朱海珍，雷少華，劉春艷，焦 宇，于曉妍，高益敏

（1.湖南大學(xué)生物學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410082； 2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014000）

pCold TF原核表達(dá)載體是一種插入蛋白可溶性標(biāo)簽的融合型冷休克表達(dá)載體，空載體融合表達(dá)的順序?yàn)榱劢M氨酸（His－Tag）、Trigger Factor（TF）、蛋白酶切位點(diǎn)和多克隆位點(diǎn)序列.蛋白酶切位點(diǎn)依次為HRV 3Cprotease，Thrombin和Factor Xa，用于去除融合蛋白的可溶性標(biāo)簽.TF是一種原核的核糖體結(jié)合伴侶蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量約4.8×104，它能夠促進(jìn)新生肽鏈的共翻譯折疊，與目的蛋白融合表達(dá)，提高目的蛋白的可溶性.載體上帶有冷休克表達(dá)系統(tǒng)，嚴(yán)格控制載體在低溫條件下才能表達(dá)目的蛋白，進(jìn)一步促進(jìn)了目的蛋白的可溶性表達(dá).

人CD81是一種四跨膜的非糖基化膜蛋白，由胞內(nèi)的N端和C端、4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域、胞外小環(huán)和胞外大環(huán)4部分組成，相對(duì)分子質(zhì)量約2.6×104，在B細(xì)胞、T細(xì)胞、肝細(xì)胞等多種細(xì)胞中均有表達(dá).CD81參與細(xì)胞的粘附和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，具有影響細(xì)胞增殖和分化等生物學(xué)功能［1］，是細(xì)胞表面的免疫調(diào)節(jié)分子［2］，并參與丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染宿主細(xì)胞，作為HCV的一個(gè)受體介導(dǎo)病毒顆粒進(jìn)入宿主細(xì)胞［3］，HCV包膜蛋白E2與CD81胞外大環(huán)相互結(jié)合實(shí)現(xiàn)HCV的感染［4－5］.針對(duì)CD81的靶向藥物及特異性抗體具有抑制HCV感染的潛在功能［6－7］，人膜蛋白CD81的原核表達(dá)與純化，為今后靶向藥物篩選、抗體制備及深入研究CD81與HCV之間的關(guān)系奠定了基礎(chǔ).

pET28b是一種常規(guī)的原核表達(dá)載體，含有T7啟動(dòng)子、乳糖操縱子和多克隆位點(diǎn)序列等基本功能元件，在蛋白原核表達(dá)與純化實(shí)驗(yàn)體系中應(yīng)用廣泛.在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，將人cd81基因克隆到pET28b載體中嘗試原核表達(dá)，發(fā)現(xiàn)沒(méi)有可溶性目的蛋白的表達(dá).pCold TF不僅有pET28b中的基本功能元件，還包含了冷休克表達(dá)系統(tǒng)和TF助溶蛋白，通過(guò)嚴(yán)格控制目的蛋白低溫表達(dá)，以及TF的可溶性標(biāo)記功能和分子伴侶作用，可以使一些表達(dá)困難的基因獲得更高概率的可溶性表達(dá).本課題改造pCold TF載體，在保留冷休克及融合表達(dá)系統(tǒng)的前提下，去除原載體上的His－Tag序列，一方面提高了人CD81蛋白融合表達(dá)的效率和可溶性，另一方面有利于融合蛋白中的TF助溶蛋白的去除，獲得不含助溶蛋白標(biāo)簽的全長(zhǎng)人CD81蛋白.

1 材料與方法

1.1 材 料

大腸桿菌菌株DH5α，BL21（DE3），pET28b質(zhì)粒，人脾臟cDNA為本室保存；pCold TF質(zhì)粒，DNA marker和T4連接酶購(gòu)自寶生物公司（TaKa－Ra）；PCR試劑盒購(gòu)自Roche公司；質(zhì)粒純化，DNA回收試劑盒，F(xiàn)actor Xa蛋白酶購(gòu)自QIAGEN公司；限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Promega公司；Ni－NTA鎳離子親和層析柱購(gòu)自GE公司；PVDF膜和蛋白marker購(gòu)自Bio－rad公司；anti－h(huán)is鼠源單克隆抗體購(gòu)自天根公司；羊抗鼠二抗購(gòu)自Invitrogen公司；ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)自Thermo公司.

