefirstDlg類，添加WM＿TIME消息映射，就自動(dòng)生成onTime函數(shù)，然后在這個(gè)函數(shù)中加載函數(shù)PI＿qPOS（），這樣只要設(shè)置合理的時(shí)間間隔，納米平臺(tái)的當(dāng)前位置便能實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)的顯示到對(duì)話框窗口中。

2.4 掃描方式選擇

當(dāng)被觀察的物體放置在納米平臺(tái)上進(jìn)行掃描時(shí)，總是希望被掃描的物體能夠進(jìn)行有規(guī)律的掃描運(yùn)動(dòng)，只有這樣物體上被掃描的點(diǎn)與光電倍增管上接受到的光信號(hào)才有可能吻合起來，從而提高實(shí)驗(yàn)的精確度，減少實(shí)驗(yàn)誤差，進(jìn)而提高被觀測(cè)樣本的分辨力?，F(xiàn)根據(jù)納米平臺(tái)的運(yùn)動(dòng)控制，編寫了幾種波形，當(dāng)被測(cè)樣品固定于納米平臺(tái)上時(shí)，可根據(jù)實(shí)際情況選擇一種或幾種波形做掃描運(yùn)動(dòng)。

首先，添加了兩個(gè)編輯框控件，通過此編輯框控件可以限定被測(cè)物體在一個(gè)二維（XY）平面上的掃描范圍，然后分別設(shè)置在X、Y方向上的步距。現(xiàn)有掃描范圍和步距，就得到了在此二維平面上被掃描的點(diǎn)數(shù)。設(shè)置好掃描范圍和步距以后，被測(cè)的點(diǎn)數(shù)就應(yīng)單直接返回對(duì)話框窗口中，接下來就可以選擇波形從而使被測(cè)物體按照此波形做掃描運(yùn)動(dòng)。

操作控制界面整體效果如圖5、圖6所示，圖5左側(cè)主要包括初始設(shè)置、圖掃描速率設(shè)置、目標(biāo)位置。右側(cè)主要包含實(shí)時(shí)顯示、波形選擇。圖6為整個(gè)實(shí)驗(yàn)裝置實(shí)物圖。

圖5 控制子系統(tǒng)操作界面Fig.5 The operation interface of the controlling subsystem

圖6 實(shí)驗(yàn)裝置實(shí)物圖Fig.6 Picture of testing apparatus

3 結(jié) 論

文中設(shè)計(jì)了納米分辨遠(yuǎn)場(chǎng)光學(xué)共焦成像系統(tǒng)的掃描控制子系統(tǒng)，納米分辨遠(yuǎn)場(chǎng)光學(xué)共焦成像系統(tǒng)的主要組成器件為納米移動(dòng)平臺(tái)。為了實(shí)現(xiàn)成像系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)的方便快捷，降低出錯(cuò)概率，提高實(shí)驗(yàn)效率，鑒于VC＋＋軟件豐富的類庫(kù)和API函數(shù)庫(kù)、界面編制靈活等特點(diǎn)，現(xiàn)采用VC＋＋開發(fā)平臺(tái)設(shè)計(jì)了掃描控制子系統(tǒng)。該子系統(tǒng)經(jīng)測(cè)試檢驗(yàn)，運(yùn)行正常，使用方便，界面友好，有助于實(shí)現(xiàn)納米分辨遠(yuǎn)場(chǎng)光學(xué)共焦成像系統(tǒng)的自動(dòng)控制。

［1］李 楠，王黎明，楊 軍.激光共聚焦顯微鏡的原理和應(yīng)用［J］.解放軍進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào)，1996，25（9）：232－234.

［2］BRAKENHOFF G T.Three dimensional imaging in fluorescence by confocal scanning microscopy［J］.Micros，1989，153（2）：151－159.

［3］李 楠，尹 嶺，蘇振倫.激光掃描共聚焦顯微術(shù)［M］.北京：人民軍醫(yī)出版社，1997：111－114.

［4］XIAO G Q，KING G S.A real－time scanning optical microscope［J］.SPIE，1987，809：107－113.

［5］官志超，張運(yùn)波，侯文玫.基于數(shù)字微鏡的共焦顯微系統(tǒng)的光路設(shè)計(jì)［J］.光學(xué)儀器，2011，33（3）：57－61.

［6］褚福濤，黃 平.基于 VC＋＋的GPIB儀器控制庫(kù)的設(shè)計(jì)［J］.工業(yè)控制計(jì)算機(jī)，2005，18（7）：36－37.

［7］劉 軍.基于 VC＋＋的頻譜分析儀自動(dòng)測(cè)試系統(tǒng)開發(fā)［J］.計(jì)測(cè)技術(shù)，2004，31（11）：22－24.