1.2 pCold TF載體的改造

1.2.1 pCold TF載體的改造方案

方案設(shè)計(jì)的基本原則是使用PCR分別擴(kuò)增His－Tag前后的部分DNA片段，PCR產(chǎn)物兩端分別帶有限制性酶切位點(diǎn)，在His－Tag部分引入一個(gè)載體不包含的限制性酶切位點(diǎn)，分別酶切pCold TF質(zhì)粒和兩個(gè)PCR產(chǎn)物，再將這3個(gè)片段連接成新載體質(zhì)粒，實(shí)現(xiàn)以限制性酶切位點(diǎn)替換His－Tag的目的.在NCBI上獲取pCold TF載體序列，經(jīng)搜索發(fā)現(xiàn)271～288位為His－Tag序列，109～114位和699～704位分別為限制性酶切位點(diǎn)NheⅠ和BubⅠ，且NheⅠ和BubⅠ在載體中是單一的酶切位點(diǎn)，因此可用于本載體的改造.PCR擴(kuò)增109～270位的DNA片段P1和289～704位的DNA片段P2，并在P1 3′端和P2 5′端的引物中添加限制性酶切位點(diǎn)SpeⅠ.NheⅠ和BubⅠ雙酶切pCold TF載體，NheⅠ和SpeⅠ雙酶切P1，SpeⅠ和BubⅠ雙酶切P2，再將酶切后的載體、P1和P2進(jìn)行連接，獲得重組質(zhì)粒（圖1）.

圖1 pCold TF載體改造方案圖Fig.1 Schematic diagram of vetor modification of pCold TF

1.2.2 pCold TF載體的改造方法

P1 5′端（NheⅠ）引物：5′－cgcgcgctagcgctagcgcatatccagtgta－3′；P1 3′端（SpeⅠ）引物：5′－ctgcagactagtcactttgtgattcatggtg－3′；P2 5′端（SpeⅠ）引物：5′－cgcgcactagtatgcaagtttcagttgaaaccactc－3′；P2 3′端（BubⅠ）引物：5′－ctgcaggcatgccgtcaacgtca－3′；引物合成與純化由上海生工公司完成.應(yīng)用PCR試劑盒擴(kuò)增目的片段的反應(yīng)體積為50μL.循環(huán)參數(shù)為：95℃預(yù)變性2min；然后95℃30s，60℃30s，72℃40s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min.按照限制性內(nèi)切酶的使用說(shuō)明，分別雙酶切pCold TF載體、P1和P2，使用T4連接酶將酶切后的片段相連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取生長(zhǎng)在平板上的單克隆菌落，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定.

1.2.3 pL118載體的酶切鑒定及測(cè)序

按照限制性內(nèi)切酶的使用說(shuō)明，用SpeⅠ單酶切pCold TF和pL118載體，用NheⅠ，SpeⅠ和BbuⅠ三酶切pCold TF和pL118載體，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定.使用P1 5′端引物和P2 3′端引物對(duì)pL118進(jìn)行正反測(cè)序，由上海生工公司完成.

1.3 蛋白的表達(dá)與純化

1.3.1 空載體和重組質(zhì)粒蛋白的表達(dá)

以人脾臟cDNA為模板，PCR擴(kuò)增cd81基因的編碼序列，將其裝入pET28b或pL118載體中.5′端（NdeⅠ）引物：5′－cccatatgggagtggagggctgcaccaa－3′，將其克隆到pET28b載體中的3′端（BamHⅠ）引物：5′－cgggatcctcagtacacggagctgtt－3′，將其克隆到pL118載體中的3′端（PstⅠ和His－Tag）引物：5′－ctgcagctgcagtcagtgatggtgatggtgatggtacacggagctgttc cggat－3′.將需要表達(dá)蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株BL21（DE3）中，37℃搖菌過(guò)夜，次日以1∶50擴(kuò)大培養(yǎng)至OD值0.6～0.8，25℃誘導(dǎo)pET28b和pET28b－h(huán)CD81菌表達(dá)12h，16℃誘導(dǎo)pCold TF，pL118和pL118－h(huán)CD81表達(dá)24h，收集細(xì)菌沉淀，用于蛋白純化或－80℃凍存?zhèn)溆?

1.3.2 人CD81蛋白的純化

使用美國(guó)GE公司的Ni－NTA鎳離子親和層析柱純化蛋白，由于pL118－h(huán)CD81質(zhì)粒表達(dá)的融合蛋白是可溶性的，因此在非變性條件下（Binding Buffer：20mmol／L磷酸鈉，500mmol／L NaCl，5mmol／L咪唑，PH7.4）裂解細(xì)菌和純化目的蛋白.采用溶菌酶超聲破碎法裂解細(xì)菌，將裂解液上清通過(guò)Ni－NTA層析柱后，用Washing Buffer（20mmol／L磷酸鈉，500mmol／L NaCl，50mmol／L咪唑，PH7.4）洗滌，最后用Elution Buffer（20mmol／L磷酸鈉，500mmol／L NaCl，500mmol／L咪唑，PH7.4）洗脫目的蛋白.收集的Elution Buffer即為目的蛋白，具體操作參照Ni－NTA層析柱使用說(shuō)明.

1.4 Factor Xa蛋白酶切

40μL酶切反應(yīng)體系：10μg融合蛋白，1UFactor Xa蛋白酶，Reaction Buffer至40μL.酶切反應(yīng)混合液20℃孵育9h，然后混合液在Binding Buffer中透析過(guò)夜，再利用Ni－NTA層析柱獲取不含TF助溶蛋白的全長(zhǎng)人CD81蛋白，過(guò)程方法同上述人CD81蛋白的純化.

1.5 Western blot分析

細(xì)菌裂解液上清或純化的蛋白進(jìn)行SDSPAGE，隨即將電泳后的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%的脫脂牛奶室溫封閉PVDF膜1h，TBST震蕩洗滌PVDF膜3次，每次5min.加入1∶1 000稀釋的anti－h(huán)is鼠源單克隆抗體，室溫孵育1h，TBST洗滌3次，每次5min.再用HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗室溫孵育1h，TBST洗滌3次，每次5min.最后用ECL發(fā)光試劑顯色.

2 結(jié) 果

2.1 pL118載體的構(gòu)建與鑒定

以融合型冷休克原核表達(dá)載體pCold TF為模板，PCR擴(kuò)增載體109～270位的DNA片段P1和289～704位的DNA片段P2，載體中271～288位為His－Tag序列，并在P1 3′端和P2 5′端的引物中添加限制性酶切位點(diǎn)SpeⅠ（圖1），PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后分別出現(xiàn)約200bp和450bp的特異性條帶，與預(yù)期P1和P2的大小一致（圖2）.P1和P2分別雙酶切處理后，與經(jīng)過(guò)NheⅠ和BbuⅠ酶切的pCold TF載體片段連接，獲得重組質(zhì)粒.酶切鑒定結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒能被SpeⅠ單酶切，pCold TF質(zhì)粒則不能被酶切.NheⅠ，SpeⅠ和BbuⅠ三酶切重組質(zhì)粒，出現(xiàn)與P1和P2大小相同的2個(gè)DNA片段，而pCold TF質(zhì)粒只出現(xiàn)大小約650bp的DNA片段（圖3）.DNA測(cè)序證實(shí)，重組質(zhì)粒100～710位序列中His－Tag序列被限制性酶切位點(diǎn)SpeⅠ序列ACTAGT替代，其他序列保持不變，獲得與設(shè)計(jì)序列完全一致的質(zhì)粒，將原質(zhì)粒和重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），原核表達(dá)顯示改造前后質(zhì)粒的表達(dá)水平不受影響，均有54ku左右的空載蛋白表達(dá)（圖4中泳道3和泳道4）.將此新質(zhì)粒命名為pL118.

圖2 pCold TF載體中DNA片段P1和P2的PCR產(chǎn)物Fig.2 PCR product of DNA fragment P1and P2in pCold TF

圖3 pCold TF和pL118質(zhì)粒酶切鑒定電泳圖Fig.3 Gel electrophoresis of plasmids of pCold TF and pL118digested by restriction enzymes

圖4 目的蛋白原核表達(dá)與純化SDS－PAGE圖Fig.4 SDS－PAGE gel of target proteins in prokaryotic expression and purification

2.2 人cd81在pL118中融合表達(dá)與純化

pL118載體不含His－Tag序列，將cd81基因克隆到該載體時(shí)，需要通過(guò)PCR引物在基因的3′端添加His－Tag序列，以利于融合蛋白的純化.將質(zhì)粒pET28b－h(huán)CD81和pL118－h(huán)CD81分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，考馬斯亮藍(lán)染色SDS－PAGE膠上可見(jiàn)pL118－h(huán)CD81菌中CD81融合蛋白的可溶性表達(dá)，其大小約7.5×104，與理論預(yù)期值一致，而pET28b－h(huán)CD81菌則沒(méi)有表達(dá)（圖4中泳道2和泳道5）.應(yīng)用Ni－NTA層析柱對(duì)CD81融合蛋白進(jìn)行非變性蛋白純化，在7.5×104處得到特異的蛋白條帶（圖4中泳道7）.

2.3 蛋白酶切去除TF助溶蛋白

應(yīng)用pL118載體原核表達(dá)獲得的人CD81融合蛋白包含4部分，即TF助溶蛋白、蛋白酶切位點(diǎn)、CD81蛋白和His－Tag.為了去除TF助溶蛋白，使用Factor Xa蛋白酶對(duì)CD81融合蛋白進(jìn)行酶切，即可將CD81融合蛋白分成TF助溶蛋白和CD81蛋白2個(gè)部分，再將酶切后的蛋白混合液通過(guò)Ni－NTA層析柱，利用Ni－NTA層析柱對(duì)CD81蛋白3′末端His－Tag的親和性，實(shí)現(xiàn)TF助溶蛋白和CD81蛋白的分離，獲得3′端含有His－Tag的全長(zhǎng)人CD81蛋白（圖5）.

圖5 Western blot鑒定CD81融合蛋白的蛋白酶切及CD81蛋白的回收純化Fig.5 Western blot analysis of protease cleavage of CD81 fusion protein and purification of CD81protein

3 討 論

pCold TF載體擁有冷休克表達(dá)系統(tǒng)和TF助溶蛋白，一些表達(dá)困難的基因在pCold TF中有更高概率的可溶性表達(dá).但是目的基因在pCold TF中表達(dá)得到的融合蛋白含有4.8×104的TF助溶蛋白標(biāo)簽，標(biāo)簽的分子質(zhì)量偏大，對(duì)目的蛋白結(jié)構(gòu)及功能有較大的影響，而去除TF卻不方便，因?yàn)槿诤系鞍妆磉_(dá)的順序?yàn)镠is－Tag、TF助溶蛋白、蛋白酶切位點(diǎn)、目的蛋白，利用蛋白酶對(duì)融合蛋白進(jìn)行酶切后，目的蛋白將和His－Tag、TF助溶蛋白分開(kāi)成為兩個(gè)蛋白片段，目的蛋白不含His－Tag，不利于目的蛋白的再回收.本文對(duì)pCold TF載體進(jìn)行改造，使之不含His－Tag序列，將目的基因克隆到該載體時(shí)，通過(guò)在目的基因3′端引物添加His－Tag序列，其融合蛋白表達(dá)的順序?yàn)門F助溶蛋白、蛋白酶切位點(diǎn)、目的蛋白、His－Tag，其中His－Tag不僅可用于融合蛋白的純化，也可用于融合蛋白酶切后目的蛋白的純化，因?yàn)镠is－Tag仍然保留在目的蛋白上，也可作為標(biāo)簽用于Western blot中目的蛋白的檢測(cè)，以及結(jié)合在Ni－NTA等載體上，用于進(jìn)一步目的蛋白功能研究和特異性藥物篩選等.

通過(guò)對(duì)pCold TF載體序列中限制性酶切位點(diǎn)的分析，發(fā)現(xiàn)位于His－Tag序列前端的NheⅠ和后端的BubⅠ是載體中單一的酶切位點(diǎn)，且載體不含酶切位點(diǎn)SpeⅠ.通過(guò)設(shè)計(jì)特定的PCR引物，并運(yùn)用PCR、限制性酶切、連接等分子生物學(xué)方法，成功去除pCold TF載體中的His－Tag序列，并且不影響原載體的蛋白表達(dá)能力，將此新質(zhì)粒命名為pL118.pL118繼承了原載體高效蛋白可溶性表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)，并使之有利于去除融合蛋白中的TF助溶蛋白，將His－Tag保留在目的蛋白上.在應(yīng)用pL118表達(dá)融合蛋白時(shí)要特別注意的是：在目的基因3′端引物引入His－Tag序列時(shí)，將Hig－Tag序列放置在目的基因的編碼序列和終止密碼子之間，如果His－Tag序列放置在終止密碼子之后，融合蛋白的表達(dá)將提前終止而不含His－Tag.

膜蛋白具有多種多樣的細(xì)胞功能，是基礎(chǔ)研究及藥物開(kāi)發(fā)的理想靶標(biāo)，然而研究膜蛋白有一個(gè)難題，它們的過(guò)表達(dá)對(duì)宿主有毒性而限制蛋白產(chǎn)量，或產(chǎn)生包涵體增加純化難度.人CD81是一種四跨膜蛋白，將其克隆到pET28b載體中嘗試原核表達(dá)，發(fā)現(xiàn)沒(méi)有可溶性目的蛋白的表達(dá)，關(guān)于CD81原核表達(dá)的文獻(xiàn)報(bào)道也集中于CD81胞外大環(huán)可溶片段的表達(dá).CD81參與細(xì)胞的粘附和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，具有影響細(xì)胞增殖和分化等生物學(xué)功能，是細(xì)胞表面的免疫調(diào)節(jié)分子，并作為受體介導(dǎo)HCV感染宿主細(xì)胞.近期有報(bào)道稱，CD81不僅是HCV感染中的一個(gè)受體，還可影響HCV RNA的復(fù)制［8］，或通過(guò)激活細(xì)胞的Raf／MEK／ERK信號(hào)通路而影響HCV在宿主細(xì)胞中的生活周期［9］，在慢性丙型肝炎病人的血清中，可溶性的CD81蛋白水平升高，并參與病人肝纖維化的形成［10］，因此對(duì)CD81的進(jìn)一步研究具有重要的理論與實(shí)踐意義.

4 結(jié) 語(yǔ)

本文將CD81克隆到pL118載體中，實(shí)現(xiàn)了CD81融合蛋白高效可溶性表達(dá)，使用Ni－NTA親和層析柱對(duì)融合蛋白純化，再利用Factor Xa蛋白酶去除TF助溶蛋白，成功獲得含有His－Tag的全長(zhǎng)CD81蛋白.人膜蛋白CD81的表達(dá)純化證實(shí)了pL118載體使表達(dá)困難的基因獲得更高概率的可溶性表達(dá)，為CD81靶向藥物篩選、抗體制備及深入研究CD81與HCV之間的關(guān)系奠定了基礎(chǔ).pL118載體的構(gòu)建以及CD81蛋白的表達(dá)純化方法具有一定的創(chuàng)新性，為表達(dá)困難的基因?qū)崿F(xiàn)原核表達(dá)提供了一種新的思路和方法.

［1］ LEVY S，TODD S C，MAECKER H T.CD81（TAPA－1）：a molecule involved in signal transduction and cell adhesion in the immune system［J］.Annu Rev Immunol，1988，16：89－109.

［2］ LEVY S，SHOHAM T.The tetraspanin web modulates immune－signalling complexes［J］.Nat Rev Immunol，2005，5（2）：136－148.

［3］ PILERI P，UEMATSU Y，CAMPAGNOLI S，et al.Binding of hepatitis C virus to CD81［J］.Science，1988，282（5390）：938－941.

［4］ FLINT M，MAIDENS C，LOOMIS－PRICE L D，et al.Characterization of hepatitis C virus E2glycoprotein interaction with aputative cellular receptor，CD81［J］.J Virol，1999，73（8）：6235－6244.

［5］ PETRACCA R，F(xiàn)ALUGI F，GALLI G，et al.Structure－function analysis of hepatitis C virus envelope－CD81binding［J］.J Virol，2000，74（10）：4824－4830.

［6］ STAMATAKI Z，GROVE J，BALFE P，et al.Hepatitis C virus entry and neutralization［J］.Clin Liver Dis，2008，12（3）：693－712.

［7］ ASHFAQ U A，QASIM M，YOUSAF M Z，et al.Inhibition of HCV 3agenotype entry through Host CD81and HCV E2 antibodies［J］.J Transl Med，2011，9：194.

［8］ ZHANGY Y Y，ZHANG B H，LSHII K，et al.Novel function of CD81in controlling hepatitis C virus replication［J］.J Virol，2010，84（7）：3396－3407.

［9］ BRAZZOLI M，BIANCHI A，F(xiàn)ILIPPINI S，et al.CD81is a central regulator of cellular events required for hepatitis C virus infection of human hepatocytes［J］.J Virol，2008，82（17）：8316－8329.

［10］WELKER M W，REICHERT D，SUSSER S，et al.Soluble serum CD81is elevated in patients with chronic hepatitis C and correlates with alanine aminotransferase serum activity［J］.PLoS One，2012，7（2）：e30796.